OGM : MESSA A PUNTO E VALIDAZIONE DI UN SISTEMA MULTI
OGM : MESSA A PUNTO E VALIDAZIONE DI UN SISTEMA MULTI
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SCREENING
SCREENING
IN FAST PCR REAL
IN FAST PCR REAL
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TIME PER LA RILEVAZIONE DI DIVERSE SPECIE VEGETALI
TIME PER LA RILEVAZIONE DI DIVERSE SPECIE VEGETALI
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Stampato a cura dell'Unità Operativa di Supporto Biblioteca, Informazione, Editoria (2012).
Curcio L.*, Pierboni E., Madeo L., Tovo G., Rondini C.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche
INTRODUZIONE
INTRODUZIONE
MATERIALI E METODI
RISULTATI E DISCUSSIONE
Messa a punto metodo
L’ottimizzazione della concentrazione dei primers si è ottenuta testando tre diverse concentrazioni di primers combinate tra loro, ogni combinazione è stata verificata in quadruplice copia. L’ottimizzazione della concentrazione delle probes si è ottenuta testando in quadruplice
copia 6 diverse concentrazioni crescenti (50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM, 300nM). Metodi Fast PCR Real-Time
Tutte le prove sono state ottimizzate su piattaforma Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System in modalità Fast, utilizzando una concentrazione finale di TaqMan® Universal Master Mix Fast 1x in un volume finale di 20 µL ed adottando il seguente profilo di amplificazione: stage 1 a 95°C per 20 secondi, stage 2 composto dal primo step a 95°C per 1 secondo e dal secondo step a 60°C per 20
secondi, ripetuto per 40 cicli. Validazione di Fast PCR Real-Time
Per la validazione del metodo si sono testate: la sensibilità, la specificità, la robustezza e il LOD.
I risultati ottenuti dall’ottimizzazione della concentrazione dei primers e delle probes per ogni singolo target sono mostrati di seguito. A parità di quantità di DNA bersaglio utilizzata, la combinazione migliore è stata individuata in base al Ct più basso, un basso scarto tipo ed un alto
∆Rn. I risultati per il LOD sono mostrati di seguito ed espressi in numero di copie genomiche (c.g.). I parametri di specificità, sensibilità e robustezza rientrano nei criteri di accettabilità (dati non mostrati).
Il numero sempre crescente di OGM autorizzati e la presenza sempre più frequente di UGM (organismi geneticamente modificati non autorizzati, per l’esistenza di autorizzazioni asincrone o diversificate o per l’immissione in commercio senza autorizzazione), hanno suggerito
di studiare un metodo multi-screenig ancor più rapido e meno costoso (fast) per facilitare il controllo da parte del Laboratori ufficiali.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1) Alexander TW, et al. J. of Biotechnology 112:255-266 (2004). “Use of quantitative real time and conventional PCR to assess the stability of the cp4 epsps transgene from Roundup Ready® canola in the intestinal, ruminal, and fecal contents of sheep”
2) Grhomann L. et al. J Agric Food Chem. 57:8913-8920 (2009). “Collaborative trial validation studies of real-time PCR based GMO screening methods for detection of the bar gene and the ctp2-cp4epsps construct”.
3) ISO 21571:2005 (Annex A.3 e B.1).
4) Real-Time PCR Systems, Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System and 733/7500 Real-Time PCR Systems “Chemistry Guide”. 5) UNI EN ISO 21570:2006 (Annex B.1).
6) Verification of analytical methods for GMO testing when complementing interlaboratory validated methods, ENGL 2011 (ISBN 978-92-79-19925-7). 7) Waiblinger H.U. et al. Anal Bioanal Chem (2009). “A pratical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants”.
8) Waiblinger H.U. et al.- Eur Food Res Technol. 226:1221-1228 (2008). “Validation and collaborative study of a P35S and T-nos duplex real-time PCR screening method to detect genetically modified organisms in food products”.
*Ricerca Corrente MINSAL IZSUM 2010 - Ampliamento ed evoluzione della filiera analitica relativa agli OGM: messa a punto e validazione di prove in Fast PCR Real-Time per la rilevazione e la quantificazione di organismi transgenici non ancora e/o recentemente approvati in Europa.
