C MATERIALI E METODI

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Maurizia Pallante Monitoraggio della parassitofauna nelle specie ittiche del Lago di Massaciuccoli (Toscana, Italia)

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C

AMPIONAMENTO

Il campionamento si è svolto nell’arco di tempo di un anno, che va dall’Autunno 2005 all’Estate 2006.

In ogni stagione sono state effettuate 2 catture, per un totale di 8 campionamenti.

Figura 59 - Il nostro pescatore, Sig. Lombardi (M. Pallante).

Al fine di valutare il metodo di campionamento più idoneo al nostro studio, nell’Estate immediatamente precedente è stata effettuata una prova preliminare, anch’essa costituita da 2 pescate.

Durante lo studio preliminare, le catture dei pesci sono state effettuate in 2 modi diversi, di seguito riassunti in tabella.

Studio preliminare

Data Cattura Tipo di Pesca

23/06/2005 1 Canna dal barchino

28/07/2005 3 Reti, localmente

chiamate “Paretoni” Misure: 50 x 3 m Maglia: 40 mm

Tabella 18 - Studio preliminare.

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Successivamente è sempre stata adottata la cattura a mezzo di reti, collocate all'interno dell'area del Padule di Massaciuccoli (Canali: Centralino, Punta Grande e Fosso Morto), come indicato in Figura 60.

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A

TTIVITÀ DI

L

ABORATORIO

Una volta effettuate le catture, il materiale ittico è stato analizzato presso il Laboratorio di Parassitologia del Dipartimento di Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti della Facoltà di Medicina Veterinaria dell’Università di Pisa.

I campioni sono pervenuti presso il laboratorio ancora vivi all'interno di sacchi di plastica con l'acqua di provenienza, sono stati eutanasizzati con MS 252 in sovradosaggio e successivamente spinalizzati. In seguito sono stati rapidamente analizzati, per evitare che la morte determinasse l’alterazione dei tessuti e soprattutto l’allontanamento di eventuali parassiti dal corpo del pesce.

Le attività svolte sono di seguito elencate (Tabella 19): - Identificazione dei campioni

E' stata effettuata mediante le chiavi dicotomiche fornite da Bruno e Maugeri (1992)[57]_{e da Gandolfi et al. (1991)}[27]_.

Figura 61 - Biometrie dei campioni (M. Pallante).

- Determinazione lunghezza totale

Questo parametro, approssimato al millimetro inferiore[41], è stato misurato partendo dall’apice della bocca e terminando sull’estremità più lunga della pinna caudale. Per la misurazione è stato utilizzato un ittiometro con precisione +/-1 mm[58];

- Determinazione peso totale

E' stata eseguita con l'ausilio di una bilancia di precisione, con portata massima di 5 Kg e precisione di +/-1g;

- Esame parassitologico a fresco

I soggetti sono stati esaminati dapprima macroscopicamente, attraverso un'accurata osservazione delle superfici esterne del corpo, della pelle, delle pinne, delle fossette nasali e delle branchie, al fine di evidenziare eventuali alterazioni cutanee e/o la presenza di ectoparassiti.

L'esame parassitologico è stato condotto su cute, branchie, cristallini degli occhi, fegato ed intestino.

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CUTE

Campioni di muco, raschiati dalla pelle e dalle branchie con un vetrino coprioggetto e posti poi su un vetrino portaoggetto, sono stati osservati al microscopio a diversi ingrandimenti. Sono stati raschiati vari punti della superficie corporea (la base delle pinne, i lati del corpo, il ventre, etc.) poiché la distribuzione dei parassiti sull’ospite può non essere uniforme. Anche le superfici interne degli opercoli, nicchie specifiche per alcuni parassiti, sono state accuratamente esaminate.

BRANCHIE

Si è poi proceduto a prelevare gli archi branchiali, posti in capsule Petri ed osservati allo stereomicroscopio con l’aiuto di aghi da dissezione, per verificare l’eventuale presenza di monogenei.

I parassiti reperiti sono stati prelevati ed in parte esaminati immediatamente al microscopio ottico e in parte conservati in provette con alcool a 70°+5% di glicerina per poterne effettuare, in un secondo momento, l'identificazione.

Una porzione di branchia di ogni pesce è stata posta su un vetrino con coprioggetto ed esaminata al microscopio a 10, 40 e 100x per verificare o meno la presenza di protozoi o metazoi parassiti.

CRISTALLINO

Il cristallino è stato asportato ed esaminato allo stereomicroscopio, per evidenziare l'eventuale presenza di metacercarie.

FEGATO

Gli organi interni sono stati esaminati, previa apertura della cavità celomatica, tramite incisione ventrale a partire dall’ano fino al cuore e successiva rimozione di una delle pareti corporee. Dopo una prima ispezione visiva della cavità celomatica, sono stati esaminati dei preparati a fresco, schiacciando piccole porzioni di organi (circa 3mm di diametro) tra vetrino portaoggetto e coprioggetto, o tra due vetrini portaoggetto a seconda della consistenza del reperto da esaminare.

L’osservazione microscopica è stata effettuata a 40 e 100x, ripetendo l’esame almeno due volte per organo e per soggetto.

INTESTINO

Il tratto intestinale è stato aperto e raschiato; si è poi proceduto all'osservazione microscopica sia del raschiato che di ogni singola porzione gastro-intestinale.

- Esame delle gonadi

L'osservazione macroscopica delle gonadi ha permesso di effettuare il riconoscimento sessuale di ciascun campione, al fine di calcolare successivamente il "Rapporto sessi".

- Identificazione dei parassiti

L'identificazione dei parassiti isolati è stata effettuata utilizzando le seguenti chiavi dicotomiche:

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- Kabata (1988) per i Crostacei[59]; - Lom e Dykova (1992) per i Protozoi[60]; - Yamaguti (1963) per i Monogenei[61]; - Moravec (1994) per i Nematodi[62].

Resoconto dei parametri presi in considerazione durante l'indagine

ID Data Stagione Specie Lunghezza (cm) Peso (gr) Sesso Parassiti

1 24/11/2005 Autunno Carassio 28 547 Femmina No 2 24/11/2005 Autunno Carassio 33 770 Femmina Si 3 24/11/2005 Autunno Carassio 29,5 542 Femmina No 4 24/11/2005 Autunno Carassio 26 370 Femmina No 5 24/11/2005 Autunno Carassio 25,5 460 Femmina No 6 24/11/2005 Autunno Carassio 27,5 480 Femmina No 7 24/11/2005 Autunno Carassio 28 612 Femmina Si 8 24/11/2005 Autunno Carassio 25,5 314 Femmina Si 9 19/12/2005 Autunno Carassio 28 566 Femmina Si 10 19/12/2005 Autunno Carassio 25 330 Femmina Si 11 19/12/2005 Autunno Carpa 30 348 Maschio Si 12 19/12/2005 Autunno Carassio 25 332 Femmina No 13 19/12/2005 Autunno Carassio 27 440 Femmina No 14 19/12/2005 Autunno Carassio 30 590 Femmina No 15 19/12/2005 Autunno Carassio 24 340 Maschio No 16 19/12/2005 Autunno Carassio 29 554 Maschio No 17 19/12/2005 Autunno Carpa 29 280 Maschio No 18 26/01/2006 Inverno Cefalo 35 391 Femmina No 19 26/01/2006 Inverno Cefalo 35,5 375 Maschio No 20 26/01/2006 Inverno Cefalo 32 315 Femmina Si 21 26/01/2006 Inverno Carassio 26 388 Femmina No 25 26/01/2006 Inverno Carassio 24 250 Femmina No 23 26/01/2006 Inverno Carassio 25 314 Femmina No 24 26/01/2006 Inverno Carpa 30 442 Femmina Si 25 09/03/2006 Inverno Carassio 31 590 Femmina No 26 09/03/2006 Inverno Carassio 23 300 Femmina No 27 09/03/2006 Inverno Carassio 21 248 Femmina No 28 09/03/2006 Inverno Carassio 31 720 Femmina No 29 09/03/2006 Inverno Carassio 31 812 Femmina No 30 09/03/2006 Inverno Carassio 21 330 Femmina No 31 09/03/2006 Inverno Carassio 30 780 Femmina No 32 12/04/2006 Primavera Carassio 32 662 Femmina Si 33 12/04/2006 Primavera Carassio 28 532 Femmina Si 34 12/04/2006 Primavera Carassio 26 374 Femmina No

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35 12/04/2006 Primavera Carassio 30 536 Femmina Si 36 12/04/2006 Primavera Carassio 30 650 Femmina No 37 12/04/2006 Primavera Carpa 30 500 Femmina Si 38 12/04/2006 Primavera Carpa 34 608 Femmina Si 39 12/04/2006 Primavera Carpa 36,5 696 Femmina No 40 12/04/2006 Primavera Pesce gatto 25 140 Femmina No 41 12/04/2006 Primavera Pesce gatto 20 100 Femmina No 42 12/04/2006 Primavera Pesce gatto 19 88 Femmina No 43 12/04/2006 Primavera Pesce gatto 20 100 Femmina No 44 12/04/2006 Primavera Pesce gatto 17,5 65 Femmina Si 45 12/04/2006 Primavera Pesce gatto 17,5 62 Femmina No 46 12/04/2006 Primavera Pesce gatto 17 50 Femmina No 47 17/06/2006 Primavera Cefalo 37 666 Femmina No 48 17/06/2006 Primavera Cefalo 36 492 Maschio No 49 17/06/2006 Primavera Cefalo 30 250 Maschio No 50 17/06/2006 Primavera Cefalo 31 326 Maschio No 51 17/06/2006 Primavera Cefalo 31 346 Maschio No 52 17/06/2006 Primavera Carpa 24 428 Maschio Si 53 17/06/2006 Primavera Carpa 30 390 Maschio Si 54 17/06/2006 Primavera Carassio 28 390 Femmina No 55 17/06/2006 Primavera Carassio 38 292 Femmina Si 56 17/06/2006 Primavera Carassio 30 440 Femmina No 57 17/06/2006 Primavera Carassio 28 380 Femmina No 58 17/06/2006 Primavera Carassio 20 152 Femmina Si 59 17/06/2006 Primavera Pesce gatto 20 92 Maschio No 60 17/06/2006 Primavera Pesce gatto 19 96 Maschio No 61 17/06/2006 Primavera Pesce gatto 20 102 Femmina No 62 17/06/2006 Primavera Pesce gatto 18 76 Maschio Si 63 17/06/2006 Primavera Pesce gatto 18 80 Maschio No 64 27/07/2006 Estate Carassio 30,5 628 Maschio Si 65 27/07/2006 Estate Carassio 28,5 494 Maschio No 66 27/07/2006 Estate Carassio 31 648 Femmina Si 67 27/07/2006 Estate Carassio 25 362 Maschio Si 68 27/07/2006 Estate Carassio 24 438 Femmina Si 69 27/07/2006 Estate Carassio 26 464 Maschio Si 70 27/07/2006 Estate Carassio 27,5 536 Maschio No 71 27/07/2006 Estate Carassio 25 236 Femmina Si 72 27/07/2006 Estate Carpa 29 428 Femmina Si 73 27/07/2006 Estate Carpa 29 425 Femmina Si 74 27/07/2006 Estate Carpa 27 252 Femmina Si

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75 27/07/2006 Estate Carpa 32 496 Femmina Si 76 27/07/2006 Estate Carpa 28,5 514 Maschio Si 77 29/08/2006 Estate Carassio 32 714 Femmina Si 78 29/08/2006 Estate Carassio 31 710 Maschio Si 79 29/08/2006 Estate Carassio 28 690 Femmina Si 80 29/08/2006 Estate Carassio 30 490 Maschio Si 81 29/08/2006 Estate Carassio 33 530 Maschio Si 82 29/08/2006 Estate Carassio 35 660 Femmina Si 83 29/08/2006 Estate Carassio 29 420 Femmina Si 84 29/08/2006 Estate Carassio 21 250 Femmina No 85 29/08/2006 Estate Carassio 28 410 Femmina Si 86 29/08/2006 Estate Carassio 33 590 Femmina Si 87 29/08/2006 Estate Carassio 33 740 Femmina Si 88 29/08/2006 Estate Carassio 34 600 Femmina Si 89 29/08/2006 Estate Carpa 32 410 Maschio Si 90 29/08/2006 Estate Carpa 23 230 Femmina No 91 29/08/2006 Estate Scardola 16 75 Maschio No 92 29/08/2006 Estate Pesce gatto 20 105 Femmina No

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E

LABORAZIONE

D

ATI

Il campione è stato suddiviso in sottogruppi, in corrispondenza delle diverse specie ittiche.

Nella prima parte del lavoro è stato effettuato uno studio osservazionale sulle specie ittiche pescate nel lago, con lo scopo di appurarne le condizioni di benessere o di eventuale stress, rispetto alle quali sono stati poi elaborati i dati parassitologici raccolti.

Si è quindi proceduto ad una prima analisi descrittiva rispetto all’intero campione, calcolandone:

- La distribuzione per sesso, con il rapporto F/M; - La distribuzione per stagione di pesca;

- La descrizione delle caratteristiche morfologiche, Lunghezza e Peso, avvalendosi di alcune statistiche riassuntive, quali:

- Media;

- Deviazione Standard;

- Coefficiente di correlazione Lunghezza-Peso per ranghi di Spearman. Si tratta di un coefficiente di tipo non parametrico, che quindi non richiede un’ipotesi di normalità delle distribuzioni delle variabili oggetto d’analisi rispetto alla popolazione indagata. Tale ipotesi, infatti, data l’esigua numerosità del campione, non sarebbe attendibile;

- Test t di Student, applicato per valutare la veridicità della relazione tra Lunghezza e Peso.

A causa della ridotta quantità dei campioni appartenenti agli altri sottogruppi, è stato possibile condurre un’analisi più approfondita sulla sola specie del Carassio, valutandone la rappresentatività rispetto alla popolazione, con particolare riguardo al rapporto tra i sessi ed alle caratteristiche morfologiche.

Per quanto riguarda il rapporto tra i sessi, è stato calcolato il rapporto F/M e verificata la significatività della differenza tra i sessi riscontrata nel campione, rispetto ad un ipotetico valore di 1:1, applicando il test del χ2 (livello di significatività 95%) con 1 grado di libertà ν: [χ2_{=Σ (freq. osservate – freq. attese)}2_{/freq. attese].}

Successivamente è stato valutato lo stato di benessere dei campioni, effettuando: - Il calcolo dell’indice di condizione K[13, 63]. Questo indice esprime lo stato

nutrizionale e di benessere di ciascun pesce e si calcola con la seguente formula: [(peso (g)/(lunghezza (cm))3)*100];

- Il calcolo dell’indice medio stratificato per sesso e stagione di pesca;

- Il calcolo della curva di accrescimento ponderale[13], come funzione interpolante rispetto alle nuvole dei punti risultanti dai diagrammi a dispersione del sottogruppo del Carassio, sempre rispetto alla stagione di pesca ed al sesso. Tale calcolo è stato eseguito al fine di verificare l’attendibilità di un ipotesi di “Crescita perfettamente isometrica”;

Nella seconda parte del lavoro è stato effettuato uno studio descrittivo delle popolazioni di parassiti rilevati sugli ospiti dell’intero campione, per poi procedere, sempre per ragioni numeriche, ad un’analisi più approfondita della comunità di parassiti rispetto alla sola specie del Carassio.

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Lo studio descrittivo ha contemplato la formulazione di un elenco delle specie di parassiti rilevati, suddiviso per specie ittica, ed il calcolo delle distribuzioni dell’intensità di infestazione per specie ospite.

Per eseguire l’analisi della comunità parassitaria sono stati calcolati gli indici ecologici proposti da Margolis et al. (1982)[38] e da Bush et al. (1997)[64], applicati a ciascuna specie di parassita e con il relativo calcolo dell'intervallo di confidenza[41]_:

- Prevalenza. Questo indice si calcola dividendo il numero di individui di una specie ospite infestati da una specie parassitaria per il numero totale degli esemplari della specie ospite esaminati; si esprime in percentuale: [(n° ospiti infestati/n° tot ospiti)*100];

- Abbondanza. Esprime il rapporto percentuale fra gli individui delle specie parassitate ed il numero totale di ospiti esaminati: [(n° tot parassiti rilevati/n° tot di ospiti)*100];

- Intensità Media.E' il rapporto fra il numero totale degli individui di una determinata specie parassitaria in un campione ed il numero degli individui infestati da quella specie all’interno del campione: [n° parassiti rilevati/n° ospiti infestati].

Sempre in ragione della numerosità, per la sola specie del Carassio, è stato calcolato il coefficiente di correlazione per ranghi di Spearman per l’analisi della relazione tra intensità della carica parassitaria di Lernaea cyprinacea (l’unica specie parassitaria con un’adeguata prevalenza) e taglia dell’ospite. La significatività di tale relazione è stata poi verificata con l’ausilio del Test t di Student.

Infine è stata effettuata l’analisi della comunità parassitaria sulla sola specie del Carassio, valutando le caratteristiche della Infracommunity e della Component

community[41] ove per Infracommunity si intende la comunità parassitaria che vive su di

un individuo ospite, mentre per Component community l’insieme delle Infracommunities degli ospiti appartenenti ad una specie in un determinato ambiente[41,

64, 65]_{. Per l’analisi dell’Infracommunity sono stati calcolati il:}

- Numero medio di parassiti per ospite;

- Numero medio di specie parassitarie per ospite; - Numero medio di endoparassiti per ospite; - Numero medio di ectoparassiti per ospite.

Per l’analisi della Component community sono stati calcolati i seguenti indici: - L’indice di ricchezza in specie di Margalef (d):

d=(S-1)/logN S = n° specie parassiti

N = N° individui - L’indice di dominanza di Simpson (c):

c=Σ(ni/N)2

ni = dimensione di ciascuna specie (numero)

N = dimensione totale della comunità

Le elaborazioni statistiche sono state realizzate mediante il software STATA9/SE della Statacorp.