MATERIALI E METODI
Allo scopo di ottenere gli animali su cui ho condotto gli esperimenti, ho incrociato topi eterozigoti per due distinti alleli knockin disponibili in laboratorio: Hoxa2/τLacZ e Hoxa2EGFP (si rimanda all'introduzione per una loro descrizione
dettagliata). Gli animali, stabulati con cicli luce/buio di 12 ore, sono stati posti in accoppiamento alla fine della fase di luce. L'indomani ho considerato gestanti allo stadio 0.5 dpc le femmine che presentavano un "plug" vaginale. 12 ore dopo la nascita gli animali sono stati sacrificati e, con l'ausilio di uno stereomicroscopioho estratto l'encefalo che successivamente è stato processato sulla base delle applicazioni successive: congelato per criosezioni o immerso in adeguati fissativi per la colorazione Xgal o la microiniezione di traccianti retrogradi fluorescenti (DiI).
1- Genotipizzazione
Dopo aver effettuato una biopsia a livello della coda degli animali di cui deve essere determinato il genotipo, si procede all’estrazione del DNA genomico. Il tessuto è incubato in 400 µl di Tail Buffer e lasciato “over night” (o/n) a 50°C. Dopo un passaggio in centrifuga per rimuovere le parti di tessuto non digerite del campione, si procede alla precipitazione del DNA con isopropanolo. Successivamente il “pellet” è lavato con etanolo 70% e risospeso in TE (100 mM TRIS pH 8,1 mM EDTA). La presenza del transgene nelle diverse linee murine in uso, viene quindi verificata mediante la tecnica della PCR con oligonucleotidi specificificamente disegnati. I campioni amplificati sono successivamente migrati su un gel di agarosio al 1% (peso/volume) e visualizzati grazie ad una colorazione con etidio bromuro (EtBr) ai raggi UV.
Soluzioni:
Tail Buffer
Tris pH 8.5 100mM
EDTA 5mM ProteinasiK 1 mg/ml
2- Colorazione cromogenica per la β-galattosidasi
Dopo aver sacrificato gli animali a stadio P0.5, questi vengono mantenuti in una soluzione salina (1x PBS) e dopo la dissezione dell’encefalo si procede alla fissazione in una soluzione contenente PBS 1x / formaldeide 2% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) mantenendo il preparato in lenta agitazione. Successivamente, vengono effettuati tre lavaggi da 5 minuti ciascuno in PBS per rimuovere la formaldeide. A questo punto gli encefali vengono incubati in presenza di Xgal nella soluzione di colorazione a 30°C per un tempo compreso tra 4 ore ed o/n. Al termine della reazione di colorazione gli encefali risultati positivi alla colorazione LacZ sono lavati 3 volte per 5 minuti in PBS prima di essere post-fissati in parafolmaldeide (PFA) al 4% in PBS a 4°C o/n.
Soluzioni:
Tampone fosfato salino (PBS):
Nacl 137mM
KCL 2.7 mM
Na2HPO4 10 mM
KH2PO4 2 mM
Soluzione di colorazioneper la β-galattosidasi:
K4Fe(CN)6 5 mM K3Fe(CN)6 5 mM X-gal 1.0 mg/ml MgCl2 2 mM NP40 0.2% Sodio deossicolato 0.1% PBS 1x a volume
3- Preparazione dei tessuti per esperimenti di ibridazione
in situ
Gli embrioni fissati o/n in 4% paraformaldeide (PFA) / 1x PBS a 4°C vengono lavati (tre lavaggi da 5 minuti in PBS) per rimuovere la PFA. A questo punto i preparati sono equilibrati in 30% saccarosio / 1x PBS a 4°C. e quindi inclusi in“Tissue Tek”, e congelati a –80°C. Successivamente i preparati vengono tagliati al criostato in sezioni di 12mm di spessore. Le sezioni possono quindi essere conservate a –80°C fino al momento dell’uso. Alternativamente, gli embrioni o gli encefali estratti possono essere deidratati in una serie crescente di alcool metilico in PBS fino all’equilibratura in 100% metanolo (MeOH)ed essere conservati a –20°C per alcuni mesi per essere impiegati in esperimenti ibridazione in situ “whole mount”.
4- Ibridazione in situ
4.1- Preparazione della sonda
Per preparare una sonda a RNA è necessario digerire il plasmide contenente il cDNA del gene di interesse con un enzima che taglia una sola volta nel costrutto al 5’ dell’inserto di cDNA in modo da ottenere un frammento di DNA lineare. Questo DNA viene purificato mediante estrazione fenolica e poi utilizzato in una reazione di trascrizione in vitro con la polimerasi che riconosce il promotore posto al 3’ dell’inserto, in modo da ottenere un trascritto “antisenso”.
Si effettua una reazione di trascrizione come descritto in Melton et al., 1985 usando le RNA polimerasi Sp6, T7 o T3 , ed aggiungendo alla miscela di reazione un ribonucleotide sostituito in posizione 11, con digossigenina (DIG). La miscela di reazione viene preparata aggiungendo i reagenti a temperatura ambiente.
Esempio di reazione condotta in 20µl:
Tampone di trascrizione 5x 4 µl
DTT 100mM 2 µl
RNA polimerasi 2 µl Miscela di ribonucleotidi (dNTPs) e UTP-Dig 2.5 mM 8µl
H2O RF fino a 20 µl
Per purificare la sonda trascritta dai nucleotidi non incorporati si procede ad una precipitazione alcolica in cui a 66 µl di EtOH assoluto si aggiungono 2.2 µl di litio cloruro 4M . Dopo aver mescolato, capovolgendo il tubo diverse volte, si mette il tutto a precipitare a -20°C, per almeno 4 ore, oppure, a -80°C per 1 ora. A questo punto si centrifuga il campione a 12000 rpm a 4°C, per 20 minuti; poi, eliminato il sovranatante, si aggiungono al pellet 100 µl di EtOH 70% pre-raffreddato e si centrifuga a 12000 rpm a 4°C, per 5-10 min. Si libera, infine, il pellet da tutto l’etanolo residuo, lasciandolo evaporare all’aria a temperatura ambiente e si risospende in 20 µl di H2O RF (oppure
TE pH 7.5 RF). La stima della quantità del trascritto ottenuto viene effettuata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio, servendosi dell’ausilio di tRNA a concentrazione nota, come marcatore di quantità. I trascritti possono essere conservati in “stock” 10X (10 µg/ml) nella miscela di ibridazione.
Cloni usati per l’ibridazione in situ
Tag1: linearizzato con XbaI; trascritto con T3. Cad6: linearizzato con SmaI; trascritto con T7. Cad7: linearizzato con NotI; trascritto con T7. Cad8: linearizzato con HindIII; trascritto con T3. Cad11: linearizzato con SmaI; trascritto con T7. EphA2 (Sek2): linearizzato con ClaI; trascritto con T7. EphA3: linearizzato con HindIII; trascritto con T3.
EphA4 (Sek1): linearizzato con HindIII; trascritto con T7. EphA5: linearizzato con BamHI; trascritto con T7. EphB1: linearizzato con BamHI; trascritto con T7. EphB2 (Sek3): linearizzato con KpnI; trascritto con T7. Robo2: linearizzato con NotI; trascritto con T7.
Sema5A: linearizzato con EcoRI; trascritto con T7. Sema7A: linearizzato con EcoRI; trascritto con T7. Sema3E: linearizzato con NotI; trascritto con T7. Sema4F: linearizzato con HindIII; trascritto con T3. Slit1: linearizzato con NotI; trascritto con T7. Slit2: linearizzato con NcoI; trascritto con Sp6.
Slit3: linearizzato con HindIII; trascritto con T3. ErbB3: linearizzato con BamHI; trascritto con T7. ErbB4: linearizzato con HindIII; trascritto con T3.
4.2- Ibridazione in situ su sezione
I vetrini vengono lasciati scongelare a RT. Si effettuano lavaggi successivi in PBS per rimuovere l’eccesso di “Tissue Teck”. Su ogni vetrino vengono aggiunti 200 µl di “Hybridisation buffer” addizionato con la sonda marcata alla concentrazione finale di 0.5-1 µg/ml e si ibrida a 65°C o/n. Si effettuano 4 lavaggi con “washing solution” per 30 minuti ciascuno a 65°C. Successivamente si fanno 2 lavaggi con MAB per 30 minuti ciascuno a RT. Segue una preincubazione di 1 ora a RT in MAB + 2% reagente bloccante + 20%. siero di pecora. Si incuba per tutta la notte a 4°C con anticorpo antidigossigenina (1:4000) coniugato alla fosfatasi alcalina, diluito in una soluzione di MAB + reagente bloccante 2% reagente bloccante + 20%. siero di pecora. Per rimuovere l’eccesso di anticorpo dalle sezioni si effettuano lavaggi con MAB a RT di 60 minuti per 4 ore. L’ultimo lavaggio viene sostituito con il tampone per la fosfatasi alcalina (APB), 2 volte per 10 minuti. Nell’ultimo lavaggio con l’APB si aggiunge Levamisole (0.0005 gr/ml), una sostanza in grado di inibire le fosfatasi endogene ma non quella coniugata all’anticorpo anti-DIG.
Si aggiunge infine la soluzione di rivelazione composta da NBT e BCIP (3.5 µl/ml di ciascun substrato) in APB. Se il segnale è soddisfacente si procede bloccando la reazione cromogenica rimuovendo il tampone per la fosfatasi alcalina e lavando i vetrini in PBT. A questo punto si effettua un passaggio veloce in acqua per rimuovere l’eccesso di sali dalle sezioni che successivamente vengono lasciate asciugare all’aria e poi coperte con vetrino copri oggetto ed un montante tipo “Eukitt”.
Soluzioni:
Hybridisation buffer:
10 x salt 1 x
Formammide 50%
H2O a volume
Washing solution:
Formammide 50%
SSC 1x
Tween 20 0.1%
4.3- Ibridazione in situ radioattiva
4.3.1- Preparazione della sonda
Per preparare la sonda a RNA marcata radioattivamentesi procede come descritto precedentemente ad eccezione del fatto che alla miscela di reazione viene aggiunto un nucleotide marcato con 35S che presenta una sostituzione al gruppo
fosfato in posizione α.
Esempio di reazione condotta in 20 µl:
Tampone di trascrizione 5X 1 µl
DTT 100mM 6 µl
DNA linearizzato (0.5 µg/µl) 1 µl
Rnase-inhibitor (40 U/µl) 1 µl
RNA Polymerase (20-25 U/µl) 2 µl
Miscela di ribonucleotidi (ATP, GTP, UTP ) ognuno 10mM 6 µl
0.25 mM CTP 2 µl
35S CTP (1250 Ci/mmol) 2 µl
H2O fino a 20 µl
La reazione viene incubata a 37°C per 2 ore, viene aggiunto 1µl di DNAsi RQ e si precede ad un’altra incubazione di 30 minuti a 37°C. Questo passaggio ha la funzione di digerire il DNA utilizzato come stampo per la trascrizione. Quindi si procede con l’idrolisi della sonda: questo passaggio permette di ottenere frammenti di RNA di dimensioni variabili comprese tra150 e 300 bp circa.
Si porta quindi il volume della miscela a 50 µl con acqua “Rnase free” (RF) e si aggiungono 50 µl della soluzione A. Si incuba a 60°C per il tempo calcolato dalla seguente formula:
t= (L – 0.15) / (0.11 x 0.15 x L) t: tempo della reazione (minuti) L:lunghezza iniziale del trascritto (kb)
Si neutralizza poi immediatamente la reazione di idrolisi aggiungendo 50 µl della soluzione B in ghiaccio per qualche minuto.
La sonda così idrolizzata viene purificata mediante cromatografia per esclusione passando la miscela su una colonna Sephadex G50 precedentemente equilibrata con Tris HCl 10mM pH7.5, EDTA 5mM, SDS 1%, DTT 10mM.
Si raccoglie quindi la frazione eluita e si misura l’incorporazione di 35S-UTP
nella sonda allo scintillatore. 0.5-1.5 milioni cpm / µl della sonda sono consigliati per ottenere un buon segnale autoradiografico risultante dall’esperimento di ibridazione in situ . La sonda può essere conservata per uno-due mesi a -20°C.
4.3.2- Ibridazione in situ radioattiva su sezione
I vetrini vengono immersi, senza farli scongelare, in acetone freddo per 5 minuti per delipidare il tessuto e vengono poi lasciati asciugare completamente.
Segue un passaggio di 15 minuti in PFA 4% in PBS e quindi 2 lavaggi successivi di 5 minuti in PBS per rimuovere l’eccesso di PFA.
Si procede poi all’acetilazione, che permette di saturare i siti carichi positivamente. Si effettuano 2 passaggi di 5 minuti l’uno in Trietanolammina (TEA) 0.1M pH8 a cui viene aggiunta per due volte consecutive in lenta agitazione 625µl di anidride acetica per 250mL di TEA. Si lavano quindi le sezioni dall’eccesso di TEA 5 minuti per 2 volte in PBS. Si procede quindi alla disidratazione dei vetrini mediante una serie crescente di alcool etilico in PBS fino all’equilibratura in 100% etanolo (EtOH). I vetrini vengono quindi fatti asciugare.
da avere 35000000 cpm/ ml di miscela di ibridazione. Si ibrida a 52°C o/n. Si effettuano quindi una serie di lavaggi:
1 lavaggio in SSC 2X, formammide 50% per 30 minuti a 55°C; 3 lavaggi in SSC 4X per 10 minuti ciascuno a 37°C;
1 passaggio in SSC 4X a cui è stata aggiunta RNasi (20_g / mL) per 30 minuti a 37°C;
1 lavaggio in SSC 4X per 10 minuti a 37°C;
1 lavaggio in SSC 2X, formammide 50% per 30 minuti a 55°C; 2 lavaggi in SSC 2X per 15 minuti a 55°C;
1 lavaggio in SSC 0.1X per 15 minuti a 55°C.
Si procede quindi alla disidratazione dei vetrini mediante una serie crescente di alcool etilico in ammonio acetato 0.3M fino all’equilibratura in 100% etanolo (EtOH). I vetrini vengono infine fatti asciugare ed esposti su lastra autoradiografica Kodak di tipo Biomax MR per un tempo sufficiente. La lastra viene sviluppata in camera oscura immergendola 3 minuti in una soluzione di sviluppo Kodak e successivamente 3 minuti in una soluzione fissativa.
Soluzioni: Soluzione A NaHCO3 80mM Na2HCO3 120mM DTT 10mM Soluzione B NaAc 200mM Acido acetico 1% DTT 10mM “Hybridisation buffer” Formammide 50% NaCl 0.3M TrisHCl pH 6.8 20mM EDTA 5mM NaHPO4 10mM Destran solfato 10% Denhardt’s 1X
tRNA 0.5mg/mL
DTT 10mM
5- Colorazione anterograda con DiI
I cervelli prelevati dagli animali a stadio P0.5 sono fissati in 4% parafolmaldeide in PBS per alcuni giorni e iniettati con il tracciatore carbocianina DiI. La microiniezione del tracciante al nucleo pontino in posizione parasagittale permette di marcare il nucleo e le fibre su entrambi i lati dell’encefalo in quanto le fibre muscoidi proiettano al cervelletto per il 95% in maniera controlaterale. La marcatura avviene in un tempo variabile tra 3 ed 8 settimane a secondo della distanza tra il punto di applicazione sulla membrana plasmatica e la localizzazione dell’apice dell’assone. I risultati vengono visualizzati con uno stereomicroscopio equipaggiato di un sistema per epifluorescenza.
6- Acquisizione ed elaborazione delle immagini
I preparati sono stati analizzati con un microscopio convenzionale ed uno stereomicroscopio Nikon. Le immagini sono state acquisite con fotocamera “CoolSnap” Photometric e le immagini delle lastre autoradiografiche sono state acquisite con un sistema di “scanning” Nikon “CoolScanII”. Le tavole delle figure sono state ottenute impiegando “software” di grafica tipo Photoshop e programmi dedicati per la sovrapposizione delle immagini.
