Questa tesi sperimentale si inserisce in un progetto di ricerca finalizzato allo studio delle modificazioni dell’espressione genica nelle strutture cerebrali coinvolte nell’ apprendimento contestuale alla paura nel ratto.

riassunto

RIASSUNTO

Questa tesi sperimentale si inserisce in un progetto di ricerca finalizzato allo studio delle modificazioni dell’espressione genica nelle strutture cerebrali coinvolte nell’ apprendimento contestuale alla paura nel ratto.

Molte delle informazioni sulla memoria emozionale e sull’apprendimento associativo alla paura derivano da studi di condizionamento classico. Una particolare forma di condizionamento classico alla paura è il classical fear conditioning un paradigma comportamentale dipendente in gran parte dall’ attivazione dell’

amigdala. Il condizionamento contestuale alla paura o contextual fear

conditioning (CFC), invece, richiede sia l’ attivazione dell’ amigdala che

dell’ ippocampo, in quanto anche l’ambiente dove viene presentato lo

stimolo può indurre risposte, che vengono definite di paura, condizionata

al contesto. Animali sottoposti al CFC mostrano la tipica risposta

comportamentale alla paura, definita freezing, ogni volta che vengono

reinseriti nello stesso apparato di condizionamento (retrieval test). Tale

risposta perdura per 4 settimane dopo l’addestramento. Registrazioni

elettrofisiologiche eseguite su slices di ippocampo di ratti condizionati

hanno evidenziano modificazioni dell’eccitabilità sinaptica che perdura

per circa 7 giorni. Tali effetti duraturi nel tempo hanno suggerito

l’ipotesi che, in seguito al CFC, avvenga una sintesi differenziale di

mRNA e/o una neosintesi di proteine nel sistema nervoso dei ratti. Per

individuare i geni coinvolti in tali modificazioni abbiamo utilizzato la

tecnica dell’ ibridazione sottrattiva soppressiva (suppression subtractive

hybridisation, SSH), comparando 48 ore dopo il condizionamento, i

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trascritti isolati dalle regioni medio-temporali del cervello di ratti sottoposti a CFC a quelli isolati dai ratti di controllo, mai entrati nell’apparato di condizionamento. L’SSH permette l’isolamento di sequenze differenzialmente espresse in seguito al trattamento in esame tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA (partendo dagli mRNA poliA

estratti dai ratti trattati e dai controlli). L’efficienza dell’SSH consiste in particolar modo nella capacità di isolare anche i trascritti più rari o poco espressi non evidenziabili con altre tecniche.

Dopo aver valutato l’efficienza della sottrazione i cDNA sono stati

clonati e sottoposti a screening. Le sequenze dei cloni differenziali,

tramite sequenziamento automatico, sono state analizzate mediante

comparazione con le sequenze depositate in banche dati tramite

programmi come FASTA e BLAST. In base alla funzione fisiologica

svolta dalle proteine tradotte, i cloni sono stati divisi nelle seguenti

categorie funzionali, quali: metabolismo energetico mitocondriale,

formazione, trasporto e rilascio delle vescicole, meccanismi di

trasduzione dei segnali e turn-over proteico. In particolare, in questo

lavoro di tesi, si discutono risultati di esperimenti di analisi di

espressione genica condotte utilizzando la PCR real-time. Tale tecnica

detta anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-

PCR) permette amplificazione e quantificazione simultanee del materiale

nucleico. In particolare sono state analizzate e discusse le sequenze di

cloni che hanno mostrato un’elevata omologia con le sequenze di geni

codificanti per proteine note, quali l’ amfifisina, la caspasi 3, la p53 e la

statmina.