4.1. PREMESSA

Nei vertebrati l’acido ialuronico (HA) è una componente importante della matrice extracellulare (ECM) dell’epidermide, della cartilagine e dei tessuti connettivi a cui conferisce specifiche proprietà biochimiche ed omeostatiche creando matrici lasse e idratate. È inoltre stato dimostrato che in sistemi cellulari dinamici, come ad esempio durante lo sviluppo embrionale, la rigenerazione tissutale e la tumorogenesi, l’HA sia in grado di influenzare comportamenti cellulari quali la migrazione, la proliferazione e il differenziamento (Lee e Spicer 2000). Un possibile meccanismo attraverso cui l’HA può influenzare il comportamento cellulare è modulando la composizione della ECM che circonda le cellule tramite il legame con i proteoglicani. L’HA può inoltre esercitare un effetto diretto e determinante sul comportamento cellulare riconoscendo specifici recettori sulla superficie delle cellule embrionali e tumorali. Ad oggi CD44 è il recettore per l’HA meglio caratterizzato e risulta ampiamente distribuito in molti tipi cellulari diversi. CD44 può funzionare sia come recettore di adesione che mediare l’attacco e la migrazione delle cellule su un substrato di HA. Inoltre, il legame dell’HA-CD44, determina la trasduzione di segnali intracellulari che modulano eventi come la proliferazione, sopravvivenza e il differenziamento cellulare (Ponta e al. 2003; Thorne e al. 2004; Toole 2004). Nei vertebrati la biosintesi dell’acido ialuronico è regolata da tre enzimi catalitici (le sintasi HAS1, HAS2, HAS3) codificati da tre geni corrispondenti (Spicer e McDonald 1998). Il primo dato funzionale sul ruolo dei geni HAS è stato ottenuto creando topi knockout per Has2 ed è stato visto che la delezione di questo gene determina la precoce interruzione della gestazione a causa di severi difetti cardiaci (Camenisch e al. 2000). Has2 risulta quindi essere la sintasi dell’HA più importante durante l’embriogenesi. Per poter continuare lo studio del ruolo della sintasi 2 durante la morfogenesi ricerche analoghe sono state condotte su modelli sperimentali più facilmente accessibili, quali quelli del pesce e degli anfibi. Nel nostro laboratorio sono stati recentemente clonati i tre geni Has in Xenopus laevis (XHas1, XHas2, XHas3) e ne è stata stabilita la distribuzione spazio-temporale nelle fasi precoci dello sviluppo (Nardini e al. 2004). Sono stati poi condotti esperimenti di perdita di funzione per la sintasi 2 con i quali si è dimostrato che l’espressione del gene XHas2 è fondamentale

per una corretta somitogenesi, necessaria per la migrazione delle cellule della muscolatura ipoassiale e indispensabile alle NCC del tronco per migrare correttamente. Allo scopo di chiarire i meccanismi alla base del ruolo di HA/XHas2 durante l’embriogenesi precoce è stato inoltre clonato nel nostro laboratorio l’ortologo di CD44 in Xenopus e successivamente ne è stato analizzato il profilo di espressione durante lo sviluppo embrionale. L’espressione spazio-temporale del gene XCD44 è risultata essere ampiamente sovrapponibile con quella di XHas2 ed è stato dimostrato, con successivi esperimenti di perdita di funzione, che l’abrogazione di XCD44 determina un’ alterazione della migrazione delle cellule della muscolatura ipoassiale simile a quanto osservato nelle analisi di perdita di funzione di XHas2 (Ori e al. 2006). È stato inoltre messo in evidenza che sia XHas2 sia XCD44 sono espressi a livello della regione branchiale dell’embrione durante lo sviluppo, lasciando presupporre un possibile ruolo di questi geni nello sviluppo craniofacciale. Il mio lavoro di tesi ha pertanto avuto lo scopo di intraprendere lo studio funzionale di XHas2 e XCD44 nei meccanismi di migrazione e differenziamento cellulare della cresta neurale cranica in Xenopus laevis. Le cellule della cresta neurale (NCC) cefalica rappresentano una particolare popolazione cellulare che migra attivamente durante lo sviluppo embrionale e che , raggiunta la propria destinazione finale, differenzia dando origine a precursori neurogenici e condrogenici che andranno a costituire le strutture craniofacciali.

4.2. ESPRESSIONE SPAZIO-TEMPORALE DI XHAS2 E XCD44 NEGLI

ARCHI BRANCHIALI DURANTE LO SVILUPPO CRANIOFACCIALE

Allo scopo di analizzare in dettaglio l’espressione spazio-temporale di XHas2 e XCD44 durante lo sviluppo craniofacciale in Xenopus laevis ho eseguito esperimenti di ibridazione in situ sia “whole mount” che su sezione sintetizzando sonde a RNA antisenso marcate con digossigenina. Per determinare con precisione il tipo cellulare che esprime XHas2 e XCD44 ho poi confrontato la localizzazione dei messageri con l’espressione di marcatori molecolari specifici per la cresta neurale cefalica o per loro

sottopopolazioni come XAP2 e XSOX9 I risultati di questi esperimenti mi hanno permesso di di dimostrare che le NCC craniche esprimono XCD44 durante la loro migrazione all’interno delle tasche faringee la cui componente meso-endodermica esprime XHas2. E’ quindi plausibile pensare che durante la migrazione le NCC si muovono in una matrice in cui è presente HA prodotto dalla tasca branchiale e si può ipotizzare che il recettore CD44 presente sulla superficie delle cellule, legando l’HA possa regolare e/o facilitare il processo di migrazione stesso. Una volta terminata la migrazione è possibile osservare la trascrizione di XHas2 da parte delle NCC. In questa fase l’HA potrebbe essere implicato nel corretto mantenimento dell’omeostasi della matrice che circonda le NCC e contribuire alla sopravvivenza e/o ai processi di differenziamento dei condroblasti. Per confermare la presenza effettiva di HA all’interno deglli archi branchiali a questi stadi pre-differenziativi ho utilizzato una proteina di fusione Neurocan-GFP costituita dal dominio di legame all’HA del neurocano e dalla proteina fluorescente verde GFP che permette di visualizzare la distribuzione dell’HA su sezioni istologiche (Zhang e al. 2004). Gli esperimenti così condotti hanno mostrato che l’HA è realmente presente a livello degli archi branchiali. Successivamente ho quindi seguito l’andamento dell’espressione genica di XHas2 e XCD44 durante le fasi differenziative delle NCC. Mediante esperimenti di ibridazione in situ su sezioni di embrioni a stadio 42 ho verificato che all’inizio del processo di differenziamento delle NCC cefaliche i geni XHas2 e XCD44 rimangono espressi esclusivamente negli archi branchiali più posteriori, il trascritto della sintasi 2 è infatti localizzato all’interno del terzo e quarto arco branchiale mentre il messagero di XCD44 si trova all’interno di singole e isolate cellule dell’epitelio di rivestimento di questi archi. Ad uno stadio più avanzato della condrogenesi (stadio 45) l’espressione di XHas2 si rileva all’interno delle lamelle branchiali (terzo e quarto arco) ed ancora una volta XCD44 viene espresso da cellule dell’epitelio di rivestimento di queste strutture. Ho anche dimostrato che nelle cellule che trascrivono il messagero di XHas2 non c’è espressione della ciclina D1, marcatore molecolare di cellule in proliferazione, queste sono quindi cellule che non si stanno dividendo e che sono già uscite dal ciclo cellulare. Inoltre, tramite la colorazione istologica Alcian Blue che permette la visualizzazione degli elementi dello scheletro craniofacciale, ho potuto mettere in evidenza che queste

stesse cellule non sono ancora differenziate in condrociti, a differenza delle cellule più periferiche, ma lo diverrano a stadio 49 quando la condrogenesi è completata e l’espressione del gene XHas2 cessata. Quindi si può supporre che XHas2 è espresso nelle NCC cefaliche fino al differenziamento terminale di quest’ ultime. Inoltre mentre a stadio 37 è possibile osservare espressione genica della sintasi due nelle NCC migrate in tutti gli archi branchiali nelle fasi differenziative la trascrizione di XHas2 viene spenta in senso antero posteriore rimanendo negli stadi più tardivi (st. 45-49) unicamente confinata nei condroblasti che andranno a formare il cestello branchiale dell’embrione. Purtroppo non ho potuto confrontare questi risultati con quelli ottenuti in altri modelli animali poichè non esistono ad oggi lavori analoghi a questo da me svolto. In conclusione posso affermare che il profilo di espressione della sintasi 2 dell’HA e del suo recettore CD44 nella cresta neurale cranica è estremamente dinamico, infatti mentre l’mRNA di XHas2 è espresso alla fine della loro migrazione fino al loro completo differenziamento in condrociti, in modo del tutto complementare, il trascritto di XCD44 è presente nelle NCC cefaliche solo durante il processo di migrazione.

4.3. RUOLO DI XHAS2 E XCD44 NELLO SVILUPPO CRANIOFACCIALE

Per saggiare il rispettivo contributo di XHas2 e XCD44 durante lo sviluppo craniofacciale ho eseguito esperimenti di perdita di funzione utilizzando la tecnica del morfolino. Questa tecnica prevede l’utilizzo di specifici oligonucleotidi antisenso oppurtunamente modificati in grado di bloccare in vivo la traduzione rispettivamente di XHas2 e XCD44. Gli embrioni microiniettati sono stati fatti crescere fino a stadio 49, stadio in cui il processo di condrogenesi è terminato. Successivamente ho colorato gli scheletri degli embrioni con l’Alcian Blue e ho preseguito con l’analisi degli elementi cartilaginei craniofacciali. Nel lato iniettato degli embrioni depleti di XHas2 ho riscontrato importanti alterazioni a carico del cestello branchiale, del ceratoiale, del quadrato e della cartilagine di Meckel e un‘alterazione, a livello della cartilagine suboculare. Posso quindi affermare che XHas2 è fondamentale per il corretto sviluppo dei derivati scheletrici di tutti e quattro gli archi branchiali. Rimane però ancora da

chiarire se queste malformazioni sono dovute a una errata migrazione delle NCC cefaliche negli archi branchiali o ad un’alterazione dei meccanismi che controllano la sopravvivenza e/o il differenziamento dei condroblasti. L’HA potrebbe infatti avere una funzione protettiva nei confronti di questa popolazione cellulare così come è stato dimostrato per i mioblasti, dove negli embrioni depleti di XHas2 questi vanno incontro ad una massiva apoptosi e non completano quindi il loro programma di differenziamento muscolare. (Ori e al. 2006). Negli embrioni in cui è stata abrogata l’espressione di XCD44 ho invece osservato una riduzione e un mancato innesto della cartilagine suboculare sulla piastra dell’etmoide, che potrebbe essere spiegato con il mancato riconoscimento recettore-acido ialuronico, e su un numero esiguo di embrioni ho riscontrato un cestello branchiale di dimensioni ridotte alcune volte accompagnato da un ceratoiale di dimensioni più piccole rispetto al lato di controllo. La delezione di XCD44 causa quindi alterazioni quasi esclusivamente a carico della cartilagine suboculare, derivato scheletrico del primo arco branchiale. Con un fenotipo quindi che non ricapitola completamente quello osservato negli embrioni depleti di XHas2. Questi risultati si possono spiegare sostenendo che l’HA possa avere dei ruoli durante lo sviluppo craniofacciale indipendenti dall’interazione con CD44 oppure in alternativa è possibile ipotizzare che la presenza e l’attivazione di altri recettori per l’HA possa sopperire alla mancanza delle funzioni di CD44.

4.4. POSSIBILE FUNZIONE DEL SISTEMA HA-CD44 NELLA SOPRAVVIVENZA CELLULARE, MIGRAZIONE E DIFFERENZIAMENTO

I dati di espressione genica e di perdita di funzione di XHas2 ottenuti nel presente lavoro di tesi permettono di ipotizzare che la deplezione della sintasi due possa influenzare l’integrità strutturale della ECM attorno alle cellule della cresta neurale (NCC) cranica e che questo interferisca con l’instaurarsi di corrette interazioni cellula-cellula tra i condroblasti in sviluppo. L’HA potrebbe inoltre influenzare la sopravvivenza e/o il differenziamento delle NCC cefaliche alterando la strutturata della

attivare segnali intracellulari mediante il legame con specifici recettori come ad esempio CD44. E’ stato infatti , ad esempio, dimostrato in sistemi cellulari in vitro che l’interazione HA-CD44 ha un effetto antiapoptotico attraverso la fosfolrilazione di Fak, l’attivazione di RhoB e la sovraregolazione di specifici geni antiapoptotici (Fujita e al. 2002; Marhaba e al. 2003). Sarà quindi interessante verificare il livello di apoptosi negli archi branchiali degli embrioni in cui è stata abrogata la funzione di XHas2 e di XCD44. Una adeguata organizzazione dell’ECM della regione branchiale potrebbe essere inoltre necessaria per la diffusione di morfogeni implicati nello sviluppo craniofacciale o per la normale azione di segnali responsabili del differenziamento dei precursori dei condrociti. Ad esempio, è stato dimostrato che i membri della superfaglia dei TGF sono molto più stabili se complessati con HA, mentre sono rapidamente degradati nelle matrici prive di questo glicosaminoglicano (Locci e al. 1995). Nell’insieme, i nostri risultati ci permettono di fare le seguenti considerazioni e ipotesi 1) l’HA prodotto da XHas2 sembra avere un ruolo chiave nella corretta formazione degli elementi cartilaginei dello scheletro craniofacciale. Infatti la deplezione di XHas2 provoca severe alterazioni a carico di questi elementi; 2) XHas2 potrebbe avere un ruolo nel contribuire alla formazione di una ECM idratata necessaria per i contatti cellula-cellula e la diffusione di segnali extracellula-cellulari. 3) Infine, la concomitante espressione di XHas2 e XCD44 durante la migrazione delle NCC cefaliche suggerisce un possibile coinvolgimento delle componenti del citoscheletro nella migrazione controllata da HA-CD44 in questa popolazione cellulare. I processi di adesione e migrazione cellulare richiedono infatti riarrangiamenti del citoscheletro che, come dimostrato da diversi studi, possono essere promossi dall’interazione tra CD44 e HA (Bourguignon e al 2001a,b, 2002). L’assenza di un sito di legame per l’actina all’interno del dominio citoplasmatico di CD44, fa si che l’interazione di questa proteina con il citoscheletro sia indiretta, e mediata da proteine citosoliche come le ERM e l’Anchirina che agiscono come degli adattatori. Sarà quindi interessante, nel proseguimento di questo progetto, andare a verificare il ruolo di XHas2 e XCD44 sia con esperimenti di guadagno che di perdita di funzione in embrioni di Xenopus analizzando con specifici marcatori molecolari le varie fasi della migrazione delle cellule della cresta neurale cranica.

Tramite lo studio del “pattern” di espressione dei geni XHas2 e XCD44 nello sviluppo della cresta neurale cranica in embrioni di Xenopus laevis , ho dimostrato che:

• L’mRNA di CD44 è presente nelle NCC craniche durante la loro migrazione nelle tasche faringee.

• XHas2 è invece espresso nel mesoendoderma delle tasche faringee durante la migrazione delle NCC e solo successivamente viene espresso direttamente dalle cellule delle creste neurali in stadi post- migratori fino al completo differenziamento in senso condrogenetico.

Tramite lo studio della perdita di funzione dei geni XHas2 e XCD44 mediante la tecnica del morpholino, ho dimostrato che:

• XHas2 e XCD44 sono coinvolti nello sviluppo craniofacciale. • Gli embrioni depleti di XHas2 presentano alterazioni a carico dei derivati scheletrici di tutti gli archi branchiali.

• Esperimenti prelminari di perdita di funzione di XCD44 presentano alterazioni a carico della formazione della cartilagini cranofacciali.