Risposta tumorale e sopravvivenza dei 57 casi in correlazione con i sottotipi morfologici di linfoma canino

TABELLA X

Risposta tumorale e sopravvivenza dei 57 casi in correlazione con i sottotipi morfologici di linfoma canino

Sottotipo morfologico Risposta MFR OST Centroblastico polimorfo (20) Completa 12 mesi

(9-18)

17 mesi (14-24)

Burkitt (4) 1 Parziale

3 stabili

0 15 giorni (7-21) Piccole cell. Chiare (5) Completa 12 mesi

(6-24)

21 mesi (12-26) Pleomorfo misto (10) Completa 10 mesi

(6-14)

14 mesi (9-16) Plasmocitoide (8) Completa 2 mesi

(1-6)

3 mesi (2-7) Linfoblastico (10) Completa 8 mesi

(7-10)

9 mesi

(8,5-11)

MFR: media first remission (durata media di prima remissione)

OST: overall survival time (tempo di sopravvivenza totale)

LEGENDA DELLE FIGURE

Fig. 1: Curva di Kaplan-Meier: comparazione della durata di prima remissione FR nei cani con diversi sottotipi morfologici di linfoma, durante a chemioterapia. Il sottotipo simil Burkitt è stato considerato come non responsivo per cui non è riportato nella figura.

P: linfoma plasmocitoide di grado elevato di malignità LB: linfoma linfoblastico

PM: linfoma pleomorfo misto

CP: linfoma centroblastico polimorfo SCC: linfoma a piccole cellule chiare

Fig. 2: Curva di Kaplan-Meier: comparazione del tempo di soprvvivenza totale OST nei cani con diversi sottotipi morfologici di linfoma, durante la chemioterapia.

B: linfoma tipo Burkitt

P: linfoma plasmocitoide di grado elevato di malignità LB: linfoma linfoblastico

PM: linfoma pleomorfo misto

CP: linfoma centroblastico polimorfo

SCC: linfoma a piccole cellule chiare

LAVORO N°4

AGGRESSIVE LARGE GRANULAR LYMPHOCYTE LYMPHOMAS IN

FIVE DOGS: A CLINICAL, CYTOHISTOLOGICAL AND

IMMUNOLOGICAL STUDY

(25,28,36,37,45,46,50,52,55,73,75,79,92,104,120,135,137,138,139).

LINFOMA AGGRESSIVO A LINFOCITI AMPI E GRANULATI IN CINQUE CANI:

STUDIO CLINICO, CITO-ISTOLOGICO E IMMUNOLOGICO.

Turinelli V, Marchal T, Ponce F, Bonnefont-Rebeix C, Fournel-Fleury C.

Comparative Clinical Pathology (2005) 13 :109-118

Introduzione

Nell’uomo i linfomi/leucemie a linfociti ampi e granulati (LGL)

rappresentano un gruppo di tumori maligni, acuti o cronici, caratterizzati dalla

presenza di granulazioni citoplasmatiche azzurofile, da un fenotipo T o

natural killer e da frequente coinvolgimento extranodale del fegato, della

milza e, talvolta, del sangue e del midollo osseo. Nel cane solo la leucemia

cronica LGL è stata chiaramente identificata; le forme aggressive restano

ancora poco conosciute, eccetto per sporadiche menzioni e per un caso

riportato recentemente di linfoma epatosplenico aggressivo con morfologia a

linfociti ampi e granulati. Questo studio presenta i risultati delle indagini

cliniche, morfologiche e immunofenotipiche realizzate su 5 cani presentanti

forme aggressive di neoplasie a linfociti ampi e granulati e fornisce una

comparazione con la patologia umana, sulle orme della nuova classificazione

umana WHO delle neoplasie linfoidi.

Risultati

L’incidenza del linfoma/leucemia a linfociti ampi e granulati riscontrata alla Facoltà di Medicina Veterinaria di Lione in un periodo di tempo di 6 mesi è stata approssimativamente dell’1,8% (5 su 276 casi di linfoma). Da un punto di vista epidemiologico l’età media degli animali affetti da questa neoplasia è stata di 6,4 anni. Si è riscontrata una lieve predominanza del sesso femminile (3 femmine su 5) e una predominanza della razza Boxer con 2 casi.

Questi cani sono stati riferiti alla visita medica perché presentavano sintomi quali dimagrimento, astenia e diarrea che si erano sviluppati in diverse settimane ed erano severi in tutti i casi. Tutti presentavano epatomegalia e/o splenomegalia e 4 avevano i linfonodi addominali aumentati di volume. Dopo il consulto clinico, 2 cani hanno sviluppato una pancitopenia, 4 cani un’anemia e 3 una leucocitosi. Poco tempo dopo, in 3 cani si è sviluppata una leucemia secondaria con coinvolgimento midollare e talvolta ematico.

(Tabella XI)

Risultati citologici (Tabella XII)

I 5 casi mostravano importanti similitudini citologiche, sulla base della presenza di una popolazione atipica di cellule medie e grandi, basofile e nucleolate che assomigliavano a blasti linfoidi, contenenti granulazioni azzurofile nel citoplasma e associate a numerosi istiociti emofagocitanti.

Valutando in maniera più dettagliata si sono riscontrati 2 tipi morfologici

distinti. Il primo tipo (caso N° 1 e 2) era caratterizzato dalla proliferazione

monotona di cellule di taglia medio-grande con nucleo rotondo o di forma

irregolare, cromatina finemente dispersa, nucleoli multipli e prominenti,

citoplasma basofilo con fini granulazioni azzurofile, più o meno evidenti e

che esibivano numerose figure mitotiche. Il background era caratterizzato

dalla presenza di un miscuglio di numerosi istiociti spesso emofagocitici e di

numerosi piccoli linfociti normali. Rare cellule linfomatose erano riscontrate

occasionalmente nel sangue periferico (caso N°1) ed erano numerose invece, nel midollo osseo (casi N° 1 e 2). Il secondo tipo (casi N° 3, 4, 5) era caratterizzato da un’infiltrazione massiva degli organi da parte di una proliferazione monotona di cellule medio-grandi con nucleo rotondo, regolare e nucleoli multipli e prominenti. L’aspetto della cromatina variava da fine, nelle cellule più grandi, a irregolarmente addensato in quelle più piccole. Il citoplasma era sempre intensamente basofilo ma spesso microvacuolizzato e conteneva alcune granulazioni dense e azzurofile, localizzate nell’area chiara iuxta-nucleare. Le mitosi erano numerose, come nel primo tipo, e il background era costituito da numerosi istiociti emofagocitici senza però i piccoli linfociti. Il sangue periferico e il midollo osseo potevano essere massivamente coinvolti, sotto forma di una vera e propria leucemia (caso N°3) oppure per niente coinvolti (casi N°4 e 5).

Risultati immunologici (Tabella XIII)

Per il primo tipo l’immunofenotipo è stato: CD3-, CD79a-, CD8-, CD4-.

Questo risultato suggerisce la presenza di un fenotipo nullo. Per il secondo tipo l’immunofenotipo è stato: CD3+, CD79a-, CD8+, CD4-, quindi si è trattato di un fenotipo T CD8+. Riguardo all’espressione dei markers per le cellule natural killer, il CD3ε è risultato postivo nelle cellule del tipo T CD8+

e nelle cellule T dei normali tessuti di controllo, ma negativo per il tipo nullo.

Il CD56 ha marcato tutti i nuclei di entrambi i tipi di linfoma a LGL ma anche

dei normali tessuti di controllo. Per quanto riguarda i markers delle cellule

citotossiche, il TIA1 è risultato debolmente espresso nei 3 casi T CD8+ ,

positivo nel caso N°2 e negativo nel caso N°1 del tipo nullo. Il granzima B e

la perforina sono risultati negativi in tutti i casi di entrambi i tipi. Tutti i

markers delle cellule citotossiche erano negativi nei normali tessuti di

controllo. La conta delle cellule Ki67+ è risultata simile sia all’esame

citologico che a quello istologico, costantemente elevata con un valore medio

del 54,4%; per questo motivo tali linfomi sono stati inseriti nel gruppo dei linfomi di grado elevato di malignità.

Risultati istologici (Tabella XII)

L’esame istologico dei 2 casi appartenenti al tipo “nullo” mostrava un’infiltrazione portale del fegato. Nella milza le cellule neoplastiche erano localizzate nei cordoni e nei seni della polpa rossa. L’aspetto morfologico delle cellule neoplastiche era lo stesso di quello descritto dall’esame citologico ma le granulazioni citoplasmatiche non erano facilmente identificabili. L’indice mitotico è risultato elevato. L’esame istologico del tipo T CD8+ ha rivelato la presenza di 2 aspetti differenti. Il primo che abbiamo chiamato aspetto a (caso N°3) era caratterizzato da un’infiltrazione massiva dell’intestino, fegato, milza e linfonodi. Nel fegato l’infiltrazione era principalmente di tipo portale e secondariamente sinusoidale. Nella milza la popolazione neoplastica era localizzata nella polpa rossa. Nell’intestino era presente un’importante invasione linfomatosa che coinvolgeva tutti gli strati ed era associata ad un’estesa atrofia ulcerativa dei villi e ad un’enterite cronica plasmocitica.

Il secondo, detto aspetto b (casi N° 4 e 5) era caratterizzato da un’infiltrazione massiva del fegato e della milza. Nel fegato l’infiltrazione era di tipo sinusoidale, senza coinvolgimento delle triadi portali. Nella milza le cellule neoplastiche erano localizzate nella polpa rossa mentre nei linfonodi erano localizzate solamente nel lume dei vasi sanguigni. La cosa più interessante di questo aspetto, è stata la mancanza dell’infiltrazione intestinale.

L’angiocentricità e l’angiodistruzioni non sono state osservate né nel tipo

nullo né in quello T CD8+.

Discussione

I disordini linfoproliferativi che coinvolgono le cellule LGL sono stati descritti in molte specie, incluso l’uomo, il gatto, il cavallo, il ratto, il furetto, gli uccelli e il cane. Questi possono essere transitori (policlonali e reattivi) oppure cronici (policlonali o monoclonali, reattivi o neoplastici).

Queste neoplasie linfoidi maligne sembra che prendano origine da differenti subcategorie di cellule citotossiche, principalmente localizzate nei tessuti extranodali in condizioni sia reattive che normali, ad esempio nel sangue, midollo osseo, intestino tenue e crasso (dove sono anche chiamate linfociti intraepiteliali o “globoid cells”), nel fegato (dove sono conosciute anche con il nome di “Pit cells”), milza, stomaco, polmone, vescica, utero e placenta.

Queste hanno dimostrato di essere cellule linfoidi sulla base dell’espressione dei marker T (CD3+, CD8+/-) e dei marker delle cellule natural killer (CD56+, CD3ε+) e sulla base della presenza di proteine associate alle granulazioni citotossiche (perforina, granzima B, TIA1).

Nelle recenti classificazioni umane REAL e WHO si distinguono chiaramente

varie neoplasie maligne a LGL, correlate alla loro corrispondente

subcategoria normale, sulla base della loro presentazione clinica e

dell’immunofenotipo. Nell’uomo la Leucemia a cellule T LGL è considerata

un disordine clinicamente indolente, caratterizzato da un aumento persistente

nel numero delle LGL del sangue periferico, frequentemente associato a

neutropenia e a moderata splenomegalia. I siti principalmente coinvolti sono

il sangue periferico, il midollo osseo, la milza e il fegato. I linfonodi sono

raramente coinvolti e il disordine più importante è la neutropenia e talvolta

anche l’anemia. L’aspetto morfologico delle cellule neoplastiche è quello dei

grandi linfociti granulati che presentano una cromatina matura e addensata, un

citoplasma abbondante e pallido e granulazioni azzurofili fini o dense. La

leucemia a LGL presenta un immunofenotipo a cellule T mature che spesso

corrisponde a CD3+, TCRαβ+, CD8+, CD4-, CD57+. Il TIA1, il granzima B

e la perforina risultano positivi. Talvolta può progredire verso una forma più aggressiva e in una minoranza di casi, può trasformarsi in un linfoma a cellule T periferico, composto da grandi cellule.

Il linfoma a cellule T/NK, nasale e simil-nasale e la Leucemia aggressiva a cellule NK (che sembra essere la controparte leucemica del tipo nasale extranodale) rappresenta nell’uomo, il secondo disordine a LGL più diffuso;

entrambi corrispondono ad una proliferazione aggressiva e sistemica di cellule NK o di cellule T NK-simili. Per il linfoma extranodale, nasale e simil-nasale a cellule T/NK i siti privilegiati sono le cavità nasali, il nasofaringe, il palato, la cute, i tessuti molli, il tratto gastro intestinale e i testicoli; per la leucemia aggressiva a cellule NK, i siti privilegiati sono invece, il sangue, il midollo osseo, la milza e il fegato. Entrambi appaiono caratterizzati da un coinvolgimento rapido e multiplo dei siti extra-nodali, talvolta da una linfoadenopatia secondaria, da un’insufficienza organica multipla e da una frequente sindrome emofagocitica. Le cellule neoplastiche possono essere piccole, medie o grandi con nucleo irregolare ipercromatico o vescicolare, nucleoli più o meno distinti e un grande citoplasma pallido o leggermente basofilo che contiene granulazioni azzurofile fini o dense. La necrosi e l’angioinvasione sono frequenti. L’immunofenotipo delle cellule neoplastiche è: CD2+, CD3-, CD3ε+, CD56-, CD4-, CD8-, CD57-. Sono inoltre positive per il TIA1, il granzima B e la perforina. L’eziologia resta ancora sconosciuta ma sembra che siano associate all’infezione con l’Epstein- Barr virus.

Il linfoma epato-splenico a cellule T rappresenta un’altra neoplasia sistemica

extranodale a LGL, caratterizzata da marcata infiltrazione sinusoidale della

milza, fegato e midollo osseo. Raramente è presente coinvolgimento

linfonodale. Le manifestazioni cliniche sono: una marcata epato-

splenomegalia, trombocitopenia e, spesso, anemia e leucocitosi, con o senza

cellule neoplastiche nel sangue periferico. Le cellule neoplastiche sono di

taglia media, con nucleo irregolare, cromatina leggermente condensata, nucleoli piccoli e non sempre visibili, citoplasma poco esteso, pallido e contenente, talvolta, granuli azzurofili. L’immunofenotipo è CD3+, TCRγδ+, TCRαβ-, CD56+/-, CD4-, spesso CD8-, CD5-. Le cellule esprimono le proteine associate ai granuli citotossici TIA1 ma sono generalmente negative per il granzima B e la perforina.

L’ultimo disordine a LGL dell’uomo è rappresentato dal linfoma enteropatico a cellule T che coinvolge soprattutto il digiuno e l’ileo con concomitante atrofia dei villi, ulcerazione intestinale e malattia celiaca. Le cellule neoplastiche sono monomorfe, di taglia media o grande, con nucleo rotondo angolato o vescicolare e citoplasma moderato o abbondante, pallido e contenente, talvolta, granuli azzurofili. Le cellule neoplastiche sono CD3+, CD8+/-, CD56+/-.

Attualmente le conoscenze sulle patologie a LGL del cane sono scarse, mentre nel gatto diversi studi hanno dimostrato la presenza di un linfoma intestinale a LGL con fenotipo sia T che NK, basandosi sull’espressione del CD3, sulla positività del marker per la perforina e sul riarrangiamento genico del TCR.

Nel cane la leucemia cronica a LGL è stata ampiamente descritta. Raramente questa leucemia può apparire come una malattia progressiva a decorso rapido, caratterizzata da anemia, trombocitopenia ed epato-splenomegalia. Nella maggior parte dei casi studiati, l’immunofenotipo era T CD8+. Recentemente è stato descritto un primo caso di linfoma epatosplenico T a grandi linfociti granulati che presentava molte similitudini con il corrispondente tipo umano:

un decorso clinico aggressivo, segni sistemici, citopenie e infiltrazione della

milza, fegato e di altri organi da parte di cellule Tγδ. Un altro caso simile di

linfoma epato-splenico a cellule T è stato descritto recentemente, ma in

quest’ultimo le cellule linfomatose non contenevano granuli azzurofili nel

citoplasma. A causa dell’assenza di marker per le cellule NK del cane e dello

scarso numero di casi studiati fino ad oggi, non è stato ancora possibile distinguere un’entità clinico-patologica simile a quelle riscontrate nell’uomo, con espansione clonale delle cellule NK a LGL.

Questo studio descrive 5 casi di proliferazioni a grandi cellule granulate che presentano numerose similitudini tra di loro a causa del decorso clinico aggressivo, il coinvolgimento epato-splenico, i criteri citologici e la sindrome emofagocitica associata caratterizzata dalla presenza di istiociti fagocitici. Da un punto di vista clinico, tutti i casi mostrano segni sistemici e digestivi, associati ad epatomegalia e/o splenomegalia che evolve rapidamente. I cani spesso presentano citopenie caratterizzate da anemia, trombocitopenia o leucopenia e, in molti casi sindrome emofagocitica. Lo stesso aspetto clinico è stato descritto nelle varie entità aggressive a LGL dell’uomo e nei due casi di linfoma epato-splenico riportati nel cane in precedenza. Le anomalie ematologiche sono ugualmente riscontrate nel linfoma/leucemia a cellule NK dell’uomo, nel linfoma epato-splenico, in cui la trombocitopenia predomina, nel linfoma a cellule T di tipo enteropatico così come nel linfoma epato- splenico canino in cui sia gli istiociti che le cellule neoplastiche fagocitano i globuli rossi. Sembra sia possibile che le citopenie siano immuno-mediate e/o il risultato di un’attivazione degli istiociti o una soppressione del midollo osseo da parte delle citochine prodotte dalle cellule neoplastiche.

Tutte le cellule neoplastiche dei nostri 5 casi, presentavano, molte similitudini citologiche, sulla base di un aspetto blastico, una taglia medio-grande, una cromatina fine ma non polverosa e talvolta intensamente condensata, citoplasma molto basofilo con cospicue granulazioni azzurofile localizzate.

Queste cellule appaiono chiaramente differenziabili dalle cellule mieloblastiche, caratterizzate da una cromatina immatura, polverosa e un citoplasma moderatamente basofilo in cui le granulazioni sono fini e disperse e quindi la loro morfologia suggerisce chiaramente un’origine linfoide.

Queste cellule appaiono abbastanza simili alle cellule descritte nel caso di

linfoma epatosplenico a LGL e assomigliano, inoltre, alle proliferazioni aggressive a LGL umane anche se nell’uomo il citoplasma è pallido o leggermente basofilo senza correlazione tra l’aspetto morfologico dei granuli e le caratteristiche immunologiche delle cellule; in questo studio invece, il tipo nullo presentava granuli azzurofili fini e il tipo T CD8+, aveva granuli azzurofili densi. Tuttavia, nonostante le suddette similitudini, questi 5 casi di proliferazioni a LGL debbono essere distinti in sottotipi differenti e provvisori, sulla base delle loro caratteristiche immunologiche e istologiche.

Da un punto di vista immunologico, si sono ritrovati due fenotipi differenti:

CD3-, CD79a-, CD8-, CD4- (tipo nullo), e CD3+, CD79a-, CD8+, CD4- (tipo T CD8+). Per quanto riguarda i marker citotossici utilizzati, il TIA1 è risultato espresso in 4 dei 5 casi, come avviene nelle neoplasie maligne a LGL dell’uomo, sebbene non siano state rinvenute alcune cellule positive nei tessuti di controllo, forse perché queste sono alquanto rare nei campioni normali. Il granzima B e la perforina non hanno mostrato nessun marcaggio sia nei tessuti normali che nei campioni linfomatosi. Tuttavia, contrariamente a ciò che avviene nella specie felina, al momento non si conosce niente per quanto riguarda l’espressione di questi marker nei tessuti canini. Il CD3ε è risultato positivo solo nel tipo T CD8+, come marker per le cellule T, e non nel tipo nullo, come marker per le cellule citotossiche. Il CD56 non può essere interpretato, in quanto questo ha marcato tutti i nuclei sia delle cellule neoplastiche che di quelle dei normali tessuti di controllo. Infine il tipo T CD8+, che ha espresso in tutti e tre i casi il marker citotossico TIA1, non ha posto nessun problema per la sua caratterizzazione immunologica.

Sfortunatamente il δγTCR che è tipicamente espresso nelle cellule linfoidi

citotossiche della milza normale e nel linfoma epato-splenico sia nell’uomo

che nel cane, non è stato disponibile in questo studio. Il tipo nullo resta poco

caratterizzato immunologicamente (solo 1 dei 2 casi è risultato positivo al

TIA1) a causa della mancanza di altri marker citotossici positivi. Tuttavia, a

noi è sembrato, sulle basi delle caratteristiche morfologiche, che non ci fossero dubbi sull’appartenenza alla linea linfoide e che si trattasse di un reale fenotipo nullo. Infine le caratteristiche istologiche hanno portato argomenti supplementari per la presente distinzione tra i seguenti sottotipi provvisori: il tipo nullo (casi 1 e 2), caratterizzato da un decorso clinico aggressivo, epatomegalia predominante associata o meno a splenomegalia, costante coinvolgimento midollare e rare cellule linfomatose nel sangue, citopenia marcata, sindrome emofagocitica e granulazioni azzurofile fini nel citoplasma, sembra essere una reale entità che può essere comparata con il linfoma/leucemia aggressivo a cellule NK dell’uomo. Il tipo T CD8+ aspetto b (casi 4 e 5), caratterizzato da un’infiltrazione massiva sinusoidale del fegato senza coinvolgimento delle triadi portali, e della polpa rossa della milza con conseguente epato-splenomegalia, citopenia, sindrome emofagocitica e granulazioni azzurofile dense nel citoplasma, sembra abbastanza simile al linfoma epato-splenico a cellule T dell’uomo e all’unico caso di linfoma epato-splenico del cane, recentemente descritto. Infine, il tipo T CD8+

aspetto a (caso 3) che era caratterizzato dagli stessi aspetti citologici del precedente ma che presentava un’infiltrazione predominante dell’intestino, associato ad ulcerazioni della mucosa, atrofia dei villi ed enterite cronica plasmocitica, sembra molto simile al linfoma di tipo enteropatico a cellule T dell’uomo. L’ampia disseminazione nel sangue, midollo, fegato, milza riscontrata in quest’ultimo caso può essere la conseguenza di uno stadio avanzato della malattia.

Ulteriori studi saranno necessari per identificare con certezza le varie entità a

LGL del cane, come è stato fatto già per l’uomo. Questo dovrà coinvolgere

studi approfonditi di tipo clinico, patologico e immunofenotipici. In tutti i

casi, è bene sottolineare per i patologi clinici, che le analisi citologiche degli

agoaspirati del fegato e della milza, sono stati nella maggior parte dei casi, il

primo passo più importante verso la diagnosi.

TABELLA XI

Razza, età, sesso, segni clinici, caratteristiche biologiche e patologiche, decorso dei 5 casi di linfoma a LGL.

CASO N°

RAZZA, ETA, SESSO

SEGNI CLINICI

DATI

BIOLOGICI

ORGANI COINVOLTI

DECORSO

1 San

Bernardo, 7 anni, femmina

Diarrea, debolezza, dimagrimento

per 1

settimana, ipertermia, dolori addominali, epato-

splenomegalia

Trombocitopenia, leucocitosi, poche cellule neoplastiche nel sangue

periferico;

↑fosfatasi

alcalina (1,420 ui/l)

Milza, fegato, linfonodi addominali, midollo

Eutanasia, 5 giorni dopo la diagnosi

2 Labrador, 5 anni, femmina

Ipertermia, debolezza in 2 settimane, disfagia, splenomegalia

Trombocitopenia, anemia,

leucopenia

Milza,

midollo osseo

Splenectomia, chemioterapia e morte dopo 1 mese

3 Boxer, 5 anni, maschio

Astenia, diarrea, melena, vomito, dimagrimento per 2 mesi, epato-

spenomegalia

Anemia, leucocitosi, numerose cellule neoplastiche nel sangue

periferico, ipoproteinemia (43 g/l)

Milza, fegato, intestino, linfonodi addominali, midollo

Chemioterapia con parziale remissione e morte dopo un mese

4 Boxer, 5 anni

maschio

Debolezza, anoressia per una settimana, dispnea, epato-

splenomegalia

Trombocitopenia, anemia,

leucopenia; ↑ urea (14,67

mmol/l) e

creatinina (185 µmol/l)

Fegato, milza, linfonodi addominali

Eutanasia 3 giorni dopo la diagnosi

5 Beauceron, 10 anni, femmina

Astenia, diarrea, dimagrimento per 4 mesi, splenomegalia

Batteri nel sedimento

urinario, anemia, leucocitosi

Linfonodi addominali, milza

Eutanasia, 3 settimane

dopo la

diagnosi

TABELLA XII

Risultati citologici e istologici dei 5 casi di linfoma a LGL CASO

N°

CITOLOGIA ISTOLOGIA

Tipo nullo

1 e 2 Primo tipo: cellule di taglia variabile, nucleo rotondo o di forma irregolare, cromatina fine, nucleoli multipli, citoplasma basofilo con fini granulazioni azzurofile.

Presenza di numerosi istiociti emofagocitici e piccoli linfociti nel background.

Tipo nullo: infiltrazione portale del fegato, invasione della polpa rossa della milza;

elevato indice mitotico.

Tipo T CD8+

3 Secondo tipo: cellule di taglia variabile, nucleo rotondo, cromatina fine o addensata, nucleoli multipli paracentrali, citoplasma

intensamente basofilo,

microvacuolizzato con area chiara iuxta nucleare e granuli densi, azzurofili e localizzati. Presenza di numerosi istiociti emofagocitici, sparsi nel background.

Tipo T CD8+, aspetto a:

infiltrazione portale del fegato e della polpa rossa della milza. Invasione massiva di tutti gli strati dell’intestino, atrofia ulcerativa dei villi ed enterite cronica plasmocitica.

4 e 5 Secondo tipo: vedi sopra. Tipo T CD8+, aspetto b:

infiltrazione sinusoidale del fegato senza interessamento delle triadi portali.

Infiltrazione della polpa rossa

della milza mentre nei

linfonodi le cellule

neoplastiche erano localizzate

solo nel lume dei vasi.

TABELLA XIII

Risultati immunologici dei 5 casi di linfoma a LGL

CASO N° CD79a CD3 CD3ε CD4 CD8 TIA1 Ki67 (%)*

1 - - - - - - 61

2 - - - - - + 52

3 - + + - + + 55

4 - + + - + + 72

5 - + + - + + 32

* Percentuale di cellule positive

FOTO LAVORO N° 4

Foto n°1: Prelievo citologico di milza. Le cellule neoplastiche presentano fini granulazioni azzurofile nel citoplasma. Primo tipo (tipo nullo). May Grünwald Giemsa, x100.

Foto n°2: Prelievo citologico di milza. Cellule linfoidi atipiche associate ad istiociti, talvolta emofagocitici.

Primo tipo (tipo nullo). May Grünwald Giemsa, x40.

Foto n° 3: Prelievo citologico epatico. Le cellule neoplastiche presentano granulazioni azzurofile dense e localizzate in un citoplasma intensamente basofilo. Secondo tipo (tipo T CD8+). May Grünwald Giemsa, x100.

Foto n°4: Striscio di sangue periferico, una cellula neoplastica. Secondo tipo (tipo T CD8+). May Grünwald Giemsa, x100.

Foto n°5: Sezione di tessuto epatico. Infiltrazione marcata e diffusa del parenchima epatico da parte delle cellule neoplastiche CD3+. Secondo tipo (tipo T CD8+, aspetto b). Colorazione immunoistochimica, metodo streptavidina-biotina-perossidasi, x40.

Foto n°6: Prelievo citologico epatico. Cellule linfomatose CD8+. Secondo tipo (tipo T CD8+, aspetto b).

Colorazione immunoistochimica, metodo streptavidina-biotina-perossidasi, x100.

Foto n°7: Sezione tissutale di linfonodo. Cellule linfomatose TIA1+ nel lume del vaso della midollare.

Secondo tipo (tipo T CD8+, aspetto b). Colorazione immunoistochimica, metodo streptavidina-biotina- perossidasi, x40.

Foto n°8: Sezione tissutale intestinale. Numerose cellule linfomatose Ki67+ nella tunica muscolare. Secondo tipo (tipo T CD8+, aspetto a). Colorazione immunoistochimica, metodo streptavidina-biotina-perossidasi, x40.

Foto n°9: Sezione tissutale splenica. Linfociti ampi e granulati associati a istiociti. Primo tipo (tipo nullo).

Ematossilina-eosina, x40.

Foto n°10: Sezione tissutale intestinale. Ulcera della mucosa e infiltrazione della sierosa e della muscolare da parte delle cellule neoplastiche. Secondo tipo (tipo T CD8+, aspetto a). Ematossilina-eosina, lente binoculare, x4.

Foto n°11: Sezione tissutale intestinale. Infiltrazione linfomatosa massiva della muscolare esterna. Secondo tipo (tipo T CD8+, aspetto a). Ematossilina-eosina, x40.

Foto n°12: Sezione tissutale epatica. Infiltrazione sinusoidale di cellule linfomatose. Secondo tipo (tipo T CD8+, aspetto b). Ematossilina-eosina, x40.

LAVORO N°5

STUDIO CITOLOGICO COMPARATIVO E PROGNOSTICO SU 135 CASI DI LINFOMA NEL CANE

Turinelli V, Furlanello T, Lubas G, Fournel-Fleury C.

48° Congresso Nazionale SCIVAC, Rimini, 27-30 maggio 2004

Il linfoma del cane è una neoplasia di frequente riscontro nella pratica clinica ed è della massima importanza stabilire una prognosi in relazione alle possibili opzioni terapeutiche. Se si considera il linfoma come un’unica entità, la prognosi associata all’uso dei protocolli chemioterapici disponibili varia da settimane ad oltre 1 anno. Invece è stato dimostrato che una corretta caratterizzazione, sia morfologica che fenotipica, permette di riconoscere differenti entità patologiche, con peculiari risposte terapeutiche e con prognosi assai diverse. Il presente lavoro riporta lo studio di tipizzazione di un numero adeguato di linfomi canini, effettuato in un Laboratorio dislocato in Italia e uno in Francia, al fine di compararne la prevalenza dei sottotipi osservati rispetto a quanto pubblicato in Letteratura.

In un analogo periodo di 9 mesi sono stati diagnosticati un totale di 135 casi

di linfoma, 70 in Francia e 65 in Italia. I preparati per l’osservazione

microscopica, sono stati ottenuti da agoaspirati di linfonodi, di neoformazioni

superficiali o profonde e da liquidi di versamento, centrifugati e strisciati su

vetrino. I preparati sono stati colorati con colorazioni tipo Romanowsky e

sottoposti ad una classificazione utilizzando i criteri morfologici proposti

dalla classificazione citologica di Kiel attualizzata e adattati alla più recente

classificazione WHO dei linfomi e delle leucemie canine. Per i linfomi

osservati in Francia è stata eseguita anche l’immunofenotipizzazione,

utilizzando gli anticorpi anti CD3 (pan T) e anti CD79a (pan B) e gli anticorpi anti CD4 e CD8 (sottotipi T). Per alcuni linfomi è stato calcolato anche l’indice di proliferazione utilizzando il Ki 67.

In entrambi i paesi si è avuta una predominanza di linfomi di fenotipo B (56,9% in Italia e 82,9% in Francia) e di grado elevato di malignità (rispetto al totale: 83% in Italia e 88,5% in Francia); il sottotipo prevalente è risultato essere il centroblastico polimorfo (30,8% in Italia e 50,0% in Francia), per il quale la risposta alla chemioterapia e la durata di sopravvivenza sono tra le migliori (rispettivamente 12 mesi e 17 mesi). E stata rilevata inoltre una buona percentuale di linfomi plasmocitoidi (fenotipo B oppure T = 27,7% in Italia e 8,6% in Francia) per i quali è stato dimostrato che la durata di remissione post chemioterapia è di 2 mesi e il tempo di sopravvivenza è di soli 3 mesi e una bassa percentuale di linfomi B tipo Burkitt (6,1% in Italia e 4,3% in Francia) per i quali non c’è alcuna risposta alla chemioterapia. Solo per tre linfomi (1 plasmocitoide ed 2 prolinfocitici), per i quali era disponibile esclusivamente la valutazione citomorfologica, non è stato possibile individuare il fenotipo.

Il presente studio dimostra la possibilità di riconoscere differenti sottotipi di

linfoma e ciò appare indispensabile, perché nella recente letteratura è riportato

che il riconoscimento del solo fenotipo B o T non è sufficiente per emettere

un giudizio prognostico corretto. Infine si deve notare che vi sono differenze

significative tra l’incidenza dei sottotipi in Francia e in Italia e ancor più con

casistiche raccolte in altri Paesi europei, come ad es. in Gran Bretagna. Ciò

implica che probabilmente vi sono importanti variabilità epidemiologiche

nelle diverse aree geografiche, che possono avere importanti risvolti anche dal

punto di vista clinico. In base ai dati ad oggi disponibili, non è più corretto

considerare il linfoma canino come una singola entità clinica.

TABELLA XIV Risultati lavoro n°5

LINFOMI FRANCIA ITALIA

Linfomi totali diagnosticati 70 65

Fenotipo B 58 (82,9%) 37 (56,9%)

Grado elevato di malignità 62 (88,5%) 54 (83%) Tipo centroblastico polimorfo 35 (50%) 20 (30,8%) Tipo plasmocitoide 6 (8,6%) 18 (27,7%)

Tipo Burkitt 3 (4,3%) 4 (6,1%)

CONCLUSIONI

In Medicina Umana, attualmente, il fine ultimo delle classificazioni dei linfomi maligni è quello di distinguere delle entità anatomo-cliniche differenti, riconoscibili dagli istopatologi e utili per i clinici.

In Medicina Veterinaria gli studi terapeutici e prognostici, pubblicati fino ad oggi, considerano i linfomi maligni del cane come una unica patologia, distinguendoli, talvolta, unicamente in base al fenotipo (T o B), senza però effettuare mai una distinzione in sottotipi morfologici.

In questo lavoro di ricerca si è cercato di intraprendere una nuova classificazione dei linfomi maligni del cane, simile alle ultime classificazioni adottate nell’uomo (REAL e WHO), con l’intento di trarne un aiuto sia sul piano clinico che su quello prognostico.

Per arrivare a ciò, abbiamo classificato, prima, morfologicamente e immunofenotipicamente i linfomi osservati, basandoci sulla classificazione di Kiel aggiornata, e poi abbiamo completato il lavoro aggiungendo i dati epidemiologici, clinici e seguendo l’evoluzione dei nostri casi.

Nel nostro primo lavoro (“Proposta di classificazione delle neoplasie linfoidi non-Hodgkin del cane, dalla classificazione di Kiel aggiornata a quelle della REAL e WHO”) si è creato uno schema di classificazione in cui la maggior parte delle neoplasie linfoidi a cellule B e T del cane può essere inquadrata in correlazione con la cellula linfocitaria originale. Si sono distinte allora: 1) le leucemie/linfomi linfoblastici dei precursori B, 2) le neoplasie delle cellule B periferiche, 3) le leucemie/linfomi linfoblastici dei precursori T, 4) le neoplasie delle cellule T periferiche.

Nel nostro secondo lavoro (“Linfoma maligno del cane: studio morfologico,

immunologico ed epidemiologico di 608 nuovi casi e comparazione con il

linfoma non-Hodgkin dell’uomo”) si sono riportati i dati epidemiologici,

morfologici, immunologici e clinici di 608 casi di linfoma canino, raccolti da

diversi laboratori di patologia veterinaria distribuiti nel territorio francese. In accordo con la classificazione di Kiel attualizzata e adattata alla specie canina, si sono ottenuti: 160/608 linfomi di basso grado di malignità, 448/608 linfomi di grado elevato di malignità, 388/608 linfomi di fenotipo B (CD3-, CD79a+), 215/608 linfomi di fenotipo T (CD3+, CD79a-) e 5/608 linfomi nulli (CD3-, CD79a-). All’interno del gruppo delle neoplasie linfoidi di fenotipo B si sono ottenuti i seguenti linfomi: 12/608 di basso grado di malignità a piccole cellule B, 4/608 follicolari, 66/608 della zona marginale, 4/608 a piccole cellule non altrimenti specificabile, 4/608 centroblastici monomorfi, 234/608 centroblastici polimorfi, 47/608 immunoblastici, 1/608 anaplastici, 10/608 tipo Burkitt, 6/608 plasmocitoidi.

All’interno del gruppo delle neoplasie linfoidi di fenotipo T si sono ottenuti i seguenti linfomi: 20/608 a piccole cellule chiare, 1/608 prolinfocitici a cellule T, 5/608 pleomorfi a piccole cellule, 52/608 pleomorfi a cellule miste e grandi, 7/608 immunoblastici a cellule T, 19/608 plasmocitoidi a cellule T, 1/608 aggressivi a grandi linfociti granulati, 17/608 linfoblastici, 72/608 cutanei e 21/608 inclassificabili.

Non si sono ottenute differenze significative tra i linfomi a cellule B e quelli a cellule T per quanto riguarda l’età (media di 8 anni) e il sesso dei cani. Si è riscontrata, invece, una predominanza della razza Boxer (24,19%), rispetto alle altre razze, per quanto riguarda i linfomi a cellule T. I principali segni clinici riscontrati al momento della prima visita erano linfoadenopatia, generalizzata o localizzata in 500/608 casi e coinvolgimento extranodale in 108/608 casi con predominanza delle localizzazioni cutanee.

Nel terzo lavoro (“Significato prognostico dei sottotipi morfologici di linfoma

maligno canino durante la chemioterapia”) si è voluta determinare la risposta

dei differenti sottotipi morfologici di linfoma canino ad un protocollo

chemioterapico standard. La diagnosi di linfoma si basava sull’analisi cito-

istologica e immunofenotipica di campioni provenienti da linfonodi aumentati

di volume o di masse extra-nodali. In accordo con la classificazione di Kiel attualizzata e adattata alla specie canina, si sono classificati 57 casi di linfoma e di questi, 24 sono risultati essere di fenotipo B (20 centroblastici polimorfi e 4 di tipo Burkitt) e 33 di fenotipo T (10 pleomorfi misti, 10 linfoblastici, 8 plasmocitoidi e 5 a piccole cellule chiare). Tutti i cani sono stati valutati clinicamente e stadiati al momento della diagnosi. Il protocollo chemioterapico antineoplastico utilizzato comprendeva le seguenti molecole:

L-asparaginasi, vincristina, ciclofosfamide, doxorubicina e prednisone. Per ciascun sottotipo di linfoma sono stati valutati la durata di prima remissione e il tempo di sopavvivenza totale. Sebbene il fenotipo a cellule T sia stato associato, nel complesso, ad una prognosi peggiore, come riportato nei precedenti studi veterinari e di medicina umana, questo lavoro ha mostrato una differenza prognostica significativa tra i sottotipi di linfoma maligno canino a cellule B e T e suggerisce che la caratterizzazione clinico- morfologica di questa malattia è giustificata nel cane come nell’uomo.

Nel quarto lavoro (“Linfoma aggressivo a linfociti ampi e granulati in 5 cani:

studio clinico, cito-istologico e immunologico”) si approfondisce lo studio di

un particolare tipo di linfoma ancora poco conosciuto nel cane. Su 276

linfomi canini diagnosticati in 6 anni nella medesima struttura veterinaria, si

sono avuti solo 5 casi di linfoma a linfociti ampi e granulati. I 5 cani sono

stati valutati clinicamente e sono stati sottoposti ad un attento follow up. Si

sono realizzate analisi citologiche e istologiche di fegato, milza, linfonodi,

intestino e midollo osseo e si è stabilito l’immunofenotipo e l’indice di

proliferazione. I dati clinici più significativi sono stati: un decorso clinico

aggressivo, la presenza di epato/splenomegalia, linfoadenopatia addominale,

anemia (in 4 casi) e convolgimento del midollo e del sangue periferico (in 2

casi). La presentazione citologica era caratterizzata da un’infiltrazione diffusa

di cellule linfoidi atipiche, grandi e granulate. Due casi presentavano un

fenotipo nullo (CD3-, CD79a-, CD4-, CD8-) e tre casi presentavano un

fenotipo T (CD3+, CD79a-, CD4-, CD8+). L’indice di proliferazione Ki-67 era alto in tutti i casi con una media di 54,4% di cellule marcate. La presentazione istologica del tipo nullo era caratterizzata da un’infiltrazione portale del fegato e della polpa rossa della milza. Il tipo T CD8+ mostrava invece due aspetti diversi: aspetto di tipo a, in cui erano infiltrati tutti gli strati della parete intestinale, le triadi portali del fegato, la polpa rossa della milza e i linfonodi addominali, e l’aspetto di tipo b in cui l’infiltrazione del fegato era di tipo sinusoidale mentre quella splenica riguardava ancora la polpa rossa.

Sebbene questo tipo di linfoma aggressivo a linfociti ampi e granulati sia ancora poco conosciuto, può essere comparato con tre tipi di linfomi umani:

la leucemia/linfoma aggressivo a cellule NK, il linfoma epato-splenico a cellule T e il linfoma di tipo enteropatico a cellule T.

E necessario menzionare altri due lavori che non appaiono in questa tesi ma che sono stati condotti in parallelo dalle stesse persone, a cui ho partecipato senza comparire nella lista degli autori (Rif. 142) e che riguardano sempre l’identificazione di particolari sottotipi di linfomi.

Il primo di questi è un articolo pubblicato su J Vet Diagn Invest (2003) 15:330-337 e s’intitola: “High-grade canine T-cell lymphoma-leukemia with plasmocytoid morphology: a clinical pathological study of nine cases” in cui si determina la presentazione clinica, morfologica e immunofenotipica di 9 casi di un tipo particolare di linfoma/leucemia a cellule T. La presentazione morfologica di questo tipo di linfoma era caratterizzata da un’infiltrazione diffusa di cellule blastiche di taglia variabile con nucleo eccentrico, citoplasma iperbasofilo con area chiara iuxta-nucleare e con aspetto plasmocitoide che faceva sospettare un fenotipo B. Tutti i casi, però, sono risultati essere di fenotipo T (CD3+); in 7 casi si è valutato il sottotipo immunologico e 4 sono risultati CD4-CD8+, 2 CD4+CD8+ e 1 CD4+CD8-.

L’indice medio di proliferazione Ki-67 è risultato 65,7%, per cui questo

linfoma è stato introdotto nel gruppo dei linfomi di grado elevato di malignità.

Questo tipo di linfoma/leucemia è stato diagnosticato in cani di età compresa tra 1 e 11 anni (media di 5,8 anni) e il rapporto maschio/femmina è risultato di 0,8 su una popolazione di riferimento di 1,04. I dati clinici più significativi erano linfoadenopatia generalizzata o localizzata in tutti i casi, presenza di una massa mediastinica (in 4 casi), coinvolgimento midollare (in 7 casi), ipercalcemia (in 4 casi) e un decorso clinico aggressivo con scarsa risposta alla chemioterapia in tutti i casi. La media di sopravvivenza è stata di 3 mesi.

Il secondo lavoro è un articolo pubblicato da Comp Clin Pathol (2003) 12:75-

83 e s’intitola: “Clinical, morphological and immunological study of 13 cases

of canine lymphoblastic lymphoma: comparison with the human entity”. In

questo lavoro si determina la presentazione clinica, morfologica e

immunofenotipica di 13 casi di linfoma linfoblastico. Tale linfoma è stato

diagnosticato in cani di età compresa tra 1 e 10 anni (media di 5,34 anni) con

un rapporto maschio/femmina di 2,25 su una popolazione di riferimento di

1,04 e ciò suggerisce una predilezione del sesso maschile. I dati clinici più

significativi erano la presenza costante di una linfoadenopatia, generalizzata o

localizzata, una massa mediastinica (in 8 casi), coinvolgimento midollare (in

7 casi) e ipercalcemia (in 4 casi). La presentazione morfologica era

caratterizzata dalla presenza di una proliferazione monotona di cellule di

taglia media con nucleo rotondo o leggermente irregolare, cromatina fine,

polverosa, nucleoli non sempre visibili, piccolo citoplasma moderatamente

basofilo e un indice mitotico elevato. Tutti e 13 i casi sono risultati di fenotipo

T (CD3+, CD79a-) con una predominanza (8/10 casi) di fenotipi doppi

positivi (CD4+CD8+) e doppi negativi (CD4-CD8-) per i sottotipi T. Questi

linfomi sono risultati inoltre TdT- così come le normali cellule timiche del

cane. L’indice medio di proliferazione Ki-67 è risultato 45,4%. Se si fa

eccezione per la mancata espressione del TdT, questo tipo di linfoma

linfoblastico sembra molto simile al suo equivalente umano e ciò ci permette

dunque di considerarlo come un’entità distinta di linfoma maligno.

Infine in questo lavoro di ricerca si è voluto comparare l’incidenza di alcuni sottotipi di linfoma (lavoro N°5: “Studio comparativo e prognostico su 135 casi di linfoma nel cane”) nel territorio francese e in quello italiano. Per questo lavoro sono stati raccolti, in un periodo di 9 mesi, 135 casi di linfoma:

70 casi in Francia e 65 in Italia. In entrambi i paesi si è avuta una predominanza di linfomi di fenotipo B (56,9% in Italia e 82,9% in Francia) e di grado elevato di malignità (83% in Italia e 88,5% in Francia), il sottotipo prevalente è risultato essere il centroblastico polimorfo (30,8% in Italia e 50%

in Francia). Da questo lavoro sono emerse differenze significative tra l’incidenza dei sottotipi in Francia e in Italia e ciò implica che probabilmente vi sono importanti variabilità epidemiologiche nelle diverse aree geografiche che possono avere importanti risvolti anche dal punto di vista clinico.

In conclusione, da questo studio emerge l’importanza e la necessità di

continuare ad indagare questo tipo di neoplasia nel cane tenendo conto del

riconoscimento di queste entità distinte, se si vuole migliorare la loro

evoluzione clinica sotto terapia. Tuttavia i nuovi studi dovranno appoggiarsi

su dei dati immunofenotipici molto più precisi, utilizzando anche altri marker

indispensabili per l’identificazione di certi sottotipi di linfoma difficili da

classificare (in particolare i linfomi B a piccole cellule) ma anche sulla

biologia molecolare. Infine sarà essenziale continuare la ricerca

epidemiologica, in quanto il cane, compagno di vita e di abitudini dell’uomo

costituisce un eccellente modello/sentinella per la sorveglianza dei linfomi

non-Hodgkin dell’uomo.

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