CAPITOLO II
Flavonoidi
e infiammazione
2.1 Infiammazione
L’infiammazione è clinicamente definita come un processo fisiopatologico caratterizzato da arrossamento, edema, dolore, febbre e ridotta funzionalità della regione colpita. Sebbene i farmaci anti-infiammatori steroidei (FAS o SAID - steroidal anti-infiammatory drugs- ) e non steroidei (FANS o NSAID – non-steroidal anti-infiammatory drugs – ) siano attualmente i più utilizzati per il trattamento degli stati acuti dell’infiammazione, questi non hanno avuto lo stesso successo per il trattamento di malattie infiammatorie croniche come l’artrite reumatoide (RA) e la dermatite atopica (DA)i. Poiché l’eziologia e il meccanismo alla base di queste malattie non sono del tutto chiari, diventa difficile mettere a punto una soluzione per questi stati infiammatori cronici. Perciò nasce il bisogno di ricercare agenti anti-infiammatori nuovi e sicuri, e uno dei più promettenti studi a tale scopo consiste nella ricerca di queste nuove molecole nei costituenti delle piante, tra l’altro, ampiamente utilizzati nella medicina cinese. Tra i differenti gruppi di prodotti naturali i flavonoidi sono sicuramente quelli che rivestono una maggiore importanza.
In particolare, sono state ampiamente studiate le proprietà anti-infiammatorie dei flavonoidi del genere Citrus Esperidina e del suo flavone analogo Diosmina (Fig. 4).
Diversi studi hanno dimostrato che le proprietà anti-infiammatorie di questi due flavonoidi sono dovute all’inibizione della sintesi e dell’attività biologica di differenti mediatori pro-infiammatori, principalmente i derivati dell’acido arachidonico, le prostaglandine E2 ed F2 e il trombossano A2
ii
.
Sono stati proposti diversi meccanismi per spiegare l’attività anti-infiammatoria in vivo dei flavonoidi; questi comprendono:
Attività antiossidante e “scavenger” nei confronti dei radicali;
Regolazione dell’attività cellulare delle cellule coinvolte nell’infiammazione;
Modulazione dell’attività degli enzimi coinvolti nel metabolismo dell’acido arachidonico (fosfolipasi A2, ciclo ossigenasi, lipossigenasi) e dell’enzima ossido nitrico sintasi;
Modulazione della produzione di altre molecole pro-infiammatorie;
Modulazione dell’espressione dei geni pro-infiammatoriiii
.
2.2 Flavonoidi come antiossidanti
Le cellule del corpo e dei tessuti sono continuamente minacciate da danni causati dai radicali liberi e da specie reattive dell’ossigeno prodotte durante il normale metabolismo dell’ossigeno o indotti da fattori esogeniiv
. Un incremento della produzione di specie reattive dell’ossigeno è responsabile delle principali forme di lesioni ai tessuti, le quali sono implicate in una moltitudine di stati patologici che vanno da lesioni infiammatorie fino all’infarto al miocardio e al cancrov
. Il meccanismo e la sequenza degli eventi con la quale i radicali liberi interferiscono con le funzioni cellulari non sono completamente conosciute, ma uno dei principali effetti dannosi nei sistemi biologici include la perossidazione dei lipidi di membrana, il danno ossidativo agli acidi nucleici o ai carboidrati e l’ossidazione dei gruppi sulfidrilici o altri gruppi suscettibili presenti nelle proteinevi. In più, i radicali liberi possono indurre liberazione di altri mediatori dell’infiammazione contribuendo così
ad una risposta infiammatoria generalizzata e al danno tissutale. I flavonoidi sono potenti antiossidanti in vitro, in grado di eliminare una vasta gamma di specie radicaliche, nonché di inibire la loro formazione.
2.2.1 Effetti sulla produzione dei ROS da parte delle cellule fagocitarie
La fagocitosi è un importante processo fisiologico accompagnato dalla produzione di anione superossido. Sebbene i ROS (specie reattive dell’ossigeno) generati dai fagociti giochino un importante ruolo fisiologico nella distruzione degli agenti patogeni, questi possono anche causare danno cellulare. Le specie dell’ossigeno altamente reattive, insieme con altri mediatori elaborati da neutrofili e macrofagi, possono promuovere l’infiammazione e causare così, danno tissutalevii
. Vari flavonoidi hanno mostrato la capacità di inibire la produzione dei ROS mediante l’attivazione di neutrofili umaniviii
.
2.2.2 Azione scavenger contro i radicali
I flavonoidi si comportano come degli scavenger, cioè degli spazzini nei confronti di una gran varietà di specie reattive dell’ossigeno, dell’azoto e del cloro, così come nei confronti dell’anione superossido (O2
-), dei radicali idrossilico (OH.) e perossilico (OOH.), dell’acido ipocloroso (HClO) e perossinitrico (ONOO.). In questo modo i flavonoidi reagendo con i radicali, vengono a loro volta ossidati, con la differenza che il radicale del flavonoide che si viene a formare risulta più stabile e meno reattivo rispetto agli altri, riducendo fortemente il rischio di danno ai tessutiix. Mediante questa azione i flavonoidi possono anche inibire l’ossidazione in vitro delle LDL; tale effetto potrebbe essere un’azione preventiva contro l’aterosclerosi.
Nel corso di una infiammazione, l’alta concentrazione di ossido nitrico prodotto dall’enzima iNOS (inducible nitric oxide synthase) nei macrofagi può provocare un danno ossidativo. In questa circostanza i macrofagi attivati incrementano notevolmente la produzione sia dell’ossido nitrico che dell’anione superossido. L’ossido nitrico reagisce con i radicali liberi producendo il perossinitrito,
estremamente dannoso che può direttamente ossidare le LDL, con il risultato di un danno irreversibile alle membrane cellularix. Quando i flavonoidi sono utilizzati come antiossidanti, i radicali sono eliminati e quindi non possono più reagire con l’ossido nitrico, riducendo il rischio di danno tissutalexi. Anche l’ossido nitrico può essere visto di per sé come un radicale ed è stato riportato infatti che le molecole di questo ossido sono direttamente neutralizzate dai flavonoidixii.
2.2.3 Inibizione degli enzimi pro-ossidanti
La stimolazione di cellule infiammatorie come i macrofagi mediante endotossine batteriche o citochine infiammatorie provoca un’aumentata espressione dell’enzima ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) con successiva produzione di una gran quantità di ossido nitrico che è in grado di generare un danno ossidativo. I flavonoidi e altri polifenoli naturali possono inibire l’espressione lipopolisaccaride-indotta del gene iNOS e l’attività dell’enzima iNOS nei macrofagi riducendo la produzione di ossido nitrico e, di conseguenza, il rischio di danno tissutalexiii. Alcuni flavonoidi sono anche capaci di inibire le ciclo ossigenasi e le lipossigenasi, enzimi che favoriscono l’ossidazione non solo dei loro regolari substrati, ma di molte altre molecole incrementando così il rischio di lesioni ossidative in alcuni tessutixiv. Stessa azione nei confronti delle xantino-ossidasi la cui attività, soprattutto in condizioni ischemiche, svolge un ruolo importante nel danno ossidativo ai tessutixv.
2.3 Modulazione delle funzioni delle cellule implicate nel processo infiammatorio Il sistema immunitario è integrato da un complesso altamente regolato di un gruppo di cellule che possono sia interagire tra di loro in maniera cellula-cellula che rispondere a messaggi intercellulari come gli ormoni, le citochine e gli autacoidi. La risposta immunitaria può essere modificata dalla dieta, da agenti farmacologici, da inquinanti ambientali e da sostanze chimiche presenti negli alimenti, come vitamine e flavonoidixvi. Alcuni flavonoidi mostrano una serie notevole di azioni biochimiche e
farmacologiche che influenzano le funzioni delle cellule immunitarie e infiammatorie come cellule T, cellule B, macrofagi, neutrofili, mastcellule o basofilixvii.
Vari flavonoidi influenzano specificamente sistemi enzimatici coinvolti nella generazione dei processi infiammatori, specialmente la tirosina e la serina-treonina protein-chinasi. Questi enzimi sono coinvolti nei meccanismi di trasduzione del segnale e nei processi di attivazione cellulare come la proliferazione delle cellule T
xviii, l’attivazione dei linfociti Bxix
o la produzione di citochine mediante stimolazione dei monocitixx.
2.4 Modulazione dell’attività degli enzimi pro infiammatori
Molti studi hanno dimostrato che vari flavonoidi sono in grado di modulare l’attività degli enzimi che metabolizzano l’acido arachidonico (AA), come la fosfolipasi A2
(PLA2) xxi
, le ciclo ossigenasi (COX), la lipossigenasi (LOX)xxii, e l’ossido nitrico sintasi (NOS)xxiii. L’inibizione di questi enzimi riduce la produzione di AA, prostaglandine (PG), leucotrieni e NO, i quali rappresentano i mediatori cruciali dell’infiammazione. Di conseguenza, l’inibizione di questi enzimi da parte dei flavonoidi potrebbe essere uno dei più importanti meccanismi alla base della loro attività anti-infiammatoria.
2.4.1 Enzimi correlati al rilascio di AA
Il rilascio di AA rappresenta la tappa iniziale della risposta infiammatoria; esso è rilasciato all’interno delle cellule dai fosfolipidi di membrana mediante l’azione della PLA2 e successivamente metabolizzato dalle cicloossigenasi (COX) e dalle
lipossigenasi (LOX) in prostaglandine, leucotrieni vasoattivi LTC4, LTD4, LTE4 e nel
potente chemoattrattore LTB4 xxiv
. Diversi composti fenolici, come flavonoli e polifenoli, sono stati identificati come inibitori di questi enzimi, riducendo così il rilascio e il metabolismo dell’acido arachidonico, quindi, diminuendo la formazione dei mediatori dell’infiammazione.
Il primo flavonoide definito come inibitore della PLA2 fu la quercetina (Fig. 5) che
inibisce la PLA2 dei neutrofili umani xxv
. Più tardi, vari studi hanno riportato ripetutamente che la quercetina e altri flavonoidi inibiscono differenti isoforme di PLA2 provenienti da diverse fonti
xxvi . O O H OH OH OH O OH QUERCETINA Fig. 5
La cicloossigenasi (COX) è l’enzima responsabile della formazione di prostaglandine (PG) e del trombossano a partire dall’acido arachidonico (AA). L’enzima esiste in 2 isoforme denominate COX-1 e COX-2; la COX-1 è un enzima costitutivo ed esiste in tutti i tipi di cellule dell’organismo, mentre la COX-2 è un enzima inducibile che produce grandi quantità di PG e viene altamente espresso nelle cellule coinvolte nel processo infiammatorio quando queste vengono stimolate dalle citochine proinfiammatorie e/o lipopolisaccaride battericoxxvii. Le lipossigenasi (LOXs) sono invece responsabili della formazione di idrossiacidi e leucotrieni a partire dall’AA. Tra le varie isoforme di LOX, l’isoforma 5- e 12- sono coinvolte nei meccanismi allergici e infiammatori; la 5-LOX produce l’acido 5-idrossieicosatetraenoico (5-HETE) e leucotrieni (LTs), come LTA4 e LTB4, i quali sono potenti chemoattrattori,
mentre l’isoforma 12-LOX sintetizza l’acido 12-idrossieicosatetraenoico (12-HETE) che favorisce l’aggregazione piastrinica e induce la risposta infiammatoriaxxviii
.
Alcuni flavonoidi come la luteolina, la galangina o la morina (Fig. 6), in un primo tempo erano descritti come inibitori delle COX;
O O H OH O OH LUTEOLINA GALANGINA Fig. 6 O O H OH OH OH O H O MORINA
successivamente, da studi condotti sull’aggregazione piastrinica indotta da trombina, si osservò che certi flavonoidi si comportavano da inibitori sia delle COX che delle LOX, e questa attività antagonista era legata alle caratteristiche strutturali delle differenti molecole: i derivati flavonici come il flavone, l’apigenina e la crisina (Fig. 7) inibiscono l’aggregazione piastrinica mediante una depressione della via catalizzata dalle COX, mentre i composti relativi ai flavonoli come la miricetina (Fig. 7) e la quercetina inibiscono principalmente l’attività delle LOXxxix.
O O H OH O OH O O H OH O APIGENINA CRISINA
O O O O H OH O OH OH OH OH FLAVONE MIRICETINA Fig. 7
Dal momento che la via della LOX, quando la COX-2 è bloccata, produce ancora potenti mediatori dell’infiammazione, cioè i leucotrieni, la doppia inibizione COX/LOX offre un rilevante approccio allo sviluppo di nuovi trattamenti anti-infiammatorixxx. Alcuni polifenoli naturali come la curcumina (Fig. 8), sono inibitori sia della COX che delle LOX; questi composti possono modulare il metabolismo dell’AA a differenti stadi, mediante inibizione della fosforilazione della cPLA, inibizione dell’espressione della COX-2 e della sua attività catalitica e inibizione dell’attività della 5-LOX xxxi
. O O H MeO O OH OMe CURCUMINA Fig. 8
2.4.2 NO sintasi
L’ossido di azoto (NO), un mediatore cellulare ubiquitario dei processi fisiologici e patologici, è sintetizzato dalla L-arginina da un enzima noto come nitrossido sintasi (NOS) di cui ne sono state scoperte tre isoforme: la NOS endoteliale (eNOS), la NOS neuronale (nNOS) e la NOS inducibile (iNOS). Le prime due sono costitutivamente espresse nell’organismo, mentre l’ultima è attivata in modo specifico da stimoli infiammatori (LPS -lipopolisaccaride- e citochine) in determinate cellule come i macrofagixxxii, infatti è responsabile della sovrapproduzione di NO durante l’infiammazione. Quindi, composti che sono in grado di ridurre la produzione di NO mediata da iNOS senza coinvolgere eNOS e nNOS potrebbero essere dei promettenti agenti anti-infiammatori. Certi flavonoidi hanno mostrato la capacità di inibire la produzione di NO da parte dei macrofagi o di cellule simili attivate da stimoli infiammatorixxxiii. In relazione a ciò è stato riportato che l’alta affinità dei polifenoli per le proteine e il possibile successivo cambiamento conformazionale dell’enzima potrebbero essere associati con l’effetto inibitorio dei flavonoidi sull’attività dell’enzima iNOSxxxiv
. Però solo pochi studi hanno dimostrato un effetto diretto dei flavonoidi sull’attività dell’enzima. Lo studioso Cheon osservò gli effetti di alcuni flavonoidi e biflavonoidi sulla produzione di NO LPS-indotta su una determinata linea cellulare e trovò che questi composti inibivano la produzione di NO, un effetto mediato da una soppressione dell’induzione dell’enzima iNOS ma non dovuto ad una diretta inibizione della sua attività. L’unica eccezione era rappresentata dall’echinoisoflavone, il quale inibisce l’attività dell’enzima iNOS e sopprime il processo di induzione dello stesso enzimaxxxv. Studi condotti su isoflavoni quali la genisteina, la daidzeina e la gliciteina (Fig. 9) hanno rivelato che questi composti sono in grado di sopprimere con un meccanismo dose-dipendente, la produzione di NO, LPS-indotta, da parte dei macrofagi attraverso 3 differenti meccanismi: 1) azione “scavenger” contro i radicali NO; 2) inibizione dell’attività dell’enzima iNOS; 3) inibizione dell’espressione del gene che codifica per tale enzimaxxxvi
. Al contrario, altri studi meccanicistici hanno dimostrato che l’effetto inibitorio dei flavonoidi non
era dovuto ad una diretta azione sull’attività enzimatica, ma ad una riduzione dell’espressione genicaxxxvii
. O OH O H O OH HO O O OH GENISTEINA DAIDZEINA HO O O OH MeO GLICITEINA Fig. 9
2.5 Modulazione della produzione di altre molecole pro-infiammatorie
Oltre agli enzimi COX-2 e iNOS anche molte citochine sono associate con le malattie infiammatorie. In particolare il fattore di necrosi tumorale (TNF-), l’interleuchina 6 (IL-6) e l’interleuchina 1(IL-1), sono collaboratori di rilievo nella risposta infiammatoria cronica. E’ stato riportato che la genisteina, e altri flavonoidi come la luteolina e la quercetina sono in grado di inibire la produzione, LPS-indotta, di
IL-1IL-6 e TNF-in cellule umane, quali i monocitixxxviii e i macrofagixxxix. E, in particolare, la luteolina e la quercetina sono in grado di bloccare il rilascio di TNF- per più dell’80%.
Il confronto tra le strutture molecolari dei differenti flavonoidi mostra che la presenza di un doppio legame alla posizione C2-C3 dell’anello C con la funzione oxo alla posizione 4, e di gruppi OH nella posizione 3’ e 4’ dell’anello B, sono requisiti fondamentali per ottenere un efficiente inibizione LPS-indotta, del rilascio di
2.6 Modulazione dell’espressione dei geni pro-infiammatori
In anni recenti, molti studi hanno supportato l’idea che certi flavonoidi si comportano da modulatori dell’espressione dei geni pro infiammatori, comportando, quindi, una attenuazione della risposta infiammatoria. Non si sa in che misura tali cambiamenti nell’espressione di questi geni contribuisca alla risposta infiammatoria ma è evidente che i flavonoidi mostrano attività anti-infiammatoria, almeno in parte incidendo sui livelli di mRNA. I meccanismi mediante i quali i flavonoidi bloccano l’espressione dei geni pro infiammatori è attualmente in fase di indagine, anche se gli studi più importanti suggeriscono un effetto sulla soppressione dell’attività trascrizionale in risposta a stimoli infiammatori.xli
I principali componenti suscettibili all’azione dei flavonoidi sono le varie proteine chinasi coinvolte nei meccanismi di trasduzione del segnale, quali la proteina chinasi C (PKC) e la proteina chinasi mitogeno-attivata (MAPK). Attraverso l’inibizione di questi enzimi viene regolata la capacità dei fattori di trascrizione di legarsi al DNA, come il fattore NF-κB o la proteina attivatore 1 (AP-1), e di conseguenza ne risulta controllata la velocità di espressione del gene bersaglio.xlii
2.7 Attività anti-infiammatoria nelle malattie degenerative
L’infiammazione rappresenta una normale risposta cellulare nei confronti di un danno tissutale, però, spesso è un processo incontrollato in alcune malattie croniche autoimmuni, come l’artrite reumatoide e la malattia di Chrohn, o nelle reazioni allergiche come l’asma e lo shock anafilattico. In questi casi si ricorre ad una terapia con composti anti-infiammatori che andranno a bloccare la risposta infiammatoria. Piante ricche di determinati flavonoidi sono state ampiamente usate per le loro proprietà anti-infiammatorie e recentemente l’attenzione è stata focalizzata su alcuni di questi flavonoidi isolati, compresi quelli del genere Citrus, (naringenina, esperidina, catechina ed epicatechina) (Fig. 10) utilizzabili come potenziali agenti anti-infiammatori.xliii
O O H OH OH O O O H OH O OMe OH NARINGENINA ESPERIDINA O O H OH OH OH OH O O H OH OH OH OH CATECHINA EPICATECHINA Fig. 10
In realtà l’approccio ad un utilizzo dei bioflavonoidi nella terapia anti-infiammatoria e anti-età è controverso. La loro bassa biodisponibilità e la perdita di attività per via dei processi metabolici rappresentano i due principali fattori che si oppongono all’efficacia di supplementi dietetici a base di piante ricche di flavonoidi.xliv
Comunque, nonostante ciò, ricerche in vivo e studi clinici supportano ampiamente un loro potenziale utilizzo. Non solo essi sono facilmente disponibili e caratterizzati da costi più bassi rispetto ai principali farmaci anti-infiammatori, ma generalmente sono anche privi di effetti collaterali osservati invece con i classici anti-infiammatori. Recentemente è stata accertato che importanti malattie degenerative e particolari malattie del cervello sono correlate a processi infiammatori mediati dai ROS. Infatti, le risposte infiammatorie e i loro mediatori potrebbero giocare un ruolo centrale nella patogenesi di varie malattie degenerative che coinvolgono l’attivazione cronica delle cellule della microglia, come nel morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la sindrome dell’immunodeficienza acquisita correlata alla demenza.xlv
rappresenta un gruppo di cellule delle neuroglia che supportano, nutrono e proteggono i neuroni mantenendo l’omeostasi dei fluidi che li circondano. Le cellule della microglia si comportano come i macrofagi nel sistema nervoso centrale, migrano verso l’area del danno inglobando e distruggono i microbi e i detriti cellulari.xlvi La stimolazione della microglia produce diversi mediatori dell’infiammazione come NO e il fattore di necrosi tumorale, che in situazioni particolari possono risultare tossici per l’organismo e per questo sembrerebbero essere coinvolti nella patogenesi di varie malattie neurodegenerative. Da ciò si deduce quindi come sia fondamentale una attenta regolazione dell’attivazione della microglia al fine di evitare effetti dannosi. Possibili meccanismi in grado di provocare una down-regulation dell’attivazione della microglia potrebbero includere l’inattivazione o l’eliminazione delle cellule attivate.
Le cellule attivate della microglia e gli astrociti sono in grado di generare radicali liberi, compresi l’anione superossido e l’NOxlvii. I ruoli proposti per l’NO nella fisiopatologia del SNC sono sempre più diversificati e vanno dall’uccisione di cellule necrotiche ed agenti patogeni attraverso l’attivazione di segnali intercellulari, al suo coinvolgimento nell’apoptosi. L’inconveniente però è che alti livelli di NO, sintetizzato mediante l’enzima ossido nitrico sintetasi (iNOS), potrebbero risultare citotossici, più probabilmente per la formazione del perossinitrito.xlviii
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