Miopatie mitocondriali e stress ossidativo. Uno studio in doppio cieco e cross over con un integratore donatore di cisteina.

Testo completo

(1)6. DISCUSSIO E. L’interesse nei confronti dello stress ossidativo come possibile meccanismo di progressione nelle MM nasce dallo stretto rapporto intercorrente fra disfunzione mitocondriale e ROS (Mancuso et al 2005). In caso di disfunzione della respirazione ossidativa, gli elettroni vengono direttamente ceduti all’O2, con conseguente formazione di superossido e altre ROS. Queste ultime, a loro volta, danneggiano le membrane lipidiche mitocondriali, il mtDNA e le proteine della ETC, aggravando ulteriormente la disfunzione mitocondriale (vedi Figura 6). I nostri dati indicano che, nei pazienti affetti da MM, il GSH tende a diminuire durante lo sforzo, per poi aumentare nuovamente durante il recupero. Nei pazienti più compromessi (punteggio inferiore alla scala di qualità della vita SF-36) durante lo sforzo il GSH diminuisce maggiormente (sia in termini assoluti che relativamente al GSH basale), e questo potrebbe essere uno dei fattori legati alla fatica nelle MM. Inoltre, 15 minuti dopo il termine dell’esercizio, nei soggetti con punteggio SF-36 più elevato si ha un migliore recupero del GSH, rapportato ai valori basali; in altre parole, nei pazienti meno compromessi il GSH post-esercizio tende a tornare più rapidamente ai valori basali. L’integratore proteico utilizzato nello studio (Prother SOD) può rappresentare, per il suo elevato contenuto di cisteina, una fonte dietetica di sostegno alla sintesi endogena di GSH. I risultati del nostro studio dimostrano che tale integratore è in grado di incrementare i livelli di GSH totale nel sangue, sia in condizioni di riposo sia al picco dello sforzo e durante il recupero.. 59.

(2) La determinazione dell’attività ferro riducente è uno dei metodi sviluppati per misurare la capacità anti-ossidante totale di un dato liquido biologico (Guohua & Prior 1998; Ronald & Guohua 1999), nel caso specifico il plasma (FRAP). La FRAP è in grado di stimare il livello di attività dei meccanismi anti-ossidanti (Benzie & Strain 1996). Appare interessante la correlazione, osservata nel presente studio, dei livelli di FRAP con la qualità della vita, con la forza muscolare e con la parte “Current Function” della NMDAS. Il fatto che la FRAP non sia risultata correlata all’età del paziente o all’età d’esordio della sintomatologia sembra avvalorare la specificità. delle. correlazioni. osservate.. Nei. pazienti. clinicamente. più. compromessi, l’attività antiossidante plasmatica potrebbe essere più bassa a causa dei più elevati livelli di stress ossidativo; oppure, all’opposto, un’attività antiossidante più elevata potrebbe risultare in qualche modo protettiva nei confronti della progressione della malattia. Entrambi i meccanismi sono del tutto coerenti con la teoria del circolo vizioso fra stress ossidativo e disfunzione mitocondriale, possibile fattore di progressione delle malattie mitocondriali. Il trattamento con Prother SOD ha incrementato significativamente i livelli di FRAP; come atteso, l’aumento del GSH sembra tradursi in un incremento della capacità antiossidante totale. Gli AOPP sono il prodotto dell’ossidazione delle proteine da parte delle ROS (Witko-Sarsat et al 1996). La parte CCA, corrispondente all’esame obiettivo neurologico, ed il punteggio totale della NMDAS sono risultate essere significativamente correlate a livelli di AOPP basali (e per quanto riguarda il CCA anche agli AOPP post-esercizio). I livelli di danno ossidativo sembrano essere più. 60.

(3) elevati nei pazienti più compromessi all’esame clinico. È stata osservata una riduzione significativa degli AOPP dopo trattamento con integratore rispetto al placebo, in condizioni di riposo, al picco dello sforzo e post-esercizio. A differenza di quanto osservato per i marcatori di stress ossidativo, non è stata confermata l’attività dell’integratore nel migliorare il metabolismo aerobico mitocondriale (in termini di produzione di lattato), né l’efficacia nell’aumentare la forza muscolare o la qualità di vita. Un’ipotetica spiegazione per la mancata risposta clinica è che, per osservare cambiamenti clinici significativi in malattie croniche e lentamente progressive (come le MM), un mese di trattamento potrebbe non essere sufficiente.. 61.

(4) 7. CO CLUSIO E. I dati ottenuti in questo studio confermano l’esistenza, nei soggetti con MM, di un’alterazione dell’equilibrio tra sistemi proossidanti e antiossidanti, con prevalenza dei primi sui secondi, confermando il ruolo dello stress ossidativo nei meccanismi fisiopatologici connessi alle MM. Il nostro studio dimostra inoltre che l’integratore a base delle proteine del siero di latte, addizionato di SOD vegetale, è in grado di ridurre lo stress ossidativo in tale gruppo di patologie, aumentando i livelli di GSH totale e la capacità antiossidante del plasma (FRAP), e riducendo il livello di danno ossidativo alle macromolecole, in particolare le proteine (AOPP). Il fatto che a tali benefici molecolari e biochimici non corrisponda un equivalente beneficio clinico obiettivabile, potrebbe essere riconducibile alla brevità dello studio, anche in considerazione della cronicità e della lenta evolutività di queste malattie. Il nostro studio rafforza l’idea della centralità del circolo vizioso fra disfunzione mitocondriale e stress ossidativo nella progressione delle MM. L’interruzione di tale circolo vizioso potrebbe rappresentare un promettente bersaglio per futuri trattamenti.. 62.

(5) 8. RI GRAZIAME TI. Desidero rivolgere i miei più sentiti ringraziamenti a tutti coloro che mi hanno permesso di raggiungere questo importante traguardo. Ringrazio il Prof. Gabriele Siciliano e il Dott. Michelangelo Mancuso per la disponibilità dimostrata sempre nei miei confronti. Una parte consistente del lavoro di ricerca si è svolta nelle strutture della Medicina dello Sport, grazie alla disponibilità del Prof. Fabio Galetta, delle specializzande e del personale infermieristico. Un grazie di cuore anche alla Dott.ssa Annalisa Lo Gerfo e a tutto il gruppo del laboratorio, per il lavoro pratico e per i preziosi consigli. Ringrazio tutto il “gruppo neuromuscolare”, e in particolare la Dott.ssa Cecilia Carlesi, la Dott.ssa Giulia Ricci e la Dott.ssa Valeria Calsolaro per il loro aiuto. Ringrazio inoltre i docenti che in questi anni, all’Università come alla Scuola Sant’Anna, mi hanno insegnato che la clinica e la ricerca possono essere una cosa sola. Rivolgo infine un ringraziamento speciale a Giulia e alla mia famiglia, che mi sono stati vicini e mi hanno sempre incoraggiato.. 63.

(6) 9. ABBREVIAZIO I. ADP, adenosina difosfato adPEO, oftalmoplegia esterna progressiva a ereditarietà autosomica dominante AOPP, prodotti di ossidazione avanzata delle proteine arPEO, oftalmoplegia esterna progressiva a ereditarietà autosomica recessiva ATP, adenosina trifosfato CCA, parte Current Clinical Assesment della scala NMDAS CF, parte Current Function della scala NMDAS CoQ10, coenzima Q10 COX, citocromo c ossidasi cyt c, citocromo c DP, doppio prodotto ECG, elettrocardiogramma ETC, catena di trasporto degli elettroni FC, frequenza cardiaca FRAP, attività ferro riducente plasmatica GPX, glutatione perossidasi GSH, glutatione (l-gamma-glutamil-l-cisteinil-glicina) ridotto MELAS, encefalomiopatia mitocondriale, lattico acidosi ed episodi stroke-like MERRF, epilessia mioclonica con fibre “ragged red” MM, miopatie mitocondriali MRC, Medical Research Council (scala di valutazione della forza muscolare) MRS, risonanza magnetica spettroscopica mtD A, acido desossiribonucleico mitocondriale nD A, acido desossiribonucleico nucleare. MDAS, Newcastle Mitochondrial Disease Adult Scale PBS, tampone fosfato di Dulbecco PCr, fosfocreatina PEO, oftalmoplegia esterna progressiva Pi, fosfato inorganico pnPOmax, potenza massima teorica normale ROS, specie reattive dell’ossigeno RRF, fibre “ragged red” (rosse stracciate) S C, sistema nervoso centrale SOD, superossido dismutasi SSA, acido sulfosalicilico tR A, acidi ribonucleici transfer. 64.

(7) 10. BIBLIOGRAFIA. • Argov Z. 1998. Functional evaluation techniques in mitochondrial disorders. Eur Neurol, 39:65-71. • Apolone G, Mosconi P. 1998. The Italian SF-36 Health Survey: translation, validation and norming. J Clin Epidemiol, 51:1025-36. • Baker MA, Cerniglia GJ, Zaman A. 1990. Microtiter plate for the measurement of glutathione and glutathione disulfide in large numbers of biological samples. Anal Biochem, 190:360-5. • Barshop BA. 2004. Metabolomic approaches to mitochondrial disease: correlation of urine organic acids. Mitochondrion, 4:521-7. • Battisti C, Formichi P, Cardaioli E, et al. 2004. Cell response to oxidative stress induced apoptosis in patients with Leber’s hereditary optic neuropathy. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 75:1731-6. • Benzie IF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay. Anal Biochem, 239:70-6. • Bianchi MC, Sgandurra G, Tosetti M, et al. 2007. Brain magnetic resonance in the diagnostic evaluation of mitochondrial encephalopathies. Biosci Rep, 27:69-85. • Chen RS, Huang CC, Chu NS. 1997. Coenzyme Q10 treatment in mitochondrial encephalomyopathies. Short-term double-blind, crossover study. Eur Neurol, 37:212-8.. 65.

(8) • Chen Q, Vazquez EJ, Moghaddas S, et al. 2003. Production of reactive oxygen species by mitochondria. J Biol Chem, 278:36027-31. • Chinnery P, Majamaa K, Turnbull D, et al. 2006. Treatment for mitochondrial disorders.. Cochrane. Database. Syst. Rev,. 1:CD004426.. DOI:. 10.1002/14651858.CD004426.pub2. • Debray FG, Mitchell GA, Allard P, et al. 2007. Diagnostic accuracy of blood lactate-to-pyruvate molar ratio in the differential diagnosis of congenital lactic acidosis. Clin Chem, 53:916-21. • DeStefano N, Matthews PM, Ford B, et al. 1995. Short-term dichloracetate treatment improves indices of cerebral metabolism in patients with mitochondrial disorders. Neurology, 45:1193-8. • DiMauro S, Schon EA. 2003. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med, 348:2656-68. • DiMauro S, Tay S, Mancuso M. 2004. Mitochondrial encephalomyopathies: diagnostic approach. Ann N Y Acad Sci, 1011: 217-31. • Dringen R, Gutterer JM, Hirrlinger J. 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem, 247:4912-6. • Filosto M, Mancuso M. 2007. Mitochondrial diseases: a nosological update. Acta Neurol Scand, 115:211-21. • Filosto M, Tomelleri G, Tonin P, et al. 2007. Neuropathology of mitochondrial diseases. Biosci Rep, 27:23-30.. 66.

(9) • Franco R, Schoneveld OJ, Pappa A, et al. 2007. The central role of glutathione in the pathophysiology of human diseases. Arch Physiol Biochem, 113:234-58. • Genova ML, Pich MM, Bernacchia A, et al. 2004. The mitochondrial production of reactive oxygen species in relation to aging and pathology. Ann N Y Acad Sci, 1011: 86-100. • Guohua C, Prior RL. 1998. Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clin Chem, 44:1309-15. • Haas RH, Parikh S, Falk MJ, et al. 2007. Mitochondrial disease: a practical approach for primary care physicians. Pediatrics, 120:1326-33. •. Hall AG. 1999. The role of glutathione in the regulation of apoptosis. Eur J Clin Invest 29:238-45.. • Hanisch F, Eger K, Bork S, et al. 2006. Lactate production upon short-term non-ischemic forearm exercise in mitochondrial disorders and other myopathies. J Neurol, 253:735-40. • Hargreaves IP, Sheena Y, Land JM, et al. 2005. Glutathione deficiency in patients with mitochondrial disease: implications for pathogenesis and treatment. J Inherit Metab Dis, 28:81-8. • Klatt P, Lamas S. 2000. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress. Eur J Biochem, 267: 4928-44. • Klopstock T, Querner V, Schmidt F, et al. 2000. A placebo-controlled crossover trial of creatine in mitochondrial diseases. Neurology, 55:1748-51. • Kuhl CK, Layer G, Traber F, et al. 1994. Mitochondrial encephalomyopathy: correlation of P-31 exercise MR spectroscopy with clinical findings. Radiology, 192:223-30. • Lands LC, Grey VL, Smountas AA. 1999. Effect of supplementation with a cysteine donor on muscular performance. J Appl Physiol, 87:1381-5. • Li Y, Maher P, Schulbert D. 1997. A role for 12-lipoxygenase in nerve cell death caused by glutathione depletion. Neuron, 19:453-63.. 67.

(10) • Liet JM, Pelletier V, Robinson BH, et al. 2003. The effect of short-term dimethylglycine treatment on oxygen consumption in cytochrome oxidase deciency: a doubleblind randomized crossover clinical trial. J Pediatr, 142:626. • Mancuso M, Coppede F, Migliore L, et al. 2005. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress and neurodegeneration. J Alzheimers Dis, 10: 59-73. • Mancuso M, Coppedè F, Murri L, et al. 2007c. Mitochondrial cascade hypothesis of Alzheimer's disease: myth or reality? Antioxid Redox Signal, 9:1631-46. • Mancuso M, Filosto M, Choub A, et al. 2007a. Mitochondrial DNA-related disorders. Biosci Rep, 27:31-7. • Mancuso M, Petrozzi L, Filosto M, et al. 2007b. MERRF syndrome without ragged-red fibers: the need for molecular diagnosis. Biochem Biophys Res Commun, 354:1058-60. • McFarland R, Taylor RW, Turnbull DM. 2002. The neurology of mitochondrial DNA disease. Lancet Neurol, 1:343-51. • Medical Research Council. 1943. Aids to the investigation of peripheral nerve injury. War memorandum, 2nd Edn. London, HSMO 11-46. • Meulemans A, Gerlo E, Seneca S, et al. 2007. The aerobic forearm exercise test, a non-invasive tool to screen for mitochondrial disorders. Acta Neurol Belg, 107:78-83. • Migliore L, Molinu S, Naccarati A, et al. 2004. Evaluation of cytogenetic and DNA damage in mitochondrial disease patients: effects of coenzyme Q10 therapy. Mutagenesis, 19:43-9. • Morava E, Hogeveen M, De Vries M, et al. 2006. Normal serum alanine concentration differentiates transient neonatal lactic acidemia from an inborn error of energy metabolism. Biol Neonate, 90:207-9. • MullerW, Reimers CD, Berninger T, et al. 1990. Coenzyme Q10 in ophthalmoplegia plus - a double blind, cross over therapeutic trial. J Neurol Sci, 98S:442.. 68.

(11) • Naini A, Kaufmann P, Shanske S, et al. 2005. Hypocitrullinemia in patients with MELAS: an insight into the "MELAS paradox". J Neurol Sci, 229230:187-93. • Ricci JE, Munoz-Pinedo C, Fitzgerald P, et al. 2004. Disruption of mitochondrial function during apoptosis is mediated by caspase cleavage of the p75 subunit of complex I of the electron transport chain. Cell, 117:773-86. • Ronald L, Guohua C. 1999. In vivo total antioxidant capacity: comparison of different analytical methods. Free Radic Biol Med, 27:1173-81. • Schaefer AM, McFarland R, Blakely EL, et al. 2008. Prevalence of mitochondrial DNA disease in adults. Ann Neurol, 63:35-39. • Schaefer AM, Phoenix C, Elson JL, et al. 2006. Mitochondrial disease in adults: a scale to monitor progression and treatment. Neurology, 66:1932-4. • Schwartz M, Vissing J. 2002. Paternal inheritance of mitochondrial DNA. N Engl J Med, 347:576-80. • Siciliano G, Manca ML, Renna M, et al. 2000. Effects of aerobic training on lactate. and. catecholaminergic. exercise. responses. in. mitochondrial. myopathies. Neuromuscul Disord, 10:40-5. • Siciliano G, Renna M, Manca ML, et al. 1999. The relationship of plasma catecholamine. and. lactate. during. anaerobic. threshold. exercise. in. mitochondrial myopathies. Neuromuscul Disord, 9:411-6. • Siciliano G, Volpi L, Piazza S, et al. 2007. Functional diagnostics in mitochondrial diseases. Biosci Rep, 27:53-67. • Taivassalo T, Jensen TD, Kennaway N, et al. 2003. The spectrum of exercise tolerance in mitochondrial myopathies: a study of 40 patients. Brain, 126:413-23. • Taivassalo T, Matthews PM, De Stefano N, et al. 1996. Combined aerobic training and dichloroacetate improve exercise capacity and indices of aerobic metabolism in muscle cytochrome oxidase deficiency. Neurology, 47:529-34. • Tarnopolsky MA, Roy BD, MacDonald JR. 1997. A randomized controlled trial of creatine monohydrate in patients with mitochondrial cytopathies. Muscle Nerve; 20:1502-9.. 69.

(12) • Tarnopolsky M, Stevens L, MacDonald JR, et al. 2003. Diagnostic utility of a modified forearm ischemic exercise test and technical issues relevant to exercise testing. Muscle Nerve, 27:359-66. • Tietze F. 1969. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissue. Anal Biochem, 27:502-22. • Vives-Bauza C, Gonzalo R, Manfredi G, et al. 2006. Enhanced ROS production and antioxidant defenses in cybrids harbouring mutations in mtDNA. Neurosci Lett, 391:136-41. • Witko-Sarsat V, Friedlander M, Capeillere-Blandin C, et al. 1996. Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia. Kidney Int, 49:1304-13. • Wortmann S, Rodenburg RJ, Huizing M, et al. 2006. Association of 3methylglutaconic aciduria with sensori-neural deafness, encephalopathy, and Leigh-like syndrome (MEGDEL association) in four patients with a disorder of the oxidative phosphorylation. Mol Genet Metab, 88:47-52. • Yano S, Li L, Le TP, et al. 2003. Infantile mitochondrial DNA depletion syndrome associated with methylmalonic aciduria and 3-methylcrotonyl-CoA and propionyl-CoA carboxylase deficiencies in two unrelated patients: a new phenotype of mtDNA depletion syndrome. J Inherit Metab Dis, 26:481-8.. 70.

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