50
Capitolo 3
Analisi dei nitrosotioli nei fluidi biologici
3.1 Premessa
Come già ampiamente descritto nel primo capitolo, il monossido di azoto possiede molteplici funzioni in ambito fisiologico, alcune delle quali protettive e regolatrici, altre nocive. Gli S-nitrosotioli sono le molecole attraverso le quali il NO viene trasportato e conservato all’interno dell’organismo, dunque è importante riuscire a stabilirne il livello di concentrazione nel plasma sia in individui sani, sia in individui soggetti a patologie notoriamente correlate a livelli anomali nella produzione del NO (arteriosclerosi, diabete, disfunzioni cardiache, ictus),83 sia nell’ambito di terapie farmacologiche.
La determinazione degli S-nitrosotioli in matrici biologiche presenta numerose problematiche. Il problema principale è rappresentato dalla complessità della matrice organica (tessuti o plasma) che impone una fase di pretrattamento del campione (es. l’ultrafiltrazione84 per rimuovere le proteine, uso di eparina per impedire la coagulazione del sangue...). Nella matrice possono essere presenti varie specie che possono interferire con la sensibilità e l’accuratezza dell’analisi. I tioli, per esempio, presenti nel plasma in concentrazione mM, possono reagire a pH acidi (≤3) con lo ione nitrosonio e dare la formazione artefattuale di RSNO.85 Per questo motivo sono raccomadate procedure di pretrattamento del campione e di analisi che operino a pH neutro e/o utilizzino reagenti in grado di bloccare i gruppi tiolici liberi (es. La N-etilmaleimmide, NEM). La NEM è un agente alchilante dei gruppi tiolici, capace di reagire con gli stessi in circa 20 secondi a temperature ambiente.86 L’aggiunta della NEM al campione ha la funzione di impedire la formazione artefattuale di GSNO dovuta alla reazione di transnitrosilazione tra proteine (principalmente nitrosoalbumina)87 e il GSH, presente in concentrazione micromolare nel plasma.88 Infine I tioli ridotti, se non bloccati con la NEM, possono ridurre diversi metalli presenti nei campioni biologici, in particolare il Cu(II). Il Cu(I) provoca la decomposizione rapida degli RSNO. 89
Figura 3.1. La formula della N-etilenmaleimmide (NEM)
Il pretrattamento del campione, pertanto, deve: evitare la decomposizione degli RSNO; impedire la formazione artefattuale di RSNO.
Un altro problema connesso con l’analisi degli S-nitrosotioli risiede nel fatto che nella maggior parte delle metodologie proposte, tale analisi consta di una determinazione indiretta, ovvero della determinazione di RS- o di NO rilasciati previa decomposizione degli RSNO stessi o di prodotti derivati da quest’ultimo. Le procedure di decomposizione e/o derivatizzazione fanno uso di agenti chimici che a loro volta possono reagire con varie sostanze presenti nella matrice biologica.90,91,92. La scelta della procedura di preparazione del campione, del metodo usato per rompere il legame S-NO (fotolisi, HgCl2, HgCl2/V(III), KI/I2, Cys/KI/Cu(I), Cu(I)/Cys, Cu(I)/KI/I2,
CO/Cu(I)/Cys, DTT), del tipo di analita da analizzare (NO, nitriti, o tiolo), e della tecnica di rilevazione usata rappresenta, pertanto, un punto critico e può condizionare i risultati dell’analisi.92
Nel caso dei metodi basati sulla determinazione dell’ NO o dei suoi derivati occorre, infine, tener presente che l’NO è un radicale piuttosto reattivo che in soluzione, in presenza di ossigeno molecolare, viene facilmente ossidato a nitriti e nitrati. Come già detto nel capitolo precedente, può, inoltre, reagire con molte sostanze presenti nel plasma: specie radicaliche (radicali idrossilici, superossidi..), specie riducenti (acido ascorbico, cisteina, glutatione, NADPH, NADH), enzimi e proteine (quali la superossido dismutasi, emoglobina, citocromo c), vitamina B12 e diversi ioni metallici quali Fe2+, Fe3+ , Cu2+ , Ca2+ .
Le differenze nell’approccio analitico e la mancanza di un metodo di riferimento validato che garantisca misure specifiche, accurate e riproducibili forniscono
52 inevitabilmente livelli di concentrazione di nitrosotioli nel plasma diversi anche di 3 ordini di grandezza.90,52,53,93,94,54,95 Alcuni gruppi di ricerca considerano tale livello, negli individui sani, compreso tra l’1 nM ed il 62 nM,.96,97, 98 altri nel range
micromolare.45,99,100,101
Wang et al. hanno tentato di validare una tecnica di rilevazione degli RSNO102, la chemiluminescenza basata sulla reazione con tri-ioduro, ma una validazione analitica reale del metodo di rilevazione di RSNO che coinvolga il confronto di due o più metodi indipendenti non è ancora riportata in letteratura. Per concludere, recentemente sono stati pubblicati dei risultati a sfavore dell’uso del triioduro per l’analisi di specie nitrosilate o dei nitriti in miscele biologiche, suggerendo che i risultati precedenti ottenuti con questa metodologia dovrebbero essere rivalutati.103
La Tabella 3.1 riassume valori trovati in letteratura per la concentrazione di RSNO nel plasma umano.
Tabella 3-1: Concentrazione di RSNO nel plasma (fonte: D. Giustarini, A. Milzani)104
tecnica analitica Valore
trovato (nmol/l) autore Fotolisi/chemiluminescenza 7000 ±5000 Stamler J.S.45 HPLC/Griess 220± 190 Goldman R.K.105 Rame/chemiluminescenza 28 ±7 Marley R.98 HPLC/fluorimetria 20 ±50 Rossi R.106 GC-MS 156±54 Tsikas D.107
HPLC/Griess 62±24 Jourd ‘heuil
D.96
Rame/chemiluminescenza 15±6 Rassaf T.5
Le tecniche strumentali più utilizzate per la determinazione degli RSNO possono essere divise in metodi indiretti e metodi diretti.
(i) I metodi diretti per la determinazione degli RSNO comprendono.
Spettrofotometria UV a 334 nm. A causa del basso coefficiente di assorbimento molare (ε = 977 M-1, cm-1) del gruppo S-nitroso, la rivelazione mediante spettrofotometria UV dopo separazione cromatografica o elettroforesi (Capillary Zone Electrophoresis, CZE) ne limita il detection limit (LODc) a livelli micromolari.109,,111
Spettrometria di massa (ESI-MS, MALDI-MS)
Rivelatore elettrochimico (limite di rivelazione =1 µM).112
(ii) Metodi indiretti, basati sulla decomposizione degli RSNO secondo i seguenti schemi:
RSNO →RSH/RSSR + NO NO → NOx → nitriti/nitrati e sulla rivelazione dei loro metaboliti:
a) NO5, 45,-140imediante
o Chemiluminescenza
o rivelatore elettrochimico (ECD)
o risonanza di spin elettronico (EPR)
b) nitriti derivanti dall’ossidazione dell’NO141-162, mediante
• GC-MS
• metodo di Griess • fluorimetria molecolare • amperometria, polarografia • tiolo ridotto (RSH).114
La decomposizione del gruppo S-nitrosocisteinilico attualmente viene realizzata attraverso fotolisi o riduzione chimica.
Nei paragrafi seguenti sono riassunti i principi dei metodi sopra citati.
54
3.2 Metodi diretti per la determinazione degli S-nitrosotioli
3.2.1 Determinazione degli S-nitrosotioli tramite spettrofotometria UV
Gli RSNO in soluzione assorbono nella regione 330-350 nm (ε ≈ 103 mol-1 L cm-1) e tra i 550 e i 600 nm (ε ≈ 20 mol-1 L cm-1). Il primo assorbimento è dovuto alla transizione n0 π*, il secondo alla transizione nN π*. Queste assorbanze possono
essere impiegate per seguire l’andamento della decomposizione degli RSNO58 a livelli mM, ma hanno scarsa valenza analitica. L’analisi degli RSNO attraverso la spettrofotometria UV-visibile, infatti, ha il vantaggio di non richiedere alcuna derivatizzazione, ma a causa dei bassi coefficienti di estinzione molare i metodi spettrofotometrici hanno un detecion limit nel range µM e a causa della aspecificità dell’assorbimento UV/visibile risultano essere poco adatti alla determinazione degli RSNO nei fluidi biologici.
3.2.2 Determinazione degli S-nitrosotioli mediante tecniche ifenate:
HPLC o CZE con rivelatore UV/visibile o ESI-MS.
Gli S-nitrosotioli vengono frequentemente determinati attraverso l’uso della tecnica HPLC in fase inversa in quanto questa tecnica è semplice da usare, ha costi contenuti e, soprattutto, determina gli S-nitrosotioli tal quali, senza uso di derivatizzanti.
Nei campioni biologici sono, tuttavia, presenti nitrosocomposti (RSNO) ed S-nitrocomposti (RSNO2). Queste due tipologie di molecole hanno proprietà
chimico-fisiche simili e dunque tendono a coeluire nei sistemi cromatografici115.
La separazione degli S-nitrosotioli dagli S-nitrotioli è possibile utilizzando come fase mobile un tampone a pH compreso tra 2 e 4.115 Per il GSNO è sufficiente un pH di 6.116 Poiché nelle matrici organiche sono presenti tioli e nitriti, se i gruppi SH non sono opportunamente bloccati mediante alchilazione, l’eluizione a pH acidi può provocare la formazione artefattuale di RSNO in colonna. In alternativa, essendo RSNO ed RSNO2
es. con colonna Nucleosil 100-5C18 Macherey-Nagel) impiegando una fase mobile a pH
neutro.
L’HPLC ad accoppiamento anionico con tetrabutilammonioidrogeno solfato (TBAHS) nella fase eluente (tampone fosfato), separa con successo GSNO, GSNO2 ed altri
derivati tiolici anche a pH neutro. Questo metodo, accoppiato con l’ESI-MS, può fornire un potente mezzo per l’analisi degli RSNO.120
L’elettroforesi capillare permette la separazione dei composti in base al loro peso molecolare, alla carica posseduta, alla dimensione della molecola, e al pH del tampone.
L’elettroforesi capillare è una tecnica veloce, semplice, idonea alle analisi di routine, e permette le determinazione simultanea di S-nitrosotioli, tioli e rispettivi disulfuri senza uso di derivatizzanti.117 Questo fatto è particolarmente utile nello studio di alcune patologie caratterizzate da anomalie dello stato redox delle cellule, determinato proprio dai rapporti tra i livelli dei tioli e delle loro specie ossidate. Poiché le condizioni alcaline favoriscono l’ossidoriduzione degli RSNO a disolfuro ed NO, sono richieste condizioni particolarmente acide (pH 2) nelle quali, essendo i gruppi amminici protonati, gli RSNO, RSSR ed RSH sono carichi positivamente e migrano verso il catodo118.
3.2.3 Determinazione degli S-nitrosotioli mediante sensore
amperometrico.
Attraverso opportune modifiche all’elettrodo tipo-Clark permeabile al NO, è possibile effettuare una misura diretta degli RSNO per via amperometrica. Il sensore possiede una superficie polimerica contenente composti organo-selenici che decompongono cataliticamente gli S-nitrosotioli secondo le seguenti reazioni:119
56 Poiche’ l’effettivo agente riducente degli RSNO è l’anione selenolato (pKa=5,5), è necessaria la presenza iniziale di un tiolo sia come agente riducente nei confronti del diselenuro, sia come base per produrre il selenolato (la maggiora parte dei RSH ha un pKa intorno a 8,5).
La membrana dell’elettrodo contiene uno strato di idrogel composto da 3,3’-dipropionicodiselenuro, legato covalentemente ai gruppi amminici primari della polietilenimmina (PEI), come schematizzato in Figura 3.3:
Figura 3.3: struttura del polimero RSePEI
L’NO generato diffonde attraverso la membrana gas permeabile e si ossida all’anodo di platino, come mostrato in Figura 3.4:
Figura 3.4: Sensore per RSNO al catalizzatore di selenio
Questo sensore è stato utilizzato per la determinazione degli RSNO nel plasma119 a pH fisiologico (7,4), in presenza di EDTA, con un detection limit inferiore a 0,1µM. Applicato a campioni di sangue raccolti in eparina, il sensore ha fornito un valore di concentrazione di RSNO nel range sub-micromolare.
Questo tipo di sensore mostra una buona selettività nei confronti degli RSNO, ma la sua sensibilità dipende fortemente dalla concentrazione di tioli (che deve perciò essere nota e costante), dal pH e dalla presenza di ammoniaca e ioni ammonio (presenti nel plasma normalmente in concentrazione circa 30 µ M.119
3.2.4 Determinazione degli RSNO mediante spettrometria di massa
accoppiata a ionizzazione electrospray (ESI-MS).
L’analisi diretta degli S-nitrosocomposti mediante tecniche di spettrometria di massa è possibile solo mediante l’ESI-MS o mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa (LC-MS).120 Gli RSNO, infatti, sono composti non volatili e a causa della labilità termica del gruppo S-nitroso tale funzione viene persa durante l’analisi in GC-MS.
La tecnica ESI-MS in combinazione con l’HPLC, è un metodo valido per la
58 nitriti.151 Grazie all’elevata sensibilità tipica della spettrometria di massa e ai bassi limiti di rivelabilita’ (LOD nel range nM)120 questa tecnica può trovare impiego nella loro determinazione in campioni reali.
Tramite l’ESI-MS è stato possibile dimostrare che operando in condizioni acide ed in presenza di tioli, si ha la formazione artefattuale di RSNO, e che questo non accade operando a pH fisiologico (pH 7,4)151 A pH neutro, con l’ausilio di sostanze in grado di formare coppie ioniche, come l’ acido 1-ottanosulfonico o il TBHAS,si ottiene la separazione degli S-nitrosotioli dai rispettivi tioli e nitriti,153 sebbene la sensibilità dell’ ESI-MS venga ridotta.
L’ESI-MS di S-nitrosotioli e di S-nitrotioli ha permesso di discriminare e determinare la tipologia di composti che si formano per reazione di NO e dei suoi derivati, come i perossinitriti, con i tioli.120
3.3 Metodi indiretti per la determinazione degli S-nitrosotioli:
determinazione del NO
3.3.1 Premessa
La determinazione del NO rilasciato a seguito della decomposizione degli RSNO è resa difficile dall’elevata reattività del radicale stesso. Ad esempio, in soluzione acquosa esso viene rapidamente ossidato a nitriti e nitrati. I nitriti ed i nitrati possono essere selettivamente ridotti ad NO: i nitriti mediante acido acetico\ioduro; i nitrati mediante vanadio (III)\NaOH.121
Il rilascio di NO da parte degli RSNO viene tipicamente indotto in tre modi: tramite rottura del legame S-NO per via fotolitica (λ=340nm) mediante l’utilizzo di iodio/ioduro o di rame/cisteina
mediante trattamento con HgCl2.
Il metodo Cys/CuCl2 non risente della presenza di nitriti e di nitrati. L’effettivo agente
riducente è il rame rameoso prodotto grazie all’azione riducente della cisteina56: Cys- + Cu++ Cys● + Cu+
In seguito il Cu+ decompone l’RSNO secondo le reazioni:
RSNO + Cu+ RS- + Cu++ + NO Cu+++RS- Cu++ RS●
____________________________ RSNO NO+1/2 RSSR
RSNO + Cys● RS-Cys + NO
In luogo della Cys, il legame S-NO può essere rotto anche per riduzione con iodio/ioduro. Quest’ultimo metodo, però, è meno selettivo del precedente e soffre della presenza dei nitriti.
60 RSNO + I- RS- + ½ I2 + NO ½ I2 +RS- I-+ RS ● ____________________________ RSNO NO+1/2 RSSR
Grazie alla elevata selettività del mercurio nei confronti dello zolfo, il legame S-NO viene convenientemente scisso tramite sali di mercurio, come HgCl2 (metodo di Saville
e di Griess). L’utilizzo del mercurio è da preferire al rame in quanto l’O2 atmosferico
tende ad ossidare Cu+ a Cu++.
La reazione con sali di mercurio consta di due tappe:
(i) formazione del complesso:
RSNO + HgCl2 ↔ RSNOHg++ + 2 Cl--
(ii) attacco dell’acqua:
La costante di velocità stimata per questa reazione va da 1 a 5 * 103 L/mol*sec.56 La decomposizione degli S-nitrosotioli è stata testata anche con altri sali inorganici del mercurio. Tra questi, solo Hg(NO3)2 mostra una cinetica più veloce di diversi ordini di
grandezza rispetto ad HgCl2, ma il suo impiego è limitato dall’interferenza dell’anione
nitrato.
Come il mercurio, anche l’argento mostra alta affinità nei confronti dello zolfo. Tuttavia reagisce con gli S-nitrosotioli con una cinetica più lenta rispetto al mercurio (eccezion fatta che con il GSNO), e i complessi formati sono scarsamente solubili.
Altri ioni metallici, come Zn++, Ca++, Mg++, Ni++, Co++, Mn++, Cr+++, Fe+++ sono stati testati in luogo del mercurio, ma non esibiscono le sue stesse proprietà.56
3.3.2 Determinazione del NO mediante chemiluminescenza
L’utilizzo della chemiluminescenza nella determinazione dei livelli di NO nell’atmosfera è in atto già da molti anni. Il metodo si basa sull’eccitazione del NO tipicamente utilizzando ozono e successiva misura della radiazione emessa a seguito del decadimento secondo le reazioni:122
NO + O3 NO2 * + O2
NO2 * NO2 + hν
I metodi basati sulla chemiluminescenza offrono un’elevata sensibilità in quanto l’unica sorgente di radiazione elettromagnetica è rappresentata dal rilassamento dell’analita, non si ha rumore di fondo, non sono necessari filtri o monocromatori.
La chemiluminescenza è stata impiegata per la determinazione del NO in campioni di sangue usando V(III) per ridurre i nitriti ad NO, e successivamente ozono per rivelare l’NO123,124.
Nella fotochemiluminescenza la determinazione degli RSNO viene fatta sottraendo il contributo dato dall’NO libero a quello che si misura dopo aver irradiato la molecola con radiazione a 340 nm:
2 RSNO + hν RSSR + 2 NO
Il LOD per GSNO, CysNO, Albumina-SNO è stato stimato intorno a 10 nM.123
Il problema principale dell’impiego della fotochemiluminescenza è la formazione di artefatti. Infatti i nitrati (prodotti dall’ idrolisi di NO) possono dare nitriti per fotolisi per circa il 10% e questi, a loro volta, possono rilasciare NO in seguito a fotolisi.125
La formazione artefattuale di NO può essere considerata trascurabile in assenza di tioli, ma aumenta anche fino a 20 volte in presenza dei tioli, quindi anche nei fluidi biologici.125
Un’ altra sostanza impiegata in chemiluminescenza è il luminolo. Una volta formato NO per decomposizione degli RSNO con Cys/Cu++, ad esempio, questo reagisce con H2O2 formando perossinitriti (ONOO-), che, a loro volta, reagiscono velocemente e
selettivamente con il luminolo.126 La reazione può essere così schematizzata:
62 Questo metodo è altamente specifico per NO, e non soffre dell’interferenza di nitriti e nitrati, ma tale selettività viene drammaticamente inficiata dalla presenza di alcune specie riducenti, come i tioli e l’ascorbato. 126
3.3.3 Determinazione del monossido di azoto mediante metodi
elettrochimici
La determinazione elettrochimica del NO può avvenire mediante l’utilizzo di elettrodi tipo-Clark con membrana semipermeablie all’NO stesso127. Questi elettrodi sono costituiti da un capillare di vetro all’interno del quale vi è un microelettrodo di Pt immerso in una soluzione acquosa di NaCl 30 mM e HCl 0,3 mM, come mostrato in Figura 3.5.
Figura 3.5: Schema dell'elettrodo tipo-Clark per la misura dell’ NO.
Una membrana di cloroprene dello spessore di 1 µm consente il passaggio dell’NO e la sua scarica all’anodo (potenziale – 0,9 V costante) secondo la seguente reazione:
La corrente derivante dall’ossidazione del monossido di azoto viene registrata in funzione del tempo.128
I vantaggi di questa tecnica sono il LOD (nel range nM)128 e l’elevata selettività. Inoltre, è una tecnica non invasiva. Di contro, a causa della somiglianza delle proprietà fisiche di NO, CO, CO2 e O2, le membrane utilizzate per questo tipo di elettrodi possono
consentire il passaggio dell’ossigeno molecolare, del monossido di carbonio e dell’anidride carbonica. Infine, questi tipi di elettrodi sono molto delicati, sono soggetti all’adsorbimento di sostanza organica e sono, dunque, poco adatti all’uso in matrici biologiche.
Molti sforzi sono stati fatti per migliorare le prestazioni di questi elettrodi: il campione viene introdotto in una camera sotto azoto contenente CuCl2/Cys. L’NO che si sviluppa
viene trasportato da un flusso di azoto in una soluzione acida di permanganato, dove viene ossidato a NO2 (specie più stabile dell’NO rispetto alla reattività con varie
molecole biologiche e con l’ossigeno molecolare), e convogliato al sensore.129
Anche i nitriti vengono ridotti dal Cu(II) e Cys, dunque vengono preventivamente allontanati come N2 mediante riduzione con ammonio solfammato in HCl. I nitrati,
inoltre, vengono ridotti a nitriti, ad esempio con Cd metallico.
Questa tecnica ha LOD nel range nM.129 In alcuni casi viene utilizzato un elettrodo tipo Clark con membrana di teflon contenente Cu(II)/Cu(I). Tale membrana è semipermeabile agli RSNO a basso PM, e la presenza di rame rameoso garantisce il rilascio di NO che viene poi ossidato a nitrato all’elettrodo di Pt. Nella soluzione in esame è necessaria la presenza di un riducente perché si possa disporre di una quantità iniziale di rame rameoso. Nel plasma è sufficiente la presenza di tioli ed ascorbato.130 In queste condizioni i nitriti non interferiscono perché la loro riduzione da parte del Cu(I) avviene solo a concentrazioni più elevate (>1mM).130
64
Figura 3.6: Sensore amperometrico a membrana PTFE per la determinazione di NO130
Un altro tipo di elettrodo, ancora in fase di studio, è costituito da un anodo composto da Co-Salen polimerizzato su supporto di grafite. Questo elettrodo è capace di variare la propria resistività elettrica, quindi la propria conducibilità, in base alla quantità di monossido di azoto adsorbito.
Un altro sistema di rivelazione dell’NO che si presta bene ad essere utilizzato come rivelatore in sistemi cromatografici e’ la voltammetria idrodinamica. In questo caso vengono utilizzati elettrodi ad amalgama di mercurio sui quali avvengono selettivamente le seguenti reazioni a seconda del potenziale applicato all’elettrodo:
2 RSNO + 2H+ + 2e 2 RSH + 2NO (E= -0,15 V) 2 RSH + Hg Hg(SR)2 + 2 H+ + 2e (E= +0,15 V)
3.3.4 Determinazione degli RSNO tramite determinazione dell’NO con
ESR.
La spettroscopia di risonanza di spin elettronico (nota anche come risonanza elettronica paramagnetica o EPR) è l’unica tecnica capace di determinare specie radicaliche.
A causa della elevata reattività delle specie radicaliche stesse, si preferisce far uso di molecole, chiamate “trappole di spin”, capaci di stabilizzare il radicale mediante formazione di un composto più stabile ma sempre attivo all’ESR.
Alcuni esempi di “trappole di spin” utilizzate per catturare il monossido di azoto sono: il fenil-tert-butilnitrone (PBN), la 5,5-dimetilpirrolina-N-ossido (DMPO), 3,5-dibromo-4-nitrosobenzenesulfonato (DBNBS) e l’1-idrossi-3-carbossi-pirrolidina. Quest’ultima non risente della presenza di riducenti come il GSH e l’acido ascorbico.131
NO, inoltre, reagisce facilmente con le ferroemeproteine, e l’S-nitrosoemoglobina per esempio ha uno spettro ESR caratteristico che può essere determinato anche a temperatura ambiente.132
Le problematiche legate alla determinazione degli RSNO mediante utilizzo della tecnica ESR sono legate all’alto costo della strumentazione, all’instabilità dei radicali, e alla mancanza di specificità.
Sheu et all, inoltre, utilizzando il dietilditiocarbammato ferroso come trappola di spin, hanno dimostrato che la tecnica ESR può sottostimare la quantità di NO rilasciato nel plasma (dunque anche la quantità degli RSNO) in quanto il NO viene intrappolato dai tioli (presenti nel plasma in concentrazioni 500 uM circa) e successivamente rilasciato da essi solo per il 70-90% .
66
3.4 Metodi indiretti per la determinazione degli S-nitrosotioli:
determinazione dei nitriti
3.4.1 Premessa
I nitriti e i nitrati sono i prodotti di idrolisi del NO in presenza di ossigeno molecolare.25
Nel plasma i nitriti rappresentano solo una minima parte (<5%) in quanto essi vengono facilmente ossidati a nitrati. Infatti se aggiunti al plasma, a temperatura ambiente, dopo circa 30 minuti circa il 16% della quantità iniziale viene ossidata a nitrati.133
I nitriti e nitrati nel plasma non derivano solo dall’idrolisi del NO, ma vengono quotidianamente introdotti anche attraverso la dieta. I nitriti sono contenuti in diversi cibi: ne sono ricchi le carni, gli affettati, vari formaggi, ma anche vegetali quali spinaci, lattuga, barbabietole, sedano, ecc. La concentrazione dei nitrati nel plasma è stimata intorno ai 30 µmol/L, ma può salire fino ai 200 µmol/L nelle diete ricche di vegetali.134
Nitriti, nitrati e NO sono legati in una sorta di ciclo che prescinde dall’attività delle NOS: NO viene prodotto dalla demolizione di nitrati e nitriti nello stomaco (pH≤3) allo scopo di formare una barriera gastrointestinale contro le infezioni. Viene, inoltre, prodotto da alcuni batteri contenuti nella saliva, ed è presente anche nel sudore.135
Alla luce di quanto detto, la determinazione dei nitriti e dei nitrati derivanti dall’idrolisi del NO (proveniente a sua volta dalla decomposizione degli S-nitrosotioli) è una misura che deve essere condotta per differenza tra la concentrazione totale dei nitriti e dei nitrati dopo decomposizione degli RSNO stessi e quella non derivante dalla composizione degli S-nitrosotioli. Questo si traduce, pertanto, nell’osservazione di piccole variazioni su un alto valore di fondo. Da un punto di vista analitico questo dà luogo a misure poco riproducibili e poco accurate.
Nella tabella 3.2 vengono riportati i valori di nitriti e nitrati trovati nel plasma di individui sani mediante differenti tecniche analitiche.
I nitrati vengono usualmente determinati come nitriti. La riduzione dei nitrati a nitriti viene tipicamente effettuata con il cadmio.136
Tabella 3-2: Concentrazioni di nitriti e nitrati (espresse in uM) nel plasma di soggetti sani.
Autore (anno) Nitriti Nitrati Metodo
Tesch (1976) N.R. N.R. GC-ECD
Green (1982) N.R. 15-60 Griess
Farell (1992) 0.14 N.R. CL
Kanno (1992) N.R. 22 Griess
Hibbs (1992) 32 (nitriti+nitrati) 32 (nitriti+nitrati) Griess
Wennmalm (1993) 1.3 26 HPLC-UV Misko (1993) N.R. N.R. Fluorimetria Leone (1994) 0.45 41 CE Tsikas (1994) 1.8 38 GC-MS Rhodes (1995) 0.6 37 GC-MS Ueda (1995) 3.3 52 CZE Moshage (1995) 1.3-13 4-45 Griess Preik-Steinhoff (1996) 0.58 25 HPLC-ECD
El Menyawi (1998) 1.1 (nitriti+nitrati) 1.1 (nitriti+nitrati) HPLC-UV
Smythe (1999) N.R. 8-81 GC-MS
Tsikas (1999) 0.55 27 HPLC-UV
Tsikas (1999) N.R. 27 GC-MS/MS
Lauer (2001) 0.3 25 FIA-Griess
68
3.4.2 Determinazione dei nitriti mediante il metodo di Griess
Tra i metodi spettrofotometrici più utilizzati per la determinazione indiretta degli RSNO sottoforma di nitriti troviamo il metodo di Saville e il metodo di Griess.157,138
Il metodo di Saville consta nella decomposizione degli S-nitrosotioli per opera di sali di mercurio (HgCl2):
RSNO + Hg++ RSHg+ + NO+ NO+ + H2O NO2 - + 2H+
I nitriti così prodotti possono essere determinati spettrofotometricamente (εmax= 7 M-1
cm-1 per nitrati a λ=302 nm; per nitriti εmax=22 M-1 cm-1 a 355nm).
I nitrati possono essere determinati previa riduzione a nitriti, oppure tramite HPLC a scambio ionico, possono essere convenientemente separati dai nitriti.
Preik-Steinhoff et al. hanno elaborato un metodo applicabile al sangue intero per la determinazione elettrochimica dei nitriti e quella spettrofotometrica dei nitrati.137
Anche il metodo di Griess si basa sulla decomposizione degli RSNO ad NO ad opera di HgCl2, ma i nitriti vengono derivatizzati con un cromoforo. Il reattivo di Griess è una
miscela di sulfanilamide, N-(1-naftil)etilendiamina diidrocloruro ed HgCl2 in ambiente
Figura 3.7: Reazione di Griess
La sulfammide forma uno ione diazonio per reazione con le specie nitrosanti NOx, e per successiva reazione con la naftiletilendiammina si forma un diazocomposto che viene determinato successivamente a 496 nm.138
Questi metodi sono stati usati ampiamente per la determinazione degli RSNO nel plasma grazie alla loro semplicità d’uso ed ai bassi costi dei reattivi.
Di contro, offrono un LOD nel range micromolare che di fatto li rende inadeguati all’analisi degli RSNO nel plasma. Il metodo di Griess, inoltre, risente della presenza di nitriti, dell’NO atmosferico, di perossidi, di varie specie radicaliche e di riducenti (come i tioli e l’ascorbato) capaci di reagire con la specie nitrosante generica NOx.85
70
3.4.3 Determinazione dei nitriti mediante spettrofluorimetria.
Rispetto ai metodi colorimetrici, i metodi basati sulla fluorescenza consentono di scendere a LOD di circa due ordini di grandezza inferiori (intorno a 10-30 nM).139
La DAN (2,3-diaminonaftalene) è uno dei fluorofori maggiormente utilizzati in quanto reagisce velocemente e specificatamente con agenti nitrosanti. L’NO (rilasciato dagli RSNO attraverso un sale di mercurio, ad esempio), forma con l’ossigeno molecolare la specie nitrosante generica NOx che a sua volta reagisce con la DAN. A seguito di un riarrangiamento interno si forma la NAT (2,3-naftotriazolo)140 che è l’effettiva molecola fluorescente (λex = 375nm; λem = 415nm) come mostrato in Figura 3.8.
Figura 3.8: Reazione della DAN con S-nitrosotioli140
Questo metodo è abbastanza specifico e sensibile, con LOD pari a 50-100 nM,140 può essere usato a pH fisiologico, ma purtroppo risente dell’alta concentrazione di nitriti, nitrati e dell’interferenza di ascorbato e tioli.141
Un’altra sonda fluorescente impiegata per la determinazione indiretta degli RSNO è la DAF-2 (diaminofluorosceina-2).142 I meccanismi di reazione dell’NO con la DAF-2
sono complessi e ancora poco chiari perchè la DAF-2 non reagisce direttamente con l’NO ma con un intermedio attivo che si forma in presenza di ossigeno dall’ossidazione di NO, verosimilmente N2O3, un potente reagente nitrosilante.143,144
2NO + O2 2NO2
2NO + 2NO2 2N2O3
Il prodotto della reazione dell’N2O3 con la DAF-2 è un triazolo (Figura 3.9) che ha una
piccola variazione nel picco massimo di assorbimento, ma una efficienza quantica molto maggiore (di circa 180 volte).
Figura 3.9: formazione della DAF-2T
E’ riportato che la resa di triazolofluoresceina a partire da NO è solo del 18% in una soluzione neutra, in assenza di campioni biologici, e che lo stadio limitante della reazione è rappresentato dalla formazione dell’ N2O3. Questo permette di raggiungere
un detection limit per l’NO con la DAF-2 solo di 2-50 nM. Il prodotto fluorescente triazolofluoresceina (DAF-2T) è proporzionale alla quantità di S-nitrosotiolo presente nel campione e può essere rivelato mediante spettrofluorimetro (λex= 480 nm, λem=515
nm). La DAF-2 ha un’elevata selettività nei confronti del NO (o meglio, nei confronti di N2O3), non reagisce con nitriti, nitrati, radicali perossidici, 143 ed è stata ampiamente
usata per il bioimaging dell’NO in cellule lisce aortiche di ratto, cellule endoteliali aortiche bovine, cellule endoteliali umane in vivo.145
Tuttavia, la DAF-2 risente della presenza della vitamina C: l’acido ascorbico attenua la formazione della DAF-2T, limitando probabilmente l’ossidazione di NO a N2O3 .146
DAF-2-72 DHAs, in quantità piuttosto elevata dato che l’acido ascorbico è presente in concentrazione mM. Altre interferenze sono rappresentate dai tioli, soprattutto dal GSH,147 e dalla vitamina B12.148
Xiaoying et al.149hanno elaborato una metodologia per la determinazione quantitativa del NO attraverso l’uso della DAF-2 in modo tale che non risenta delle interferenze sopra citate: questo metodo è basato sul semplice concetto che NO, essendo un gas, diffonde a -78 °C molto più velocemente di altre molecole come l’acido ascorbico e l’acido deidroascorbico. Lo stesso gruppo di ricerca sta cercando di ottenere gli stessi risultati a temperatura ambiente usando un sottile strato di polimero contenente DAF-2 attraverso il quale l’NO può diffondere.149
Poichè DAF-2 e DAF-2T hanno spettri di fluorescenza simili, con lo stesso massimo di emissione sebbene l’intensità della DAF-2T sia circa 200 volte maggiore rispetto alla DAF-2, se usata in concentrazioni >0,1µM la DAF-2 non reagita può dare un segnale di background non trascurabile.150 Utilizzando la CZE si può separare la DAF-2 non reagita ed ogni composto DAF-2-DHA dalla DAF-2T arrivando così ad un detection limit di 10 nM.149
Di recente sono state sviluppate anche altre sonde fluorescenti per il bioimaging dell’NO che in linea di principio potrebbero essere utilizzate a scopi analitici.
3.4.4 Determinazione degli RSNO mediante gas cromatografia
accoppiata a spettrometria di massa (GC-MS)
L’analisi diretta degli S-nitrosocomposti mediante GC-MS, non essendo quest’ultima applicabile a molecole non volatili, ed essendo gli RSNO termicamente instabili, richiede la loro conversione in nitriti e successiva derivatizzazione in pentafluorobenzil derivati.151 A causa della labilità termica del gruppo S-nitroso, l’analisi in LC-MS con opportuna derivatizzazione appare, più appropriata.120
Sia gli S-nitrosotioli a basso peso molecolare, sia quelli ad alto peso molecolare possono essere analizzati in GC-MS convertendo la funzione S-nitroso in nitriti usando HgCl2 o il sistema rame/cisteina. Questo metodo richiede il pretrattamento con
contaminazione da parte di nitriti. E’ possibile rimuoverli con ammonio solfammato in ambiente acido, ma questo porta alla formazione artefattuale di RSNO.152
La scelta di un opportuno agente derivatizzante è strettamente connessa al gruppo funzionale della molecola e al tipo di detector impiegato.
Come già sottolineato, poiché i nitriti sono presenti nel plasma in concentrazione decisamente maggiore rispetto agli S-nitrosotioli (tra i 100 nM e i 10µM)153, c’è il problema di dover effettuare anche in questo caso una determinazione per differenza.
La massa offre una determinazione quantitativa ad alta precisione grazie all’utilizzo di un isotopo della sostanza da determinare come standard interno (es 15NO2-) che viene
aggiunto alla matrice organica, subisce lo stesso processo di manipolazione e di separazione del campione, fino alla sua determinazione mediante il detector di massa.
I nitriti determinati attraverso l’analisi GC-MS vengono derivatizzati fondamentalmente in due modi: nel primo caso si fa uso del trimetossibenzene come elettrofilo, richiede acido solforico concentrato come catalizzatore e si forma un nitroaromatico volatile e stabile.154 Il secondo metodo usa pentafluorobenzil bromuro (PFB-Br) 154 che reagisce con i nitriti secondo lo schema riportato in Figura 3.10.
Figura 3.10: reazioni di derivatizzazione dei nitriti per l’analisi in GC-MS con (A) trimetossibenzene e con (B) pentafluorobenzil bromuro154
Il maggior vantaggio di queste reazioni di derivatizzazione risiede nel fatto che possono essere impiegate in presenza di un largo eccesso di nitriti rispetto all’NO (30-40 volte o più), ovvero in fluidi biologici come il plasma. La derivatizzazione con PFB-Br, inoltre, permette l’analisi simultanea di nitriti e nitrati che, derivatizzati con PFB, risultano ben separati nel sistema GC-MS. Inoltre la precipitazione delle proteine nel
74 plasma non influisce sui prodotti della derivatizzazione e, pertanto, puo’ essere effettuata anche dopo la derivatizzazione stessa.116
Questo metodo può essere applicato all’analisi degli S-nitrosotioli previa conversione in nitriti attraverso il metodo di Saville.155
3.4.5 Determinazione degli RSNO mediante determinazione del
tiolo-derivato.
Il metodo si basa sulla rimozione quantitativa del GSH attraverso alchilazione con N-etilmaleimmide, conversione del GSNO in GSH mediante 2-mercaptoetanolo, e successiva reazione del GSH formato con o-ftalaldeide (OPA). Dalla reazione si forma un ciclo-indolo altamente fluorescente. Gli spettri di massa dei derivati del GSH e del GSNO con l’OPA sono uguali. Il GSH (fino a 50 mM) non interferisce con l’analisi del GSNO (fino 1000 nM). L'isolamento del GSNO attraverso analisi in HPLC (pH 7.0) dei campioni del plasma ultrafiltrato (200 ml) prima della derivatizzazione, permette la quantificazione specifica e libera da artefatti del GSNO nel plasma del ratto e dell'essere umano. Il glutatione, il nitrito e la cisteina ridotti ed ossidati non interferiscono con la misura di GSNO nel plasma umano e di ratto. Il limite di quantificazione (LOQ) di questo metodo è 100 nM per il GSNO nel plasma ultrafiltrato. Con questo metodo, tuttavia, il GSNO endogeno non è stato rilevato nei campioni di plasma ultrafiltrato di 10 soggetti sani.
In Figura 3.11 sono riportate le formule di struttura dell’o-ftalaldeide e del composto ciclo-indolico formato per reazione col GSH.
Figura 3.11: Formula di struttura dell’o-ftaldeide e del ciclo-indolo fluorescente formato per reazione col GSH
76
3.5 Considerazioni conclusive:
In linea di principio, ogni tecnica analitica applicata all’analisi di S-nitrosotioli può presentare dei vantaggi ed avere dei limiti.
La maggiore limitazione può derivare dalla mancanza di una sensibilità appropriata data l’esigua quantità degli S-nitrosotioli nei fluidi biologici, o dalla mancanza di una specificità adeguata che possa mettere il metodo al riparo da varie sostanze interferenti presenti nella matrice biologica.
Il metodo di Griess non è adatto per studi cinetici sulla decomposizione degli RSNO ed ha un detecion limit troppo elevato per poter essere usato per rilevare gli RSNO nel plasma.
Anche la spettroscopia ESR a trappola di spin non ha detection limit adeguato, ed inoltre la strumentazione è eccessivamente costosa per impieghi di routine.
La chemiluminescenza trova vasta applicazione per la determinazione del monossido di azoto nel respirato, ma di fatto non viene impiegata nella determinazione di NO nei fluidi biologici.
Sia la chemiluminescenza che la tecnica EPR perdono molto in termini di selettività e sensibilità quando vengono applicate a matrici biologiche.156
I sensori elettrochimici sembrano essere piuttosto promettenti per l’analisi degli RSNO in vivo ed in situ, ma gli elettrodi sono estremamente delicati e di fatto si preferisce usarli solo in soluzione acquosa.
Le sonde di fluorescenza offrono detection limit adeguatamente bassi, ma devono poter offrire anche alta specificità e selettività in vivo.
La ricerca di un metodo per l’analisi degli RSNO in vivo che possa combinare assieme alta selettività, sensibilità, detection limit adeguati e costi contenuti è ancora oggetto di studio da parte di molti gruppi di ricerca.
In letteratura esistono molte varianti ai metodi analitici sopra citati. La tabella 3.3 riassume in breve le caratteristiche salienti dei metodi analitici maggiormente utilizzati per la determinazione degli RSNO. La forma estesa della tabella sotto riportata si trova nell’Appendice di questa tesi.
Tabella 3-3: tabella riassuntiva dei metodi analitici applicati alla determinazione degli RSNO
Metodo Tipo di analisi
LOD selettività Range di applicazione Interferenze Elettrodo tipo-Clark semipermeab ile al NO
amperometria 10-8-10-9 M Non specifica 10nM-200uM O2, CO, CO2, nitriti Sensore Co-Salen resistività Non determinato Non determinato Non determinato Non determinato Griess spettrofotome trico 500nM circa 20uM nel plasma buona 0,1-1uM DAN fluorimetria 9nM (pH11,7) specifico 10-250nM nitriti
DAF fluorimetria 5nM Alta specificità 0,01 -2,4uM Ca(II), Mg(II) O3 Chemilumine scenza gassosa 20pmol Quasi specifico 8-186pM Luminol Chemilumine scenza in soluzione 100fM Non specifico 100fM-1nM molecole riducenti quale l’ascorbato (Fe(II)-emecompless i ESR 1nM Non specifico Non riportato
