Questi test sono impiegati di routine in laboratorio ma presentano una serie di svantaggi quali la laboriosità della metodica, la scarsa sensibilità ed i tempi lunghi di analisi.

5. DISCUSSIONE

Gli anticorpi diretti contro le maggiori proteine FIV hanno un ruolo protettivo di primaria importanza; tra questi risultano particolarmente rilevanti gli anticorpi anti- Env i quali svolgono la loro attività antivirale attraverso la neutralizzazione del virus.

Questa si esplica mediante il blocco dell’adsorbimento del virione sulle cellule bersaglio a causa dell’ingombro sterico creato dal legame degli anticorpi neutralizzanti (NAb) con le glicoproteine virali presenti sulla superficie dell’envelope.

La presenza degli anticorpi neutralizzanti in sieri di gatti vaccinati o infettati contro FIV può essere valutata mediante saggi di neutralizzazione classici che prevedono l’utilizzo di isolati primari del virus e di una linea cellulare suscettibile all’infezione.

Questi test sono impiegati di routine in laboratorio ma presentano una serie di svantaggi quali la laboriosità della metodica, la scarsa sensibilità ed i tempi lunghi di analisi.

Il mio lavoro di tesi ha avuto come obbiettivo la messa a punto di test di neutralizzazione ad elevata sensibilità e rapidità. A tal fine sono stati sviluppati vettori lentivirali in grado di produrre particelle virali pseudotipizzate con l’Env di FIV (FIV- Luc) capaci di sostituire il virus wild-type nell’allestimento del saggio.

La costruzione di un vettore lentivirale si basa sul sistema split-component e prevede la suddivisione del genoma virale di FIV in tre costrutti: un costrutto packaging esprimente le proteine strutturali ed enzimatiche, un plasmide envelope codificante le glicoproteine virali di superficie ed un costrutto vettore veicolante il gene reporter Luc. Quest’ultimo costrutto è stato realizzato mediante il clonaggio di Luc nel plasmide LAW34GFP al posto della GFP (§ 4.2).

Le particelle virali FIV-Luc sono state prodotte mediante cotrasfezione del costrutto packaging, costrutto vettore LAW34Luc e plasmide codificante l’Env di FIV nella linea cellulare CrFK. In modo analogo sono state prodotte anche particelle virali VSV- G/Luc utilizzando come costrutto envelope un plasmide esprimente la proteina G del virus della stomatite vescicolare (§ 4.3).

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L’efficienza di trasfezione, indicata come espressione di luciferasi (RLU), è stata rilevata mediante luminometro. I valori di RLU riscontrati nelle cellule trasfettate con VSV-G/Luc e FIV-Luc indicano che tutti i costrutti possono essere trasfettati con buona efficienza ed esprimono attivamente il gene reporter (Fig. 4.5).

La capacità di trasduzione delle particelle virali VSV-G/Luc e FIV-Luc è stata testata sulle linee cellulari CrFK CD134

e CrFK con gli pseudotipi rilasciati nel sovranatante delle cellule trasfettate. La linea CrFK manca del recettore CD134 necessario al virus per entrare nella cellula e quindi è stata impiegata, nel saggio di trasduzione, come controllo negativo. Lo pseudovirus VSV-G/Luc è stato invece utilizzato come controllo positivo vista la presenza del recettore VSV-G in qualsiasi istotipo cellulare.

L’efficienza del saggio è stata valutata come espressione di luciferasi in RLU ed il background è stato calcolato mediante un controllo negativo costituito dalle sole cellule CrFK CD134

e CrFK (§ 4.4).

Come atteso, i risultati ottenuti dal saggio di trasduzione hanno rilevato un’elevata capacità delle particelle VSV-G/Luc di trasdurre entrambi gli istotipi cellulari mentre le particelle FIV-Luc sono in grado di trasdurre in modo efficiente solo la linea CrFK CD134

(Fig. 4.6).

Quest’ultima linea cellulare e lo pseudovirus FIV-Luc sono stati utilizzati per allestire un saggio di neutralizzazione di nuova generazione sostituendo nel test classico la linea MBM ed il virus wild-type. Per valutare l’affidabilità e la riproducibilità della nuova metodica gli stessi sieri sono stati testati in contemporanea con il saggio tradizionale e con il test di nuova generazione. In particolare, i campioni di siero sono stati prelevati al momento del challenge da 7 gatti (GC, GD, GE, GF, GG, GH e GI) sottoposti ad una vaccinazione di tipo prime-boost e da 2 animali utilizzati come controllo nella vaccinazione (GK e GM: gatti mock). Nell’allestimento dei saggi, i sieri degli animali vaccinati sono stati testati in 4 diverse diluizioni seriali (1:32, 1:64, 1:128 e 1:256).

Il titolo neutralizzante dei campioni, espresso come l’ultima diluizione che riduce l’infettività almeno del 50%, è stato calcolato mediante lettura al luminometro per il test di ultima generazione e saggio RT per la metodica tradizionale (Tab. 4.1).

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I sieri GC, GE, GH, GI e GD possiedono una discreta attività neutralizzante visto che l’ultima diluizione riscontrata è 1:256 per i primi quattro campioni ed 1:32 per GD.

Tali titoli neutralizzanti sono stati ottenuti mediante il saggio di ultima generazione e poi confermati con la metodica classica.

I campioni GF e GG, mediante il test tradizionale, hanno mostrato attività neutralizzante rispettivamente fino alla diluizione di 1:64 ed 1:32, mentre con il saggio di ultima generazione gli stessi campioni sono in grado di neutralizzare in maniera significativa fino alla diluizione di 1:128. Ciò può essere dovuto alla presenza nei due sieri di elementi aspecifici che potrebbero interferire col saggio oppure ad una maggiore facilità da parte degli NAb di bloccare l’entrata virale dello pseudovirus FIV-Luc rispetto al virus wild-type. Tuttavia nell’insieme questi risultati mostrano come i due test siano assolutamente omologhi ed intercambiabili.

Con lo scopo di valutare la specificità del nuovo test anche i sieri dei gatti mock sono stati testati alla sola diluizione di 1:32 con entrambe le metodiche. I risultati ottenuti con i campioni GK e GM risultano sovrapponibili e confermano l’affidabilità del nuovo test.

In conclusione possiamo affermare che il saggio di nuova generazione allestito per misurare, in un campione di siero, NAb diretti contro FIV è affidabile, riproducibile e permette di avere risultati accurati in tempi molto brevi (due-tre giorni rispetto ai tradizionali otto-dieci). L’impiego di particelle pseudotipizzate in sostituzione del virus wild-type risulta la grande innovazione del saggio che potrà essere esteso in futuro per rilevare NAb diretti verso altri virus molto pericolosi per l’uomo. Questo sistema evita infatti di dover produrre virus wild-type (ed infettante) con il quale eseguire il test; tale aspetto non è da sottovalutare soprattutto se pensiamo alla sicurezza del personale operatore.

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