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5. DISCUSSIONE
5.1. Premessa
Questo lavoro di tesi nasce da un progetto in collaborazione con il Dott. Paolo Malatesta dell’Istituto Tumori di Genova. L’ipotesi su cui si basa l’intero progetto è che, durante lo sviluppo tumorale dei gliomi, la sovraespressione del PDGF-B possa indurre la perdita dell’inibizione da contatto cellula-cellula e possa promuovere la motilità e l’infiltrazione delle cellule, oltre alla loro proliferazione. Ho condotto i miei esperimenti utilizzando l’organismo Xenopus
laevis, che ha costituito un ottimo modello in vivo per analizzare l’adesione e la
motilità cellulare indotte da una sovraespressione del PDGF-B.
A questo scopo, mi sono inizialmente occupata del clonaggio del cDNA per il
PDGF-B di Xenopus e umano mediante RT-PCR. Successivamente ho inserito
questi due geni in uno specifico vettore di espressione (pCS2+), per preparare mRNA trascritti in vitro da microiniettare in un blastomero di embrioni di
Xenopus a stadio di 2 o 4 cellule. Ciò mi ha permesso di effettuare un’analisi
funzionale di sovraespressione genica del PDGF-B sulla popolazione delle cellule della cresta neurale cranica (NCC). Questa popolazione cellulare costituisce un ottimo sistema modello per studiare gli eventi di motilità cellulare in vivo in quanto queste cellule vanno incontro ad un processo di trasformazione epitelio-mesenchimatica: le cellule della cresta neurale, che hanno inizialmente le caratteristiche di cellule epiteliali, quando iniziano la migrazione, si trasformano in cellule di tipo mesenchimatico, smettono di essere legate alle cellule adiacenti, subiscono un’alterazione dell’espressione delle proteine di adesione (le caderine) e migrano fuori dalla lamina epiteliale. Gli eventi implicati nello sviluppo e nella migrazione di queste cellule sono inoltre regolati dagli stessi meccanismi che regolano i passaggi dal tumore solido alla metastasi.
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5.2. Analisi funzionale del gene PDGF-B sullo sviluppo
delle cellule della cresta neurale
Inizialmente ho condotto esperimenti preliminari microiniettando l’mRNA dell’XPDGF-B o dell’hPDGF-B per individuare le dosi ottimali da microiniettare per evitare che si riscontrassero effetti tossici negli embrioni. Infatti la prima microiniezione dell’hPDGF-B ha avuto come fenotipo degli evidenti difetti di gastrulazione, causati da un’eccessiva espressione dell’mRNA in questione con probabile iperattivazione del recettore PDGFR . Tale recettore è infatti normalmente espresso durante la gastrulazione di Xenopus ed è stato descritto che una sua sovra-attivazione causa difetti di gastrulazione in Xenopus (Ataliotis et al. 1995). Quindi, una volta individuata la dose ottimale, che causava un fenotipo evidente sul comportamento delle creste neurali ma non difetti di gastrulazione, sono passata all’analisi funzionale vera e propria.
Studiando il comportamento delle cellule delle creste neurali a vari stadi di sviluppo, ho potuto confermare che anche in vivo, in un sistema modello altamente dinamico e facilmente manipolabile come quello dell’embrione di
Xenopus laevis nelle prime fasi di sviluppo, la sovraespressione del PDGF-B
influisce sulla proliferazione e la motilità cellulare.
Ho effettuato l’analisi sullo sviluppo delle NCC mediante esperimenti di ibridazione in situ “whole mount” utilizzando marcatori specifici per questa intera popolazione cellulare (FoxD3, Slug, Twist).
E’ stato possibile osservare un diverso effetto della sovraespressione del
PDGF-B a seconda dei territori presuntivi nei quali maggiormente si localizzava
il trascritto microiniettato: microiniezioni in territori che danno origine al mesoderma hanno indotto formazione di creste neurali ectopiche mentre, quando il trascritto si localizza nei territori che danno origine al sistema nervoso e alle creste neurali, si sono potute osservare specifiche alterazioni del
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comportamento di quest’ultime. La gravità delle alterazioni è inoltre correlata alla dose iniettata. In particolare, iniettando bassi dosi del trascritto del
PDGF-B, si osserva che le NCC si formano ai lati della piastra neurale ma la loro
segmentazione in “streams” stereotipati viene compromessa suggerendo un possibile difetto nelle interazioni cellula-cellula. In alcuni embrioni, aumentando le dosi di trascritto, è possibile osservare anche un aumento del dominio di espressione di alcuni marcatori cresta neurale-specifici. Tutti questi fenotipi potrebbero suggerire un possibile ruolo del PDGF-B anche nel regolare la proliferazione di queste cellule come già suggerito per altri tipi cellulari quali gli oligodendrociti, le cellule staminali neurali di origine embrionale e adulta e le cellule del tessuto connettivo (Raines et al. 1990; Betsholtz 1993; Betsholtz et al. 2001). I diversi fenotipi riscontrati a seconda del sito di iniezione suggeriscono inoltre che il PDGF-B possa avere diversi effetti a seconda del tipo cellulare su cui va ad agire.
5.3. Analisi funzionale del gene PDGF-B su specifici
geni che regolano la segmentazione delle NCC
In seguito a esperimenti di guadagno di funzione del PDGF-B, ho analizzato l’espressione dei geni EphrinB2 ed EphB1. Essi sono coinvolti nel mantenimento della stabilità dei compartimenti cellulari, limitando la migrazione delle cellule della cresta neurale. La loro espressione è specifica per determinati rombomeri e sottopopolazioni delle NCC. Non si osserva un’alterata espressione di questi geni, ma un fenotipo caratterizzato da scorretta localizzazione del segnale del marcatore, in corrispondenza del sito di iniezione, ed espansione del dominio di espressione delle NCC che possiamo ipotizzare sia legato ad un fenomeno di iperproliferazione cellulare. Oltre a ciò vi è un fenotipo a carico della posizione dell’occhio e dei rombomeri, che risultano spostati rispetto al lato di controllo. Inoltre le cellule della cresta neurale presentano un forte ritardo nella migrazione, che persiste e rimane
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evidente anche a stadi più tardivi di sviluppo, e addirittura una migrazione completamente disregolata.
Infine ho provato ad esaminare eventuali variazioni delle proteine di adesione e della matrice cellulare mediante i marcatori N-cad ed Has1. Attraverso l’analisi dell’espressione di N-cad ho visto che ancora una volta risultano compromessi gli “streams” migratori delle NCC che in alcuni casi si estendono con una localizzazione scorretta. I livelli di espressione genica della N-caderina rimangono comunque invariati. In corrispondenza del sito di iniezione, laddove si ha la colorazione rossa della ?-gal, ho potuto invece evidenziare una down-regolazione dell’espressione genica di Has1 a livello dell’epidermide, suggerendo che la sovraespressione del PDGF-B potrebbe avere un ruolo nel regolare la produzione di acido ialuronico nella matrice extracellulare modulando la trascrizione di uno dei suoi principali enzimi di sintesi.
5.4. Confronto tra il fenotipo di embrioni
microiniettati con il PDGF-B umano e di Xenopus
Comparando il fenotipo che si ottiene in embrioni di Xenopus microiniettati con il PDGF-B umano e di Xenopus, si può osservare che le alterazioni che si riscontrano sono molto simili, suggerendo la conservazione evolutiva di questo gene. In particolare il fenotipo di fusione degli “streams” migratori delle NCC negli embrioni di Xenopus microiniettati con l’XPDGF-B si riscontra negli embrioni microiniettati con una dose bassa di 50-100 pg/embrione
dell’hPDGF-B. Ciò che risulta però evidente è la differenza nelle percentuali dei fenotipi che
si ottengono microiniettando i due diversi trascritti: iniettando l’hPDGF-B si ottiene una maggiore percentuale di fenotipi rispetto all’XPDGF-B oltre che un fenotipo più grave e marcato.
Dopo aver fatto tutti i dovuti controlli sull’esattezza della sequenza, sull’efficienza di trascrizione del messaggero da iniettare e sulle dosi utilizzate,
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nella parte finale di questa tesi abbiamo deciso di rifare un’analisi retrospettiva delle nostre conoscenze di base su questa sequenza.
La sequenza dell’XPDGF-B su cui erano stati costruiti i “primers” per mettere a punto la PCR e amplificare il nostro gene, è un clone EST trovato nel “database GenBank” comprendente tutta la putativa sequenza del cDNA di
XPDGF-B compreso il 5’ e il 3’ UTR. Abbiamo quindi effettuato l’allineamento
della sequenza del gene PDGF-B di Xenopus laevis con quella di Xenopus
tropicalis, umana e di Gallus gallus. Da questa analisi abbiamo potuto
riscontrate che il sito di inizio della traduzione riportato in GenBank per il
XPDGF-B non corrisponde di fatto alla tripletta codificante per la metionina
iniziale ma per una metionina posta a circa 30 aminoacidi più a valle. Il clone quindi che abbiamo utilizzato nei nostri esperimenti, benché corrispondesse perfettamente a quello descritto in banca dati è risultato in realtà un clone parziale mancante dei primi 26 aminoacidi. E’ quindi probabile che questo clone parziale ci abbia mostrato solo una parte delle alterazioni che possono essere indotte dal PDGF-B e che invece sono state documentate a seguito della sovraespressione del gene umano.
