3. MATERIALI E METODI
3.1 Materiale vegetale
Il materiale vegetale da cui siamo partiti è costituito da due differenti cultivar di uva (Vitis vinifera L.): una varietà a bacca bianca, l’altra a bacca rossa.
Per quanto riguarda l’uva rossa abbiamo scelto un clone di Sangiovese (SS-F9-A5-48), poiché questa cultivar è tipica del territorio regionale toscano.
Nel caso dell’uva bianca, invece, si è scelto di analizzare il Moscato d’Alessandria, una varietà molto aromatica.
L’uva di entrambi i vitigni è stata campionata nella zona di Arezzo, presso un campo sperimentale dell’Unità di Ricerca per la Viticoltura (CRA-VIC). Il vigneto è posizionato nella piana di Arezzo, ad una altitudine di 250 metri s.l.m., la giacitura è pianeggiante ed i filari hanno orientamento nord-sud. È stato impiantato nel 1994 e tutti i vitigni hanno un portainnesto SO4. La densità d’impianto è di 3030 ceppi per ettaro. Le viti sono allevate con un sistema di potatura a cordone speronato.
Sul terreno sono state eseguite diverse analisi chimico-fisiche al momento dell’impianto. I risultati sono riportati nella Tabella 6.
Tab. 6 – Analisi effettuate sul terreno del campo sperimentale da cui provengono i campioni.
TESSITURA Sabbia (%) 14.5 Limo (%) 61.4 Argilla (%) 24.1 PARAMETRI CHIMICI pH 7,0
Capacità di scambio cat. (meq/100g) 10,2
Calcare totale (%) n.d. Calcare attivo (%) <0,01 Sostanza organica (%) 1,09 Azoto totale (%) 0,88 Fosforo assimilabile (ppm) 9,8 Potassio scambiabile (ppm) 64
3.2 Piano di campionamento
Le due varietà di uva sono state raccolte quando il loro contenuto in zuccheri, valutato con un rifrattometro, ha raggiunto un valore pari a 20° ± 1° Brix. Dal filare di ciascuna varietà è stata scelta una pianta ogni cinque, escludendo le prime 10 per evitare l’effetto “bordo”. Da ogni pianta sono stati prelevati 4-5 grappoli, raccogiendoli da posizioni diverse all’interno della chioma (interna, esterna, apicale, basale) in maniera tale da randomizzare le differenze dovute all’esposizione del grappolo. Quest’operazione è stata ripetuta su quattro piante, in modo da ottenere quattro blocchi di campioni per ogni varietà, che rappresentano le nostre repliche.
3.3 Estrazione del succo
I grappoli di ciascuna replica sono stati accuratamente lavati con acqua, asciugati e pesati. Il succo è stato estratto con una centrifuga commerciale (Vita Pro-Active, mod. JE810, Kenwood), utilizzata per la produzione di succhi di frutta e verdura a livello domestico (Fig. 22). Il volume di succo prodotto è stato misurato per ciascuna replica. Prima dell’estrazione alcune bacche, scelte casualmente, sono state prelevate e conservate a -80°C. Questi acini sono stati poi utilizzati per le analisi.
3.4 Conservazione e campionamento dei succhi
Subito dopo la preparazione dal succo ottenuto da ciascuna replica sono state prelevate 40 aliquote da 1,5 ml ciascuna. Metà delle aliquote è stata posta in congelatore, a -20°C; l’altra metà, invece, è stata conservata a +4°C in frigorifero.
Dopo 24 ore sono state prelevate 10 aliquote dal frigorifero e 10 dal congelatore, per essere spostate all’interno di un congelatore a -80°C in modo da arrestare tutte le attività microbiche ed enzimatiche in attesa di poter effettuare le analisi in un secondo momento.
Le rimanenti aliquote sono state invece prelevate dopo 2 settimane di conservazione, per essere stoccate anch’esse a -80°C in attesa dell’analisi.
Il set completo dei campioni di succo è descritto in Tabella 7. Nel caso del blocco di campioni conservati a -20°C, si hanno tre repliche, anziché quattro.
Tab. 7 – Campioni di succhi d’uva analizzati nell’esperimento.
cod. Prova Tempo cod. Prova Tempo
M 1 +4°C 24 ore S 1 +4°C 24 ore M 2 +4°C 24 ore S 2 +4°C 24 ore M 3 +4°C 24 ore S 3 +4°C 24 ore M 4 +4°C 24 ore S 4 +4°C 24 ore M 5 -20°C 24 ore S 5 -20°C 24 ore M 6 -20°C 24 ore S 6 -20°C 24 ore M 7 -20°C 24 ore S 7 -20°C 24 ore M 8 +4°C 2 settimane S 8 +4°C 2 settimane M 9 +4°C 2 settimane S 9 +4°C 2 settimane M 10 +4°C 2 settimane S 10 +4°C 2 settimane M 11 +4°C 2 settimane S 11 +4°C 2 settimane M 12 -20°C 2 settimane S 12 -20°C 2 settimane M 13 -20°C 2 settimane S 13 -20°C 2 settimane M 14 -20°C 2 settimane S 14 -20°C 2 settimane M 15 -20°C 2 settimane S 15 -20°C 2 settimane
3.5 Reagenti utilizzati
Tutti i prodotti chimici utilizzati (acido gallico, catechina, trolox, reagente Folin-Ciocalteau, tirosina, DPPH, DMACA, cloruro di allumino, nitrito di sodio, sodio-carbonato, metanolo e tampone fosfato) sono stati acquistati dalla Sigma Aldrich (Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Le soluzioni acquose sono state preparate con acqua purificata dal sistema Milli-Q (Milli-Q System, Milano, Italia).
3.6 Estrazione delle sostanze fenoliche dall’uva
I composti fenolici sono stati estratti da tre dei quattro blocchi di uva campionata per ciascuna varietà (n=3).
Alcuni acini (conservati a -80°C) sono stati successivamente tagliati in 4 parti e pesati (circa 15 grammi) prima di essere posti all’interno di una Falcon da 50 ml (Fig. 23). Successivamente sono stati posti in liofilizzatore (Edwards Mini-Fast mod 1700, Edwards Alto Vuoto s.p.a., Milano) per eliminare l’acqua senza danneggiare i polifenoli.
Fig. 23 – Preparazione dei campioni di uva per l’estrazione.
Parallelamente è stato determinato il peso secco dei campioni prelevando e pesando alcuni acini e ponendoli in stufa a 60°C fino a peso costante.
Una volta liofilizzati i campioni sono stati pestati in un mortaio aggiungendo azoto liquido per ridurli finemente in polvere. Sono stati pesati circa 200 mg di liofilizzato per effettuare l’estrazione utilizzando una soluzione di metanolo acquoso all’80% (V/V).
L’estrazione è stata condotta aggiungendo 30 ml di solvente estraente. La soluzione ottenuta è stata lasciata in agitazione al buio per 30’ all’interno di un beaker coperto con parafilm. A questo punto è stata centrifugata utilizzando una ultracentrifuga Beckman J2-21 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) a 13.000 r.p.m., per 15 minuti, a 4°C.
Il solvente è stato recuperato e conservato in frigo in un beaker. Il pellet, invece, è stato risospeso in 30 ml di soluzione estraente per ripetere la stessa procedura già descritta. Un’ultima estrazione è stata fatta sul precipitato residuato dalla seconda centrifugazione. I tre estratti sono stati infine riuniti ottenendo un volume finale di circa 90 ml.
Gli estratti così ottenuti sono stati versati all’interno di un pallone di vetro da 250 ml e portati a secco con un rotavapor (Büchi, Flawil, Switzerland), per essere poi risospesi in 12 ml di metanolo puro (Fig. 24). Infine sono stati suddivisi in aliquote e stoccati a -20°C in attesa di essere analizzati.
3.7 Analisi effettuate
Sugli estratti così ottenuti sono state determinate le seguenti classi di composti: i fenoli totali, i flavonoidi totali ed i flavan-3-oli. Tali determinazioni sono state effettuate per via spettrofotometrica utilizzando uno spettrofotometro UV/Visibile Ultrospec 2100 Pro (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Per i bianchi è stato utilizzato metanolo puro, nel caso degli estratti d’uva, ed acqua distillata per i succhi di uva. Per ogni campione sono state fatte tre repliche ed è stata calcolata l’assorbanza media.
L’attività antiossidante è stata invece valutata utilizzando il test del DPPH ed il test di inibizione della nitrazione della nitrotirosina (test del perossinitrito).
Tutte le analisi sono state eseguite sia sugli estratti ottenuti dai campioni di uva, sia sui succhi di frutta. Per questi ultimi non è stata effettuata alcuna procedura di estrazione dei composti fenolici. Prima dell’analisi i campioni di succo sono stati scongelati e centrifugati in una centrifuga Beckman Avanti 30 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA), a 15.000 r.p.m. per 15 minuti, a 4°C. Il pellet è stato eliminato e per le analisi è stato utilizzato solamente il surnatante limpido. È stata scelta questa procedura basandosi sulle informazioni disponibili nella letteratura scientifica (Gil et al., 2000; Klimeczak et al., 2007; Mousavinejad et al., 2009).
3.7.1 Determinazione dei fenoli totali
I fenoli totali sono stati quantificati con il metodo Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi, 1965) adattato ai nostri campioni, in accordo con la procedura descritta da Barbolan (Barbolan et al., 2003).
In una cuvetta in plastica da 4 ml si aggiungono nell’ordine: 250 µl di acqua distillata;
25 µl di campione;
altri 1000 µl di acqua distillata;
125 µl di reattivo Folin-Ciocalteau (attendere 8 minuti); 500 µl di una soluzione acquosa di Na2CO3 al 20%; 600 µl di acqua distillata.
A questo punto si copre la cuvetta con parafilm e si agita utilizzando un vortex, prima di incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente per assicurare il completamento della reazione colorimetrica (Fig. 25).
Si legge quindi l’assorbanza a 750 nm e si quantificano i fenoli totali esprimendoli come mg equivalenti di acido gallico per litro di soluzione. Per questo occorre costruire una retta di taratura con soluzioni a diversa concentrazione di acido gallico (Fig. 26).
Fig. 25 – Reazione del Folin-Ciocalteau con soluzioni a concentrazione crescente di acido gallico.
Fig. 26 – Retta di taratura per la quantificazione dei fenoli totali. A destra è riportata l’equazione.
y = 0,0012x R² = 0,9973 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 A ss o r b a n z a ( A .U .)
Concentrazione di acido gallico (mg/l)
3.7.2 Determinazione dei flavonoidi totali
I flavonoidi totali sono stati quantificati in accordo con il metodo di Kim (Kim et al., 2003). In una cuvetta in plastica da 1,5 ml si aggiungono:
100 µl di campione estratto;
60 µl NaNO2 acquoso al 5% (attendere 5 minuti); 40 µl di AlCl3 acquoso al 10% (attendere 5 minuti); 400 µl NaOH 1M;
200 µl di acqua distillata.
Lo sviluppo di una colorazione giallo-arancio (Fig. 27) permette di quantificare i flavonoidi totali tramite lettura dell’assorbanza a 510 nm. La loro concentrazione si esprime come mg equivalenti di catechina per litro di campione, dopo aver costruito la retta di taratura (Fig. 28).
Fig. 27 – Reazione colorimetrica per la quantificazione dei flavonoidi totali.
Fig. 28 – Retta di taratura per la quantificazione dei flavonoidi totali. y = 0,0035x R² = 0,9946 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 50 100 150 200 250 300 350 400 A ss or ba nz a (A .U .) Concentrazione di catechina (mg/l)
3.7.3 Determinazione dei flavan-3-oli
I flavan-3-oli sono stati determinati sfruttando la loro capacità di reagire con la para-dimetil-cinnamaldeide (DMACA) formando un complesso di colore verde intenso (Fig. 29). Il protocollo seguito è quello descritto da Nagel e Glories (1991). In una cuvetta sono stati aggiunti:
100 µl di campione estratto; 250 µl di HCl 0,24 N in metanolo;
250 µl di soluzione DMACA 0,2% in metanolo.
Le cuvette sono state chiuse con parafilm ed agitate e si è atteso lo sviluppo della colorazione incubando per 30 minuti a temperatura ambiente. Il contenuto di flavan-3-oli è stato espresso come mg equivalenti di catechina (Fig. 30), determinati dopo lettura spettrofotometrica a 640 nm.
Fig. 29 – Colorazione sviluppata dalla reazione tra flavan-3-oli e DMACA.
Fig. 30 – Retta di taratura per la quantificazione dei flavan-3-oli.
y = 0,0241x R² = 0,9984 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 A ss o rb a n za ( A .U .) Concentrazione di catechina (mg/l)
3.7.4 Test del DPPH˙
Il DPPH˙ (2,2-difenil-1-picril-idrazil-radicale) è un radicale sintetico stabile. Utilizzando questa molecola è possibile valutare l’azione di scavenging di un campione contenente delle molecole antiossidanti (Brand-Williams et al., 1995). In pratica è possibile determinare quale percentuale di questo composto viene ridotta in seguito all’azione antiossidante dei polifenoli presenti nel campione, secondo la reazione: DPPH˙ + AH DPPH-H + A˙. La specie radicalica mostra un’intensa colorazione viola, che scompare quando viene ridotta per azione della molecola antiossidante (Fig. 31). Dal decadimento dell’assorbanza a 515 nm è possibile quantificare la percentuale di DPPH che viene ridotto dal campione.
All’interno di una cuvetta in plastica da 4 ml si versano 3 ml di una soluzione 60 µM di DPPH˙ in metanolo, preparata prima di eseguire l’analisi a partire da una soluzione madre concentrata e conservata a -20°C per limitare la degradazione spontanea del radicale; a questa soluzione si aggiungono:
77 µl di acqua o metanolo, a seconda del campione da analizzare (succo o estratto di uva), per la preparazione del bianco;
77 µl di campione (tre repliche per ogni campione).
Si copre la cuvetta con parafilm, si agita e si legge l’assorbanza a 515 nm con uno spettrofotometro UV-Vis Agilent HP-8453 (Agilent, Palo Alto, CA, USA).
L’assorbanza di ciascun campione viene misurata dopo 5, 20, 40, 60, 90 e 120 minuti dall’aggiunta dello stesso al DPPH˙. L’assorbanza del bianco rappresenta il 100% di DPPH˙ prima della reazione.
NO
·+ O
·-
ONOO
-2
3.7.5 Test del perossinitrito
Il test del perossinitrito valuta, analogamente al test del DPPH, la capacità di scavenging di un campione che contiene molecole antiossidanti. In questo caso, però, si utilizza il perossinitrito (ONOO-), una specie chimica citotossica che si produce all’interno delle cellule e forma specie radicaliche molto dannose.
Il perossinitrito è un anione che si genera nei sistemi biologici quando l'ossido nitrico (NO), prodotto dalla Ossido Nitrico Sintetasi (NOS), reagisce con l'anione superossido (che può prodursi nel mitocondrio durante la respirazione) in concentrazioni equimolari secondo la reazione:
Quest’anione si decompone velocemente in due specie radicaliche altamente reattive: l’OH˙ (radicale idrossilico) e l’NO2˙ (radicale perossinitrile), che attaccano tutte le molecole biologiche, compreso il DNA (Viràg et al., 2003). L'attività ossidante di ONOO- si esplica soprattutto a carico delle molecole aromatiche, come i composti fenolici. Tra questi è inclusa la tirosina (Szabó, 2003), sia libera che all’interno della struttura proteica, dove l'azione dell'anione porta alla formazione di prodotti nitrati, idrossilati e dimerici (Fig. 32).
Fig. 32 – Nitrazione della tirosina per azione dei radicali prodotti dal perossinitrito.
Il test del perossinitrito permette di misurare in maniera indiretta la quantità di perossinitrito che viene inattivato dagli antiossidanti del nostro campione.
Si misura infatti la quantità di nitrotirosina prodotta a partire da una concentrazione nota di tirosina (1mM), a cui viene aggiunta una quantità nota di perossinitrito (1mM) ed il nostro campione (Althaus et al., 2000). La presenza di una specie antiossidante riduce la formazione della nitrotirosina.
La procedura sperimentale da seguire per l’effettuazione del test è piuttosto complicata e richiede diversi passaggi.
I) Sintesi del perossinitrito (Beckman et al., 1994) Reattivi:
25 ml di NaNO2 0,6 M
H2O2 0,6 M (diluendola in 12,5 ml di HCl 0,7 M) 12,5 ml di NaOH 1,2 M
Sintesi:
- mettere all’interno di una Falcon da 50 ml la soluzione di nitrito di sodio e raffreddarla in ghiaccio;
- unire in rapida successione la soluzione acida di acqua ossigenata e la soda;
- la soluzione ottenuta, di colore giallo intenso, deve essere subito conservata a -80°C per limitare la degradazione del perossinitrito formato.
II) Preparazione del campione Reattivi:
Soluzione 2 mM di tirosina in acqua distillata, preparata di fresco e ben solubilizzata utilizzando un sonicatore;
Tampone fosfato a pH 7,3;
Soluzione acquosa di NaHCO3 50 mM. Misura della concentrazione del perossinitrito:
Ogni mattina, prima di cominciare l’analisi, si preleva dal -80°C il perossinitrito sintetizzato e si raccolgono 400-500 µl della prima frazione liquida che si scongela (poiché è più concentrata). Si prepara una soluzione 1:1000 di perossinitrito in soda acquosa 1,2 M e si legge l’assorbanza della soluzione ottenuta a 302 nm. Conoscendo il coefficiente di estinzione molare dell’ONOO- a questa lunghezza d’onda (1670 mol-1 l cm-1) si può ricavare, dalla relazione di Lambert-Beer, la concentrazione del perossinitrito nell’aliquota prelevata (da utilizzare per definire il protocollo).
Protocollo per la preparazione dei campioni: in una Falcon da 15 ml aggiungere: • 1,000 ml di soluzione di tirosina;
• 400 µl di bicarbonato; • 50 µl di campione;
• un volume x di perossinitrito tale che la sua concentrazione nel volume finale (pari a 2,000 ml) sia pari a 1 mM *;
• portare il volume finale a 2,000 ml aggiungendo un’opportuna quantità di tampone fosfato (V= 2.000 – 0.050 – 0.400 – 1.000 – x);
• * il perossinitrito è l’ultima cosa da aggiungere e si fa tenendo in agitazione su un vortex la provetta con tutti gli altri reattivi ed il campione per distribuirlo uniformemente (Fig. 33);
• i campioni così preparati sono stabili e si possono conservare per tutta la giornata in attesa di essere iniettati nell’HPLC;
• per ogni campione si preparano almeno due repliche e nel corso della giornata si misurano almeno due bianchi per verificare l’accuratezza dello strumento e la stabilità delle soluzioni di nitrotirosina.
Il perossinitrito aggiunto reagirà con la tirosina formando la 3-nitrotirosina, ma grazie alla presenza del campione, che contiene le molecole antiossidanti, una parte dei radicali generati dall’anione sarà inattivata prima di legarsi alla tirosina.
III) Quantificazione della 3-nitrotirosina mediante HPLC: Reattivi:
Tampone fosfato a pH 3,36 Metanolo puro per HPLC Strumentazione HPLC:
• Dionex P 680 con pompe integrate (Dionex,Germany);
• detector Dionex UVD 170U/340U UV/VIS (Dionex,Germany);
• colonna C-18 a fase inversa (Acclaim 120, 5 mm, 4.6 x 250 mm, Dionex); • colonna di guardia (Acclaim 120, 5 mm, 4.3 x 10 mm, Dionex);
• software Chromeleon 6.5 (Dionex,Germany). Corsa HPLC:
• Flusso costante impostato a 1 ml/min;
• Eluizione con gradiente isocratico 92% tampone fosfato + 8% metanolo; • Volume di iniezione pari a 20 µl;
• Detector impostato a 365 nm (λ di assorbimento della nitrotirosina).
Analisi del cromatogramma:
La 3-nitrotirosina, nelle condizioni di corsa considerate, ha un tempo di ritenzione di 18 minuti circa. Sul cromatogramma si avrà un picco, la cui area è correlabile alla concentrazione di questo composto.
L'attività antiossidante dei campioni in esame viene valutata come la capacità di inibire la formazione della nitrotirosina in seguito all'esposizione della tirosina libera all'agente nitrante perossinitrito. La quantificazione del potere antiossidante viene effettuata calcolando la percentuale di riduzione della nitrotirosina prodotta, dove il bianco costituisce il 100% di formazione.
L’attività antiossidante si esprime come equivalenti di Trolox (una molecola sintetica idrosolubile analoga al tocoferolo) costruendo una curva di taratura che misura l’effetto di soluzioni di Trolox a concentrazione nota nel ridurre la formazione di nitrotirosina (Fig. 34).
Fig. 34 – Curva di taratura per il test del perossinitrito, per esprimere la riduzione della nitrotirosina in equivalenti di Trolox..
3.8 Analisi statistica
L’analisi statistica dei dati è stata eseguita utilizzando la versione 6.400 del programma CoStat (CoHort Software, Moterey, CA, USA), il software Statistica (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) ed il programma Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA).
I dati sono stati analizzati mediante analisi della varianza (ANOVA) ad una via, secondo il test di Fischer sulle differenze minime significative (LSD-test) per evidenziare le differenze dovute ai trattamenti di conservazione. È stata eseguita anche l’ANOVA a due vie per valutare gli effetti di cultivar e temperatura, nonché la loro interazione. In questo caso è stato utilizzato il test di Tukey’s HSD, con P = 0.05. Tutte le analisi statistiche sono state condotte impostando un intervallo di confidenza maggiore del 95% (P < 0.05).
Per ogni analisi effettuata i valori riportati nelle tabelle e nelle figure indicano la media ± la deviazione standard di tre repliche, nel caso dei campioni di uva, e di quattro repliche per i campioni di succhi (tranne per il trattamento di conservazione a -20°C per 24 ore, in cui si hanno solamente tre repliche per entarmbe le cultivar).
