Tripanosomosi Africana
Philum Sarcomastigophora Classe Zoomastigophore Ordine Kinetoplastida
Famiglia Trypanosomatidae Genere Trypanosoma
Sezione SALIVARIA
Epidemiologia
50 milioni di persone a rischio
<20% sotto sorveglianza 20,000 nuovi casi/anno
epidemie periodiche e devastanti
200 foci endemici
Tripanosomosi Africana
Distribuzione
§ Trypanosoma brucei gambiense
§ Trypanosoma brucei rhodesiense
§ Trypanosoma brucei brucei
(agente eziologico del “nagana”-malattia dei ruminanti)
Tripanosomi africani :
T.b.gambiense
Diffuso nelle zone umide fluviali dell’Africa centro- occidentale
VETTORE: Glossina palpalis che vive in ambienti umidi SERBATOI: - uomo
- maiale
T.b.rhodesiense
Diffuso nelle savane delle regioni africane sudorientali VETTORE: Glossina morsitans che vive in zone secche SERBATOI: - diverse specie animali (insetti zoofili) - solo occasionalmente l’uomo
EPIDEMIOLOGIA
Trypanosoma brucei gambiense
E’ diffuso nell’Africa centro occidentale e si distingue in due sottopopolazioni:
gruppoI -limitata variabilità genetica
-bassa virulenza negli animali di laboratorio
gruppoII - maggiore variabilità genetica
-media virulenza negli animali di laboratorio
Trypanosoma brucei rhodesiense
E’ diffuso nell’Africa orientale, è capace di infettare l’uomo ed è più virulento
Gene SRA: - conferisce resistenza - elemento di distinzione certa
traT.b.rhodhesiense e T.b.brucei
Trypanosoma brucei gambiense e
Trypanosoma brucei rhodesiense
Glossina uomo
Agenti eziologici della malattia del sonno trasmessa all’uomo da ditteri ematofagi
del genere Glossina (mosca tse tse)
Glossina infetta Uomo
Tripomastigoti snelli
Tripomastigoti metaciclico
Tripomastigoti tozzi
Assunti dalla glossina
CICLO VITALE NELL’UOMO
è depositato nel derma (infiammazione)
• linfonodi e sangue
• Tali forme sono dipendenti dal “glucosio”
come fonte di energia che viene metabolizzato nei glicosomi.
- linfa -sangue
-liquor cefalorachidiano
Glossina
Tripomastigoti tozzi
Tripomastigoti mesociclici
Tripomastigoti prociclici snelli
Epimastigoti
Tripomastigoti metaciclici
CICLO VITALE NEL VETTORE
intestino medio
- cambia il proprio metabolismo in funzione della principale fonte energetica dell’insetto
costituita prevalentemente dalla prolina - viene sostituita la VSG con un’altra glicoproteina
che è la prociclina
= perdita dell’infettività verso il mammifero
ghiandole salivari
sostituiscono la superficie di prociclina con VSG
Uomo infetto
Forme di tripanosomi
Morfotipi nell’uomo:
Tripomastigote Sottile
Tripomastigote intermedio
Tripomastigote tozzo Morfotipi nel
vettore:
Tripomastigote Epimastigote Tripomastigote metaciclico
1) forma snella
- membrana cellulare ondulante - flagello libero - nucleo ovale
- incessante attività riproduttiva
- trasformazione della propria struttura antigenica di superficie determinata dalla glicoproteina VSG (Variant Surface Glicoprotein)
permette l’evasione dalle difese immunitarie dell’ospite
Nell ’ uomo:Tripomastigoti ematici
sono caratterizzati da due forme
2) forma tozza
- nucleo rotondeggiante
- priva di flagello libero ( poco mobile)
l’unica forma infettante per il vettore
Nell ’ insetto:
§ Tripomastigoti tozzi
intestino medio
§ Tripomastigoti prociclici snelli
intestino anteriore ghiandole salivari
§ Epimastigoti
§ Tripomastigoti metaciclici
Sole forme infettanti per l ’ ospite mammifero
I vettori
Glossine spp 22 specie
habitat ombreggiati (20-30 o C)
Si nutrono di giorno Il parassita si sviluppa in
10-14 giorni
Vettori Tripanosomosi Africana
• Glossina morsitans
• T. brucei rhodesiense
• Glossina palpalis
• T. brucei gambiense
African Sleeping Sickness
• Virulence
• Reservoir
• Zoonotic
• Vector
• Distribution
Less More
Human/animal Human/animal
Less More
G.palpalis G.morsitans Western Africa Eastern Africa
T.b.gambiense T.b.rhodesiense
MALATTIA DEL SONNO
La malattia del sonno o tripanosomosi africana si
estende dal Sud del Sahara al Nord del Kalahari e si
manifesta in due forme:
§
CRONICA dovuta a T.b.gambiense
(manifestazione lenta della malattia)
§
ACUTA dovuta a T.b.rhodesiense
(manifestazione rapida e grave della malattia)
I tripanosomi metaciclici inoculati dalla Glossina
§ si moltiplicano localmente negli spazi intracellulari “chancre” cutaneo
- edema
- danno tissutale locale
§ penetrano attraverso la via linfatica nel sangue
§ invadono il sistema nervoso centrale lesioni a carico delle meningi
PATOGENESI
Tripanosomosi Africana fasi di invasione:
• Formazione di un nodulo nel punto di inoculo (chancre)
• Invasione di linfoghiandole, fegato e milza
Tripanosomosi Africana
sintomi in fase emolinfatica
• Febbre intermittente
• Spleno- ed Epatomegalia
• Ingrossamento linfonodi
Tripanosomosi Africana sintomi I fase invasiva del SNC
(da 3 mesi a diversi anni dopo l ’ inoculo)
• Regressione dei sintomi precedenti
• Persistenza di febbri intermittenti
• Insonnia, difficoltà di concentrazione
• Irritabilità
Tripanosomosi Africana sintomi II fase invasiva del SNC
(da 3 mesi a diversi anni dopo l ’ inoculo del parassita)
• Infiltrati linfocitari nelle meningi
• Infiltrati linfocitari nell’encefalo
• Fenomeni di demielinizzazione in encefalo e nervi periferici
• Turbe neuropsichiche
• Sonnolenza
• Coma profondo
La tripanosomosi africana va sospettata in soggetti residenti o provenienti da aree endemiche
• per T.b.rhodesiense la maggior parte dei casi si manifesta allo stato precoce della malattia
• per T.b.gambiense la malattia si manifesta dopo mesi o anni, quando è caratterizzata da meningoencefalite
DIAGNOSI
Le forme tripomastigote vanno ricercate direttamente nel sangue, liquor, aspirati linfonodali
• tecniche parassitologiche dirette
• tecniche sierologiche: DAT, ELISA
Diagnosis
• Direct microscopy
– Blood (T.b. rhodesiense.)
– Lymph node aspirate (T.b.gambiense) – Lumbar puncture (Late T.brucei.rhod. &
T.b.gamb.)
• Serology
• Animal inoculation
Tripanosomosi Africana diagnosi di laboratorio
• Reperimento di tripomastigoti nel
sangue, nel liquor ed
in aspirati da linfonodi
Il trattamento chemioterapico specifico per la
tripanosomosi africana differisce a seconda dello stadio della malattia
§ PENTAMIDINA
§ SURAMINA: indicato nello stadio ematolinfatico
§ MELARSOPROLO: indicato nello stadio meningoencefalico
§ Alfa – difluorometilornitina (DFMO):
utile su T.b.gambiense in fase terminale
TERAPIA
Lotta:
§ incendi o estirpazioni della vegetazione dove le mosche tse-tse si moltiplicano
§ disinfestazioni con insetticidi
§ distruzione di mandrie di animali selvatici ( T.b.rhodesiense )
LOTTA E PREVENZIONE
Prevenzione:
§ esami periodici della popolazione a rischio basati su esame clinico, sierologico e parassitologico
§ controllo dei maiali (possibili serbatoi della malattia)
Mutual self-defence: the trypanolytic factor story
Pays E, Vanhollebeke B.
Microbes Infect. 2008 10:985-9
Around 1900 Laveran and Mesnil discovered that African trypanosomes (prototype:
Trypanosoma brucei brucei) do not survive in the blood of some primates and humans.
The nature of the trypanolytic factor present in these sera has been the focus of a
long-standing debate between different groups, but recent developments have allowed the proposal of a coherent model incorporating most seemingly divergent views and providing an interesting example of the complex interplay that continuously occurs between hosts and parasites. Possibly as an adaptation to their natural environment, great African apes (Hominoidea) and humans have acquired a new member of the apolipoprotein-L family, termed apoL1. This protein is the only one of the family to be secreted in the blood, where it binds to a subset of HDL particles that also contain another human-specific protein, haptoglobin-related protein or Hpr. T. b. brucei possesses a specific surface receptor for the haptoglobin-hemoglobin (Hp-Hb)
complex, as a way to capture heme into hemoproteins that contribute to cell growth and resistance to the oxidative stress of the host. As this receptor does not
discriminate between Hp and Hpr, Hpr-containing HDL particles of human serum are efficiently taken up by the parasite, leading to the simultaneous internalization of
apoL1, Hpr and Hb-derived heme. Once in the lysosome, apoL1 is targeted to the lysosomal membrane, where its colicin-like anionic pore-forming activity triggers an influx of chloride ions from the cytoplasm. Osmotic effect linked to this ionic flux leads to uncontrolled swelling of the lysosome, ultimately causing the death of the parasite.
Two T. brucei clones, termed Trypanosoma brucei rhodesiense and Trypanosoma brucei gambiense, have managed to resist this lysis
mechanism and, therefore, cause sleeping sickness in humans. While the mechanism of this resistance is still not known in the case of T. b. gambiense, the dominant factor responsible for resistance of T. b. rhodesiense has been identified. This protein, named SRA for Serum Resistance-Associated, is a truncated version of the major and variable surface antigen of the parasite, the Variant Surface Glycoprotein or VSG. Presumably due to its defective
nature, SRA is not targeted to the plasma membrane as do regular VSGs, but ends up in the late endosomal compartment. In this location SRA is thought to neutralize apoL1 through coiled-coil interactions between alpha-helices.
Mutual self-defence: the trypanolytic factor story
Pays E, Vanhollebeke B.
Microbes Infect. 2008 10:985-9
Meccanismi specifici di evasione del T. brucei
• Variazione antigenica: le VSG
• Attivazione policlonale ed aspecifica di linfociti B
• Immunosoppressione dell ’ ospite
• Produzione di gp63-like protein
Variazione antigenica: le VSG
Struttura:
• Glicoproteine dimeriche di superficie
• C-terminale ancorata alla membrana, N-terminale caratterizzata da
regioni variabili e costanti
Variant Surface Glycoprotein
60kd (450aa) glycoprotein (CHO 7-17%) C-terminal anchored in membrane
Often as a dimer (alpha helix)
Only epitopes in end third of N-terminal exposed
Densely clustered 10 7 molecules/parasite
Chapter 40, Figure 2
Schematic representation of the major surface glycoconjugates of procyclic and metacyclic Trypanosoma brucei
Essentials of Glycobiology Second Edition
Variazione antigenica: le VSG
La variazione antigenica porta alla mancata eliminazione di subpopolazioni di parassiti.
Il sistema immunitario, infatti, non è in grado di esprimere in tempo anticorpi specifici contro gli antigeni temporaneamente espressi.
Parasitemia in African Sleeping Sickness
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 10 20 30
Days after Infection
Log 10 Trypanosomes per ml
Espressione VSG
• Fase infettante (tripomastigote metaciclico) espressione di 10-15 diverse VSG
• 7 giorni dall’infezione: inizio switch periodico delle VSG
• Fase tardiva: possibile ri-espressione VSG
iniziali
Production of VSG
Gene rearrangement
Produces an expression linked copy (ELC)
ELC transposed to telomeric end of chromosome - replacing existing gene
Switch occurs every 10
6divisions
100-1000 copies of different VSG’s in clone
Genetic mechanisms of antigenic variation. The Trypanosoma brucei genome contains more than 1,000 variant surface glycoprotein (VSG) genes (shown as coloured boxes). Only one of these VSG
variants is expressed at any one time. Gene expression occurs in a telomeric expression site (ES), where the VSG gene is co-transcribed with expression-site-associated genes (ESAGs; shown as numbered boxes).The T. brucei genome contains a set of 15–20 similar (but not identical) ESs, 3 examples of which are depicted. In T. b. rhodesiense, one particular ES, known as R-ES, contains the serum-resistance associated (SRA) gene, which confers resistance to lysis by human serum40. Antigenic variation (that is, the expression of a different VSG variant) can result from two mechanisms (indicated in red): transcriptional switching and homologous recombination. Transcriptional switching occurs by a process known as in situ activation, in which expression of the active ES is turned off, and expression of a previously silent ES is turned on. This process does not involve DNA rearrangement. By contrast, homologous recombination involves replacement of the active VSG gene. This can occur by one of two mechanisms: gene conversion, which involves replacement with a copy of a VSG gene from the repertoire; or reciprocal exchange, which involves replacement with a VSG gene from another ES (and thereby exchange of a VSG gene between two ESs). These replacements occur through recombination between homologous regions, such as 70 base-pair repeats.
Gain and loss of resistance to human serum. Tsetse flies inject the mammalian host with T. b.
rhodesiense in the metacyclic form, and these trypanosomes then transform into long, slender bloodstream forms, in which different VSG ESs can be activated. Only trypanosomes in which the R-ES is active can resist lysis by human serum. Under these conditions, in situ activation (transcriptional switching) of other VSG ESs is counter-selected (indicated by a small red cross), owing to the requirement for SRA expression to resist lysis. Therefore, antigenic variation only occurs through homologous recombination targeted to the active VSG gene. In non-human
hosts, expression of the R-ES seems to be counter-selected, although in situ inactivation of the R-ES does require many passages in mice6, 39. This counter-selection might result from the absence of most ESAGs from the R-ES, because these ESAGs might not be completely dispensable.
Il meccanismo di variazione antigenica
realizzato con le VSG rende particolarmente
complesso lo sviluppo di un vaccino contro
il T. brucei
Meccanismi specifici di evasione del T. brucei
• Variazione antigenica: le VSG
• Attivazione policlonale ed aspecifica di linfociti B
• Immunosoppressione dell’ospite
• Produzione di gp63-like protein
Attivazione policlonale di linfociti B
Le molecole rilasciate dai tripanosomi o le stesse VSG agiscono da mitogeni
Espansione clonale non specifica dei linfociti B
Produzione massiva di IgM non specifiche
IgM eterospecifiche e autoanticorpi contro proteine e acidi nucleici
dell’ospite
Formazione complessi Ag-Ab con
iperplasia di milza e linfonodi
Meccanismi specifici di evasione del T. brucei
• Variazione antigenica: le VSG
• Attivazione policlonale ed aspecifica di linfociti B
• Immunosoppressione dell’ospite
• Produzione di gp63-like protein
Immunosoppressione dell’ospite
1. Alterazione delle funzioni cellulari B e T:
– produzione di IgM non seguita da produzione di IgG – soppressione della proliferazione dei linfociti T
2. Alterazione nell’attivazione dei macrofagi :
– iperattivazione dei macrofagi da parte di porzioni
delle proteine VSG
3. Variazione del pattern di citochine rilasciate da linfociti
Soppressione proliferazione linfociti T
Prodotti di secrezione dei Tripanosomi
(es.proteina T Lymphocyte Triggering Factor)
Induzione dei CD8
+a produrre alti livelli di IFN-γ
Diminuzione dell’espressione dei IL-2R e della sintesi dell’IL-2 Induzione della
produzione di una MAP chinasi che contribuisce
alla proliferazione dei
tripanosomi
Attraverso esperimenti di laboratorio, effettuati su ratti e topi, è stato evidenziato che:
• i Tripanosomi stimolano la produzione di IFN-γ nei
linfociti CD8 + ma non nei CD4 +
• la proteina TLTF (T-lymphocytes triggering factor) si lega
direttamente alla molecola CD8 esposta sulla superficie dei linfociti
• la produzione di IFN-γ induce la produzione di una
MAP-chinasi responsabile della proliferazione dei
Tripanosomi
Meccanismi specifici di evasione del T. brucei
• Variazione antigenica: le VSG
• Attivazione policlonale ed aspecifica di linfociti B
• Immunosoppressione dell ’ ospite
• Produzione di gp63-like protein
Produzione di gp63-like protein
Anche i Tripanosomi hanno geni codificanti proteine simili alle gp-63 presenti nella
Leishmania. Sebbene la loro funzione non sia
stata ancora ben definita, si suppone abbiano
un ruolo specifico nell’ evasione della lisi
mediata dal complemento
Riassumendo…
I tripanosomi utilizzano vari meccanismi per evadere dalla risposta immune, e le strategie dipendono dalle momentanee necessità del parassita (stadio, localizzazione nell’ospite e stato del sistema immunitario).
I più comuni sistemi di evasione sono volti a prevenire il confronto tra parassita e sistema immunitario.
Si realizzano attraverso:
• Secrezione di molecole che modulano il sistema immunitario
• Controllo del set di citochine prodotte
• Anergia delle cellule immunitarie
Nuove evidenze
sulla biologia cellulare di
T.brucei
The genome of the African trypanosome Trypanosoma brucei
.Berriman M, Ghedin E, Hertz-Fowler C, Blandin G, Renauld H, Bartholomeu DC, Lennard NJ, Caler E, Hamlin NE, Haas B, Böhme U, Hannick L, Aslett MA, Shallom J, Marcello L, Hou L, Wickstead B, Alsmark UC, Arrowsmith C, Atkin RJ, Barron AJ, Bringaud F, Brooks K, Carrington M, Cherevach I, Chillingworth TJ, Churcher C, Clark LN, Corton CH, Cronin A, Davies RM, Doggett J, Djikeng A, Feldblyum T, Field MC, Fraser A, Goodhead I, Hance Z, Harper D, Harris BR, Hauser H, Hostetler J, Ivens A, Jagels K, Johnson D, Johnson J, Jones K,
Kerhornou AX, Koo H, Larke N, Landfear S, Larkin C, Leech V, Line A, Lord A, Macleod A, Mooney PJ, Moule S, Martin DM, Morgan GW, Mungall K,
Norbertczak H, Ormond D, Pai G, Peacock CS, Peterson J, Quail MA,
Rabbinowitsch E, Rajandream MA, Reitter C, Salzberg SL, Sanders M, Schobel S, Sharp S, Simmonds M, Simpson AJ, Tallon L, Turner CM, Tait A, Tivey AR, Van Aken S, Walker D, Wanless D, Wang S, White B, White O, Whitehead S, Woodward J, Wortman J, Adams MD, Embley TM, Gull K, Ullu E, Barry JD, Fairlamb AH, Opperdoes F, Barrell BG, Donelson JE, Hall N, Fraser CM, Melville SE, El-Sayed NM.
Science. 2005 Jul 15;309(5733)
La funzione flagellare è essenziale per la forma sanguigna del
Trypanosoma.
L’induzione di un danno flagellare potrebbe essere il punto di
partenza per curare la malattia del sonno
Sia la forma sanguigna che quella
prociclica (nel vettore) del Trypanosoma Brucei presentano un flagello che
emerge da un pocket flagellare posteriore.
Tale flagello comprende:
1- assonema circondato da membrana
2- PFR - ”paraflagellar rod”
Come si può impiegare la proteomica del flagello per
la lotta al Tripanosoma?
- Isolamento di assonema, PFR associato e
corpo basale del flagello della forma prociclica -Separazione delle proteine mediante
elettroforesi.
- Digestione delle bande ottenute con tripsina
- Analisi dei peptidi risultanti con LC – MS
- Identificazione di 331 proteine costituenti il
Proteoma Flagellare di T. brucei (TbFP)
Le proteine del TbFP presentano omologhi nel genoma di T.Cruzi e L.Major.
La comparazione tra le proteine del TbFP e del proteoma flagellare di Chlamydomonas e
Tetrahymena thermophila ha confermato invece la presenza di un ampio numero di proteine nel TbFP non codificato negli altri 2 organismi.
Molto probabilmente queste proteine risiedono nel
PFR che rappresenta una struttura flagellare
specifica del Tripanosoma.
L’identificazione di omologhi del TbFP nell’uomo
responsabili delle malattie ereditarie legate alla
motilità ciliare ha fornito lo spunto per bloccare la
funzionalità flagellare nel
T.brucei
Identificazione, oltre alle 3 dineine assonemali, di omologhi di altre 7 proteine direttamente implicate in
patologie umane.
Tra le proteine ci sono: Hydin,
PACRG e Scorpion.
Analisi funzionale con la tecnica
dell’RNAi della proteina Hydin nella forma prociclica del Trypanosoma
GRAVE DIFETTO DI MOTILITA’
Analisi di altre 10 proteine del TbFP con l’approccio dell’RNAi, 8 delle quali mostrano in seguito
ad ablazione, un fenotipo flagellare.
2 geni (Tb PACRGA e Tb
PACRGB) non hanno effetti se ablati singolarmente ma la
repressione simultanea determina
la paralisi del flagello.
Tutti gli esperimenti di RNAi a cui sono state sottoposte le
forme procicliche dei
Tripanosomi mostrano che la motilità può essere seriamente
compromessa mentre la
proliferazione cellulare rimane
inalterata.
Uso della stessa tecnica di RNAi inducibile contro 5 proteine del TbFP
della forma sanguigna.
Tutte le 5 analisi risultano in un Trypanosoma che non completa la
citochinesi, formando cellule mostruose
incapaci di proliferare.
Trypanosoma RNAi induced
Le cellule cessano di dividersi ma continuano a progredire attraverso il ciclo cellulare.
Le cellule iniziano nuovi cicli di fase S e mitosi,portando a
grandi cellule contorte contenenti più Kinetoplasti e
più nuclei MOSTRI
Cellule 4K4N e cellule 8K8N
1 Kinetoplasto 1 Nucleo
1K1N
Sono replicati 1 volta durante il
ciclo cellulare
