Laboratorio di Patologia Clinica, Az. Ospedaliera S. Giovanni Addolorata Calvary, Roma (Italia) Abstract

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Malattia celiaca, diagnostica di laboratorio

R. Pica, C. Castellano, M. Ciabatta e M. Ruggeri

Laboratorio di Patologia Clinica, Az. Ospedaliera S. Giovanni Addolorata Calvary, Roma (Italia)

Medicina di famiglia

Clin Ter 2005; 156 (1-2): 35-39

Corrispondenza:Dott.ssa Rosa Pica, Laboratorio di Patologia Clinica, Ospedale S. Giovanni Az. Osp. S. Giovanni Addolorata Calvary, Roma, Tel. 0677055640 Fax 0677055643 e.mail: [email protected]

Abstract

Coeliac disease, laboratory uptades

A coeliac disease update review and a case report are presented, especially concerning a Clinical Pathology Laboratory approach. Implemented basic research, case finding strategy and information technologies are the key tools for a better under- standing of the multiaetiological features of this disease. By these tools it will be achieved appropriateness in diagnosing and monitoring of the related clinical pictures.

Key words: Coeliac disease,AGA, EMA, AtTG, HLA-DQ typing Riassunto

Viene presentata una rassegna aggiornata sulla malattia celiaca, focalizzata sugli aspetti della diagnostica di pertinenza del Laboratorio di Patologia Clinica; inoltre vengono riferiti alcuni dati relativi alla esperienza degli autori in merito. L’aumentata consapevolezza del polimorfismo delle modalità di presentazione clinica della MC, lo sviluppo della conoscenza di base e delle evidenze conseguite, nonché la loro diffusione “in tempo reale”attraverso le migliorate tecnologie di informazione e co- municazione potranno contribuire ad un miglioramento sostan- ziale nella gestione di questa condizione clinica, che riguarda un numero significativo di persone.

Parole chiave: Celiachia, AGA, EMA, AtTG, tipizzazione HLA-DQ

Introduzione

La celiachia è un’intolleranza permanente al glutine, proteina contenuta nel frumento, nell’orzo e nella sega- le, la cui natura eziologica è multifattoriale: ad essa concorrono alcuni aplotipi HLA insieme ad altri geni ed a fattori ambientali (virus?). Le manifestazioni cliniche sono multiformi, di tipo gastrointestinale ed extraintestinale; il quadro più noto è quello associato al malassorbimento, che deriva dal quadro anatomo- patologico intestinale distintivo di “atrofia dei villi ed iperplasia delle cripte”. Sebbene l’organo bersaglio sia l’intestino tenue, la malattia può essere considerata a tutti gli effetti una malattia sistemica, con interessamento di molti organi ed apparati, quali, solo per citarne alcuni, la cute, la tiroide, il pancreas, il fegato, il cuore, le articolazioni, i muscoli ed il sistema nervoso centrale e periferico. La sintomatologia e le manifestazioni clinico-patologiche regrediscono non appena si instaura una dieta priva di glutine (gluten free diet, GFD).

Epidemiologia

L’epidemiologia della malattia celiaca (MC) è stata interamente riscritta durante l’ultimo decennio; la mes- sa a punto di test sierologici molto sensibili e specifici,

prima gli anticorpi antigliadina (AGA) e gli antiendomisio (EMA) e, quindi, gli anticorpianti transglutaminasi (AtTG) ha dimostrato una frequenza insospettata di casi di celiachia atipici, silenti e potenziali.La MC può manifestarsi a qualsiasi età, anche se in genere i sintomi si presentano fra il 6° ed il 15° mese di vita, vale a dire dopo la somministrazione di alimenti contenenti il glutine, con un esordio, nella forma tipica, a distanza di alcuni mesi dall’introduzione. Negli USA la prevalenza generale è di 1:133, simile alla prevalenza in Eu- ropa; il rapporto femmine/maschi è 2:1. Dati recenti in- dicano che la MC è anche presente in popolazioni vi- venti nel Sahara di origine araba-berbera. In India sono stati descritti casi tipici, con diarrea cronica ed anemia.

Epidemiologi italiani non ritengono che la MC sia sotto- stimata: su 250.000 presunti soggetti celiaci, solo 50.000 ne sono consapevoli. Sembra che una parte dei casi non diagnosticati in un dato tempo per mancanza di sintomi possano emergere più tardi con deterioramento clinico.

Da uno studio finlandese su un campione di 3.654 bambini nel 1994 non era stato identificato nessun caso; 7 anni più tardi, quando sono stati messi a punto i saggi EMA ed antitransglutaminasi, 56 bambini davano risultati positivi a tali saggi e le biopsie intestinali di 27 di loro risultavano positive. Da notare che 10 dei 56 casi con positività agli anticorpi antitransglutaminasi avevano potuto essere diagnosticati tra il 1994 ed il

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2001 a causa di sintomi addominali. Studi sulle fami- glie di pazienti celiaci hanno evidenziato che la concordanza della malattia fra gemelli monozigotici è del 70%, mentre la sua prevalenza tra fratelli è del 16% e tra consanguinei di 1°grado è dell’8%.

Genetica e patogenesi

I geni HLA (Human Leukocyte Antigen) sono loca- lizzati sul braccio corto del cromosoma 6: in posizione centromerica sono presenti i loci DP, DQ e DR, i cui geni codificano per le molecole di classe II, mentre in posizioni diverse sono situati gli altri loci, tra cui quelli relativi ai geni codificanti per le molecole di classe I e di classe III. Gli eterodimeri di classe II sono caratte- rizzati da un elevato polimorfismo (ne esistono circa 700 alleli); essi hanno la funzione di legare i peptidi antigenici e di presentarli al T cell receptor dei linfociti T CD4+. Esistono evidenze che l’affinità da parte delle molecole DQ2 e DQ8 per un determinato peptide del glutine (peptide 31.49, gln. gln.gln.pro.) aumenta dopo deamidazione da parte della transglutaminasi tessutale. I soggetti con MC hanno diversi aplotipi, ma quasi tutti (oltre il 90%) sono DQ2 positivi; quelli DQ2 negativi, clinicamente indistinguibili dagli altri, presentano quasi tutti l’aplotipo DR4, DQ8; infine, quelli DQ2 e DQ8 negativi rappresentano una rarità. Posse- dere anche una sola catena dell’eterodimero codifica- to dal DQ2 o dal DQ8 sembra essere una condizione sufficiente perché si abbia la MC. Il complesso HLA presenta un elevato linkage disequilibrium, ovvero un’associazione non casuale di certi alleli ai diversi loci. Per brevità si citano gli alleli predisponenti alla MC come DQ2 e DQ8; in realtà, esistono due tipi diversi di DQ2, di cui uno predispone alla MC (HLA- DQ2.5) ed un altro non predisponente (HLA-DQ2.2).

Varianti alleliche predisponenti sono DQA1*05 con il DQB1*02, che codificano per l’allele HLA-DQ2.5, det- to anche eterodimero DQ (α1*0501β1*0201). L’eterodimero DQ (α1*0501,β1*0201) è quindi riconosciuto come il fattore di rischio genetico primario, anche quando esso è codificato da fenotipi diversi. Infatti nei soggetti eterozigoti DR5/DR7 l’eterodimero predisponente è formato in trans: l’aplotipo DR5 contribuisce con la molecola DQα1*0501, mentre l’aplotipo DR7 contribuisce con la molecola DQβ1*0201. Nel Nord Europa, l’eterodimero DQ2 della MC è più spesso presente in cis sull’aplotipo esteso A1,B8,DR3; nel Sud Europa esso è più frequentemente riscontrato in trans, in associazione con i genotipi DR3/DR7 o DR5/DR7. In Sar- degna il DQ2 è invariabilmente associato all’aplotipo B18-DR3. Nel Nord dell’India DQ2 è associato ad A26- B8-DR3 ed, in Turchia, ad A27-B8-DR3. Il fatto che il 30% della popolazione abbia il DQ2 ma solo una per- sona su 100 circa sviluppa la MC, depone per la corresponsabilità di altri geni nel determinismo della MC; fra i geni candidati allo studio ci sono quello della transglutaminasi tissutale, quelli del TCR (α,β,γ,δ), quello del CD28, quello del B7, i geni del- l’IL-12, quelli di KIR e LILR (cluster genici coinvolti

nella funzione delle cellule T ed NK) e quello di CTLA4, coinvolto nella regolazione dell’attivazione delle celluleT. Le manifestazioni cliniche gastroin- testinali sono: diarrea, perdita di peso, arresto della crescita, vomito, debolezza muscolare; quelle extraintestinali comprendono alterazioni ematologiche, mu- cocutanee, muscolo-scheletriche, neurologiche, del sistema riproduttivo, epatiche, cardiache, la ipertransa- minasemia. In definitiva i sintomi sono dipendenti da:

– carenze nutrizionali (malassorbimento) – autoimmunità

Autoanticorpi nella MC sono:

– anti TG – anti actina – anti calreticulina

– anti cellule del Purkinje (responsabili dell’atassia) – anti GAD.

La transglutaminasi (TG) è ubiquitaria ed è espressa sulla superficie cellulare di vari tessuti, oltre ad essere presente all’interno delle cellule. La transglutaminasi tessutale 2 è responsabile della deamidazione dei peptidi di gliadina, con formazione di acido glutammico, ricco di carica negativa, ed adatto a reagire con gli eterodimeri DQ2 e DQ8: ne risulta l’attivazione della risposta lin- focitaria (l’aumento e la infiltrazione dei linfociti intraepiteliali all’interno della mucosa intestinale); inoltre la transglutaminasi catalizza legami fra proteine (lega una glutammina con una lisina) e trasduce segnali cellulari. La presenza di anticorpi anti transglutaminasi ed anti endomisio sembra inibisca la tTG, che non può stimolare il TGFβ nella sua funzione di differenziazione e riparazione degli epiteli/endoteli. Sono state descritte evidenze per un ruolo patogenetico degli EMA e degli AtTG: anticorpi anti transglutaminasi tessutale sono stati identificati in lin- fonodi, muscoli, fegato di pazienti celiaci; AtTG, clonati dall’intestino di soggetti con MC, determinano atassia nel topo se inoculati nei ventricoli cerebrali. Recenti evidenze suggeriscono che un aumentato release enterocitario di IL-15 rappresenti un blocco dell’apoptosi degli IEL (linfociti intraepiteliali), il vero marcatore istopatologico di malattia.

Diagnosi

Per la diversa modalità di presentazione e delle diverse età di insorgenza della MC, il ruolo del Laborato- rio di Patologia Clinica è sicuramente molto rilevante.La ricerca applicata alle tecnologie innovative ha aumentato il valore degli esami sierologici, soprattutto EMA ed anti TG, stante il buon grado di accettazione che tali indagini riscuotono da parte del paziente per la loro non invasività. Le principali forme di MC sono iden- tificabili sulla base di criteri condivisi come segue:

– MC tipica - presenza di sintomi enterici, sierologia e biopsia intestinale positive

– MC atipica - manifestazioni extraintestinali, con sierologia e biopsia positive

– MC silente - assenza di sintomi, sierologia e biopsia positive

– MC latente - solo sierologia positiva

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La forma atipica o subclinica presenta una prevalenza di circa il 24%.

Per ciascun caso diagnosticato una media di 5-10 casi restano non diagnosticati, in quanto presentano sintomi atipici, minimi o persino assenti: questi restano

“non trattati” e sono perciò esposti al rischio di complicanze a lungo termine. I celiaci latenti sembra siano quelli a maggior rischio di complicanze.

È importante considerare la diagnosi differenziale fra MC da un lato e linfoma intestinale, gastroenterite eosinofila e malattie parassitarie (giardiasi e strongiloi- diasi) dall’altro.

Il linfoma intestinale (in genere di origine T cellulare, ma talvolta anche B CD20+) si presenta con una storia di malassorbimento in genere, con un reperto bioptico del tenue caratterizzato da atrofia secondaria dei villi con atrofia delle cripte; lesioni istologiche e sintomatologia clinica non si modificano con la dieta priva di glutine.

Nella gastroenterite eosinofila la diagnosi differenziale può essere effettuata sulla base di una rilevante eosinofilia periferica ed attraverso la biopsia intestinale, che mette in evidenza una irregolarità dei villi (ap- piattiti, bifidi e tozzi), con un cospicuo infiltrato linfo- citario plasmacellulare ed eosinofilo, che interessa tutta la tonaca mucosa.

Nelle malattie parassitarie può essere presente un quadro di malassorbimento, con modificazioni della morfologia digiunale che raramente raggiungono l’a- trofia totale; l’esame microscopico delle feci consente di distinguere le parassitosi dal MC. Esistono inoltre alcune altre condizioni patologiche in cui la biopsia intestinale può essere sovrapponibile al quadro della celiachia, come la “enterite autoimmune”, possibile in bambini con deficit immunologici (immunodeficienza comune variabile, agammaglobulinemia X-correlata) ed il “danno da farmaci antiinfiammatori non steroidei”(nei soggetti anziani): in questi casi la valutazione dei marca- tori sierologici (negativi) consentirà un orientamento clinico corretto.

Gli esami sierologici specifici sono gli anticorpi antigliadina di tipo IgA ed IgG (AGA-A ed AGA-G), gli anticorpi antiendomisio in genere di tipo IgA (EMA) e gli anticorpi anti transglutaminasi tissutale (AtTG) di tipo IgA ed IgG.

Il test di genetica molecolare, consistente nella ricerca degli aplotipi HLA associati alla celiachia, si esegue sul DNA mediante l’impiego di metodica di amplificazione genica.

In considerazione del fatto che sono proprio i celiaci latenti quelli a maggior rischio di complicanze, c’è dif- fuso consenso nel ritenere utile lo screening sierologi- co nei cosiddetti gruppi a rischio, cioè:

– familiari di 1° grado di un celiaco

– parenti affetti da IDDM, tiroidite ed altre malattie autoimmuni

– soggetti con sindrome di Down o con sindrome di Turner

– soggetti con anemia e/o stanchezza cronica – soggetti con deficit di IgA

– soggetti con malattie neurologiche (epilessia, atassia) e turbe psichiatriche.

Anticorpi anti gliadina

Sono i primi anticorpi evidenziati nei celiaci, diretti contro un antigene esogeno, la alfa gliadina: sono di isotipo IgA ed IgG. La determinazione degli AGA IgA è utile nella diagnosi della celiachia in fase attiva e nel monitoraggio del comportamento alimentare dopo attuazione della dieta priva di glutine. Le IgG sono un marker più sensibile ma meno specifico: sono utili per evidenziare i casi con carenza di IgA, in quanto tale deficit nei celiaci sarebbe 10 volte più frequente che nella popolazione normale. Nei soggetti non celiaci la loro positività sembrerebbe essere indice di una aumentata permeabilità intestinale, con maggiore passaggio di molecole, tra cui la gliadina, e successi- va produzione di anticorpi. La loro determinazione viene eseguita con metodica ELISA: si caratterizzano per basso costo, riproducibilità/standardizzazione e per semplicità di esecuzione (automatizzabili).

Anticorpi anti endomisio

Sono autoanticorpi rivolti contro le proteine della matrice extracellulare e quindi alterano l’interazione fra fibroblasti e cellule endoteliali, compromettendo la struttura del villo. Sono in genere della classe delle IgA e si trovano nel siero di soggetti celiaci che assumono glutine. Della gliadina, ai fini della sintesi degli EMA, sarebbero essenziali due brevi sequenze NH2-terminali identificate:è stata riscontrata la produzione di EMA da coltura di tessuto intestinale si soggetto con MC a se- guito di challenge in vitro con i peptidi “incriminati”.

Questi anticorpi si mettono in evidenza con metodica IFA, impiegando come substrato due linee cellulari:

– endomisio del muscolo liscio del terzo distale del- l’esofago di scimmia

– cordone ombelicale umano.

La sensibilità e la specificità degli EMA sono vicine al 100%; la sensibilità non arriva al 100% perchè sono possibili falsi negativi in rapporto allo stato di carenza congenita o basso titolo di IgA. Si tratta di una ricerca impegnativa, costosa e che prevede esperienza dell’o- peratore. La loro negativizzazione è piuttosto lenta: dopo 6 mesi il 50% dei soggetti colpiti è ancora positivo ed alcuni sono ancora positivi a distanza di 12 mesi. Sembra che i soggetti ancora EMA-positivi avrebbero una scarsa compliance alla dieta e perciò la determinazione degli EMA dopo GFD è più utile per valutare l’aderenza alla dieta che la scomparsa della lesione intestinale.

Anticorpi anti transglutaminasi

Evidenze confermate dimostrano che la transglutaminasi tessutale rappresenta l’autoantigene maggiore verso cui sono rivolti gli EMA. La determinazione degli AtTG (antigene umano) presenta sensibilità e speci-

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ficità molto elevate, simili agli EMA, sia nella diagnosi che nel follow up. Nei casi positivi o borderline dovreb- bero comunque essere eseguiti gli EMA per la loro spe- cificità prossima al 100%.Riguardo al follow up va con- siderato che gli EMA si riducono maggiormente nel celiaco a GDF rispetto agli AtTG.

Test di genetica molecolare

È un test di amplificazione genica e si basa sulla ricerca di particolari aplotipi HLA associati al MC, sierologicamente denominati DQ2 e DQ8, che codificano per specifici eterodimeri α/β considerati responsabili della risposta immunitaria del soggetto celiaco.

Uno dei test disponibili consente la rivelazione dei 3 eterodimeri :

– 1° DQB1*0201/DQA1*0501, il linkage con DRB1*03 – 2° DQB1*0202/DQA1*0201, in linkage con DRB1*07 – 3° DQB1*0302/DQA1*03, talvolta in linkage con

DRB1*04.

La presenza del 1° e/o del 3° è sufficiente per parlare di condizione predisponente, mentre la presenza del 2°

eterodimero non è sufficiente da sola, ma lo diventa se è presente anche il 1° eterodimero.Questa metodica, molto costosa, è dotata di un alto valore predittivo negativo, ma basso valore predittivo positivo: andrebbe eseguita in caso di ambiguità, di non attuabilità della biopsia digiunale o in caso di screening di gruppi ad alto rischio.

Altri esami di laboratorio

Tra gli esami di laboratorio aspecifici, ma comunque utili per confermare un sospetto clinico, si può osservare una riduzione della concentrazione di emoglobina (anemia sideropenica microcitica/normocitica), riduzione dei folati, trombocitosi (segno di ipoplasia della mil- za);elevazione dei livelli delle transaminasi sieriche AST ed ALT, ridotti livelli di Fe, Ca, Mg (in relazione al malassorbimento), elevazione della fosfatasi alcalina sierica; ridotte sono le concentrazioni del colesterolo e dei trigliceridi nel siero. Secondo alcuni autori il colesterolo può assumere, caso di un soggetto anemico, il valore di indicatore: una colesterolemia <156 mg/dl è com- patibile al 98% con morbo celiaco; tale dato non sarebbe interpretabile sulla base di un ridotto assorbimento di lipidi, in quanto questi vengono assorbiti per tutta la lun- ghezza dell’intestino, mentre nella celiachia è compromes- so solo il terzo distale del tenue. Dopo terapia priva di glutine, il livello del colesterolo ritorna a valori normali.

Altro parametro eventualmente osservabile è un modesto allungamento del tempo di protrombina (INR come variabile dipendente da Hb) e un incremento della omocisteina.

Casistica: risultati e discussione

La nostra esperienza di 3.000 determinazioni siero- logiche negli ultimi due anni dimostra una prevalenza di positivi pari all’1,7%. I campioni positivi si riferiscono a

varie fasce d’età, ma la più rappresentata è quella dai 30 ai 50 anni; il sesso femminile risulta colpito con frequenza quasi doppia rispetto a quello maschile. Gli AtTG e gli EMA, fra i test di laboratorio disponibili, sono quelli che soddisfano il requisito di maggiore appropriatezza diagnostica; la loro concordanza, prossima al 100%, si riduce solo nell’analisi dei risultati di soggetti celiaci dopo dieta priva di glutine. Riguardo agli EMA, la eventuale coe- sistenza nello stesso siero di anticorpi anti muscolo liscio e/o anti nucleo può complicarne l’interpretazione: in tal caso è consigliabile ripetere il test dopo una ulteriore dilui- zione del siero in esame, fatto che consentirà una più accu- rata valutazione dei risultati. Minima, poco rilevante, la quota dei falsi positivi con il test AtTG, che ha il vantag- gio di essere automatizzabile. La determinazione degli AGA di isotipo IgA dovrebbe essere limitata ai bambini di età inferiore ai 2 anni: ciò in quanto la risposta alla gliadina è la prima ad apparire e, quando compare, non infrequen- temente gli EMA e i AtTG sono ancora negativi.Fra gli anticorpi di classe IgG, gli AtTG sono utili per identifica- re i casi di MC in pazienti con deficit di IgA.Riguardo al test di genetica molecolare è necessario sottolineare che la sua positività, espressione della presenza delle catene degli eterodimeri codificati dagli alleli HLA DQ2 e/o DQ8, costituisce un riscontro assolutamente possibile in un soggetto sano ed ha il significato di predisposizione e di un certo rischio; il suo valore sta altresì nel contribuire a defi- nire situazioni incerte nell’ambito di cluster familiari. La fotografia presentata si riferisce al blotting, eseguito pres- so il nostro laboratorio, di una parte del genotipo HLA di un padre sano di due bambini celiaci, le manifestazioni cliniche dei quali erano di non facilissima interpretazione: sono evidenti le bande in posizione 1, 2, 12, 14, corri- spondenti ad eterodimeri HLA DQ2/DR3- correlati. Il test di genetica molecolare trova indicazione in particolari situazioni, essendo caratterizzato da un bassissimo valore predittivo positivo, da un elevato valore predittivo negativo; ad esempio, nella condizione di una malattia refrat- taria alla terapia, la consapevolezza che il paziente non sia HLA-DQ2 o DQ8 può far abbandonare definitivamente l’ipotesi di celiachia e rivolgere rinnovata attenzione ad altre ipotesi diagnostiche compatibili. Sempre sul tema delle indicazioni a tale test, esiste un certo consenso nel ritenere che l’approccio migliore sia secondo un processo di case finding, focalizzato su gruppi a rischio, metodo che minimizza i costi ed è eticamente appropriato.

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