Stimolazione neurale tramite
interfaccia costituita da array di
nanotubi di carbonio (CNT)
Il sistema nervoso utilizza segnali elettrici, come i potenziali d’azione (AP), che possono essere misurati e modulati con dispositivi elettronici.
La stimolazione elettrica funzionale (FES), è stata per lungo tempo riconosciuta come un’effettiva tecnica terapeutica nella riabilitazione fisica.
Recentemente, sono stati fatti straordinari progressi nella creazione di interfacce elettriche con sistemi neurali. La stimolazione cerebrale profonda (DBS), per esempio, è uno dei più efficienti metodi di FES ed è attualmente utilizzata per trattare milioni di pazienti con disordini del movimento, come ad esempio il morbo di Parkinson, l’epilessia, disturbi mentali, etc [1]. Alcuni dispositivi sono stati impiantati con successo nella coclea, nel cervello, nell’occhio per estrarre segnali neurali e restituire la perduta o compromessa, funzionalità muscolare o sensoriale. In questi dispositivi un’efficiente interfaccia neurale elettrica è il componente più critico e complesso da realizzare. Array di microelettrodi (MEA), con diametro per ogni elettrodo di circa 100 micrometri o più, sono attualmente utilizzati come dispositivi per interfacce elettriche con cellule neurali. Sebbene i MEA siano strumenti di grande successo, sono molto lontani da poter essere ottimizzati per un
estremamente difficile accedere ad una rete neuronale 3D con elettrodi troppo grandi [2].
La miniaturizzazione di MEA è limitata dall’alta impedenza elettrica e dalle caratteristiche meccaniche dei materiali. Il modulo di Young dei tessuti neurali (2,5 KPa) è più basso di quello degli elettrodi metallici (>10 GPa) di circa sei ordini di grandezza e ciò comporta problematiche non banali di incompatibilità meccanica per i dispositivi impiantabili [3].
Negli ultimi anni perciò, la ricerca si sta impegnando nella scoperta e nell’introduzione di nuovi materiali e nuovi metodi di fabbricazione per lo sviluppo di una nuova generazione di dispositivi impiantabili che possano risolvere queste problematiche [4].
Una stimolazione neurale ideale, richiede efficacia e sicurezza; è necessario un’alta densità di corrente in piccoli elettrodi, caratteristica questa in conflitto con il requisito di sicurezza elettrochimica. Infatti, cambiamenti elettrochimici possono non solo, causare danni agli elettrodi ma anche creare disordini nella funzionalità neurale e nella struttura biologica. Una ampia varietà di metalli e leghe metalliche, sono state impiegate nella fabbricazione di elettrodi [5].
Recentemente l’interesse è stato rivolto ai nanotubi di carbonio, (CNT) ritenuti potenziali materiali per poter ristabilire intricate connessioni a livello neurale grazie alla loro alta conducibilità elettrica e alle loro dimensioni nanometriche [6] [7].
2.1 Nanotubi di carbonio
I nanotubi di carbonio vennero scoperti nel 1991 da S. Iijima in Giappone [8]. Per mezzo di un microscopio elettronico a trasmissione ad altissima risoluzione Iijima osservò strutture tubulari di tipo fullerenico nella fuliggine prodotta in una scarica ad arco tra due elettrodi di grafite. Si tratta di strutture di carbonio a forma di ago e ciascun ago comprende tubi coassiali di fogli grafitici, o di grafene, con le estremità chiuse da cupole emisferiche di strutture simili al fullerene (i fullereni sono delle
“gabbie” approssimativamente sferiche formate da un arrangiamento ordinato di strutture esagonali e pentagonali di atomi di carbonio).
I nanotubi possono essere suddivisi in due categorie: nanotubi a parete singola, SWNT (single wall nanotube), se costituiti da un solo foglio e nanotubi a multi parete MWNT (multi wall nanotube), se formati da fogli posizionati come cilindri concentrici.
Fig. 2.1 Immagini di CNT (sinistra) SWNT (single wall nanotube),
(destra)MWNT (multi wall nanotube)
2.1.1 Caratteristiche dei CNT
I nanotubi a base di carbonio hanno interessanti proprietà elettriche, meccaniche e chimiche che li rendono adatti ad essere impiegati nella realizzazione di elettrodi neurali.
I CNT sono alcuni dei materiali più resistenti e duri; evidenze sperimentali dimostrano che possono dar luogo a rigide bacchette elastiche di densità molto bassa, con proprietà meccaniche, come forza tensile e modulo di Young uniche, per cui i nanotubi sono i candidati ideali per materiali compositi ad elevata prestazione. La forza e la rigidità dei nanotubi a base di carbonio sono il risultato dell'ibridazione sp2 del legame carbonio-carbonio. I valori medi del modulo di Young si aggirano
Per quanto riguarda le caratteristiche elettriche, il trasporto elettronico nei nanotubi ha luogo lungo la lunghezza, per cui essi sono in grado di trasportare correnti elevate senza surriscaldarsi (fenomeno chiamato “conduzione balistica”). I nanotubi hanno mostrato delle sorprendenti proprietà di conduttività che cambiano secondo la loro geometria: i SWNT mostrano un comportamento metallico, gli altri un comportamento da metallo o da semiconduttore a seconda dei casi. Queste proprietà rendono i nanotubi molto interessanti per lo sviluppo di “nanocavi” o “cavi quantici”, che potrebbero sostituire il silicio nel campo dei materiali per l'elettronica, e consentire il passaggio dalla microelettronica alla nanoelettronica. Inoltre, i CNT possono essere trattati in maniera da diventare estremamente sensibili alla presenza di campi elettrici ad alto voltaggio, reagiscono a tali campi piegandosi fino a 90°, per riprendere la forma originale non appena il campo elettrico viene interrotto [9].
Le proprietà fisiche e chimiche che caratterizzano i CNT, li rendono ampiamente utilizzati in applicazioni biologiche e mediche. La natura dell’interazione tra i CNT e le cellule/tessuti non è ancora conosciuta, sebbene studi recenti suggeriscano che i nanotubi di carbonio hanno effetti dannosi sulle cellule ma l’aggiunta di surfattanti con cui possono essere trattati i CNT può contribuire ad aumentare la permeabilità della membrana cellulare [10] [11]. Prima che i CNT possano essere incorporati in impianti biomedici, è necessario stabilire la loro biocompatibilità. Altri biomateriali basati su carbonio hanno dimostrato eccellente biocompatibilità a lungo termine in applicazioni e dispositivi medici [12].
2.2 Metodi di preparazione di array di CNT
Gli array di nanotubi di carbonio, per interfacce neurali descritti in letteratura vengono fatti crescere attraverso un trattamento chimico di deposizione a vapore di plasma (PECVD) utilizzando il catalizzatore Ni, su uno spessore di 200 nm di Cr che ricopre un wafer di silicio [13].
Il diametro medio di ogni nanotubo è circa 80 nm, con un’altezza media di 7 µm approssimativamente ma entrambi i parametri possono essere variati cambiando le condizioni di crescita. Ogni nanotubo è separato dal suo vicino da uno spazio medio di circa 300 nm che corrisponde ad una densità superficiale di 8±1×108/cm2.
I campioni sono generalmente trattati con una soluzione 1 M di HNO3 per 30 min, al fine di rimuovere il catalizzatore Ni, poi lavati accuratamente con acqua deionizzata, successivamente asciugati e conservati prima di eventuali e successivi esperimenti. L’array di nanotubi risulta come un materiale altamente poroso 3D e con un’ampia superficie libera accessibile agli elettroliti
2.3 Caratterizzazione elettrica di microelettrodi basati
su array di CNT
Molti studi hanno dimostrato che i CNT disposti in array possono essere utilizzati come supercapacitori elettrochimici. Gli array di nanotubi quando sono immersi in liquidi tendono ad unirsi in microbundles, ossia le punte tendono ad unirsi, ciò a causa della forza di capillarità del solvente, dopo che il campione è tolto dalla soluzione. Fig. 2.2 mostra un’immagine al SEM dei nanotubi dopo immersione in una soluzione e successiva esposizione in aria.
Fig. 2.2 Immagini al SEM: a) array di nanotubi, b) array di nanotubi dopo
essere stati immersi in acqua e poi asciugati; c), d) array di nanotubi dopo la deposizione di un film di polipirrolo di 40nm di spessore
Idealmente, come interfacce elettriche neurali è desiderabile un nanoarray uniforme e stabile, caratteristiche queste che possono essere raggiunte attraverso la deposizione elettrochimica di un film uniforme di un polimero conduttivo come ad esempio il polipirrolo (PPy) attorno alla superficie dei nanotubi.
Un film sottile di questo polimero attorno alla superficie dei nanotubi, aumenta drasticamente la forza meccanica rendendoli più resistenti e abili a mantenere la loro struttura verticale quando immersi, oppure tolti fuori da una soluzione.
Come già detto precedentemente,un elettrodo ideale per la stimolazione elettrica funzionale, deve condurre corrente al tessuto con cui è in contatto in pochissimo tempo, dell’ordine dei millisecondi ad un potenziale abbastanza basso, ma tale da poter far raggiungere l’elettrolisi sia dell’acqua che delle biomolecole.
Questo richiede una bassa impedenza di circa 1 KHz di frequenza, tipicamente ottenuta creando un’ampia capacità oppure incorporando una pseudocapacità all’interfaccia elettrodo-elettrolita. L’ampia area superficiale dell’array di CNT è ideale per questo scopo.
Fig. 2.3 Caratterizzazione ciclovoltammetrica di array di CNT
Fig. 2.3 mostra i dati dell’andamento della corrente di un array di nanotubi in una soluzione di KCl ad una scan rate di 100 mV/s. La differenza della corrente (∆i), corrisponde alla somma delle correnti di carica e scarica all’interfaccia elettrodo-elettrolita. È possibile quindi ricavare la capacità specifica relativa all’elettrodo superficiale C 0
v i Co =∆ 2
Si ottiene un valore di C ≈ 0,4 mF cm0 −2. Questo valore è 10 volte
più alto degli elettrodi che utilizzano convenzionali metalli nobili (≈20 µF cm−2) ma leggermente più bassa rispetto agli elettrodi in metallo ricoperti
da un film di ossido di iridio (≈0,6 mF cm−2).
Dopo aver deposto un film di PPy con uno spessore di 24 e 147 nm rispettivamente, il valore di ∆i è aumentato di circa 100 e 250 volte che corrispondono ad una capacità specifica di 40 e 100 mF cm−2
Fig.2.4 Cyclic voltammetry di CNT ricoperti da 24
nm e 147 nm di film di PPy
I risultati ottenuti sono migliori rispetto agli elettrodi in ossido di iridio e il significativo aumento in capacità è attribuibile alla presenza del film di polipirrolo deposto.
Lo stato di ossidazione del PPy cambia durante la reazione faraidica che risulta in un flusso di anioni dopanti attraverso il film di PPy e la soluzione elettrolitica. Il dopante, principalmente ioni Cl , è − compatibile con l’ambiente fisiologico, in contrasto invece con i cambiamenti dannosi di pH che incorrono con l’impiego di elettrodi in ossido di iridio durante la stimolazione elettrica. Queste opportune modifiche su un array di nanotubi forniscono un modello di riferimento stabile e nanostrutturato per la creazione di un nuovo substrato di polimero conduttivo finalizzato al miglioramento nella stabilità meccanica e nella conducibilità elettrica. Fig. 2.5 mostra il diagramma di Nyquist dello spettro di impedenza dell’array di CNT misurato ad una frequenza che varia in un range da 100 KHz a 1 Hz.
Fig. 2.5 Diagramma di Nyquist dello
spettro di impedenza di un array di nanotubi
I dati possono essere fittati con un semplice circuito che consiste in un resistore disposto in serie con una CPE (costant phase element), definita come un’impedenza Z con la seguente espressione:
α
ω) /( 1 Y0i Z =
Dove ω è la frequenza angolare (ω=2πf) ed f è la frequenza convenzionale in Hz. Y e α sono dei parametri per il fitting ed in 0 particolare α varia da 0,8 a 1. Una CPE si comporta come un capacitore puro, quando α è uguale a 1. La ragione fisica del perché viene utilizzata una CPE invece di una capacità è dovuta alla struttura porosa 3D ed alla non omogenea attività elettrolitica nei diversi punti dell’array di nanotubi.
Dopo la deposizione del film di PPy l’impedenza diminuisce di circa 20 volte e lo spettro di impedenza cambia drasticamente rispetto all’array di nanotubi. I dati possono essere fittati con un circuito equivalente, che introduce un altro resistore Rct che corrisponde alla
2 / 1 2 / 1 coth[ ( ) ) (jω B jω A ZD = −
Dove A e B sono dei parametri per il fitting dei dati.
Fig. 2.6 Diagramma di Nyquist dello
spettro di impedenza di un array di nanotubi ricoperti da polipirrolo
A tutte le frequenze (eccetto per frequenze con f< 10 Hz), ZD è uguale alla CPE ma con α = 0,5. Per frequenze maggiori di 1 kHz l’impedenza è dominata da R , resistenza della soluzione, di 250±20 Ώ s mm−2 simile alla R dei CNT
È sorprendente come entrambi gli spettri di impedenza, sia dei CNT semplici che di quelli ricoperti di PPy, possano essere fittati con semplici circuiti equivalenti. La bassa impedenza dei nanotubi ricoperti di PPy è un grosso vantaggio e soprattutto una caratteristica fondamentale per la realizzazione di elettrodi neurali.
2.4 Prove in vitro su array di CNT
Il centro di ricerca di nanotecnologia NASA, presso gli USA, ha seguito uno studio in cui è stato dimostrato che i nanotubi di carbonio
disposti verticalmente possono essere usati come una matrice 3 D sui quali poter far crescere una rete di cellule neuronali. Nel lavoro svolto le cellule utilizzate sono le PC12.
È stato trovato che le cellule neuronali PC12, coltivate su nanotubi possono estendersi e formare una rete neurale adatta per modificazioni chimiche e biochimiche.
L’obiettivo dello studio, è stata la validazione di un nuovo tipo di “piattaforma biologica”, tale che possa essere utilizzata per due applicazioni: da una parte lo studio dell’interazione cellula-substrato e dall’altro lo sviluppo di dispositivi neurali impiantabili a lungo termine.
Le cellule tessutali sono circondate completamente da una matrice tridimensionale che influenza dinamicamente le funzioni cellulari attraverso una combinazione di segnali fisici e chimici. Lo sviluppo di biomateriali che possano mimare l’ambiente biologico è essenziale per migliorare la funzione e l’attendibilità di dispositivi impiantabili biomedici. È stato dimostrato che la geometria dell’area di adesione e la topografia del substrato influenzano drasticamente la motilità e l’allineamento delle cellule. In particolare se le dimensioni del substrato sono paragonabili alle dimensioni delle cellule l’influenza è ancora più pronunciata.
I dispositivi ad oggi utilizzati sono basati su un array di microelettrodi fabbricati su un substrato solido in cui le dimensioni degli elettrodi sono circa 40-100 µm. Confrontando il corpo cellulare o i componenti subcellulari come i neuriti, la superficie dell’elettrodo è approssimativamente una superficie 2D chiaramente poco efficace come interfaccia per la rete 3D del tessuto neurale.
La miniaturizzazione dei MEA è limitata dall’alta impedenza elettrica nonché dalla robustezza dei materiali metallici. L’introduzione di nuovi materiali come ad esempio i CNT mira alla risoluzioni di tali problematiche che grazie alla loro struttura caratterizzata da nanofibre, (e
Un problema comunque non indifferente dei CNT, ed anche dei tradizionali elettrodi in metallo, è la superficie rigida. È noto che le cellule neurali sono molto sensibili alla stiffness meccanica dei substrati e soprattutto ai contatti locali [14]. In studi passati, si è cercato di modificare la superficie elettrica del metallo con film di polimeri conduttivi (ECP) per cercare di rendere l’interfaccia più soffice. Film porosi 3D di ECP hanno mostrato un aumento significativo nelle proprietà elettriche con una bassa impedenza ed un’alta efficienza nel convertire correnti da un circuito elettronico in correnti ioniche in un tessuto.
Recentemente è stato dimostrato che i CNT allineati verticalmente possono essere usati come modello di riferimento per la deposizione di polimeri elettricamente conduttivi creando una struttura 3D con interessanti caratteristiche topografiche ed elettriche [15-17]. Il presente lavoro di tesi prende le mosse dallo studio sopramenzionato che mostra l’interazione tra la rete neurale di PC12 e l’array di CNT, a livello subcellulare. Questa architettura nanoingegnerizzata potrebbe costituire una nuova piattaforma che tiene conto di parametri meccanici, elettrici e biochimici per interfacce biologiche. Il paragrafo successivo fornisce maggiori dettagli su tale studio.
2.4.1 Materiali e Metodi
Fabricazione e pretrattamento dell’array di nanotubi di Carbonio (CNT)
Dopo la preparazione dell’array di CNT una parte di campioni sono stati fatti asciugare all’aria e conservati prima degli esperimenti con le cellule, altri campioni sono stati mantenuti in acqua prima di essere immersi in una soluzione contenente pirrolo per la deposizione del polimero sulla superficie dei CNT.
Fig.2.7 Deposizione del polipirrolo e collagene sull’array di nanotubi
In tale lavoro si fa uso di un array di CNT su cui è deposto un sottile strato di PPy e di collagene dell’ordine dei nanometri. La deposizione elettrochimica del polimero conduttivo è eseguita con una soluzione di 0,1 M PPy in 0,1 M di polistirenesulfonato (PSS) ad una tensione di 1,05 V per una densità di carica di circa 1 C/cm2; i campioni
vengono poi risciacquati in acqua e lasciati asciugare. Prima della semina delle cellule, al fine di facilitare l’adesione cellulare l’array è pretrattato con un sottile strato di una proteina immergendo in una soluzione 10
ml g /
µ contenente collagene di tipo IV in 0,05 M di HCl per 30 minuti. I campioni sono stati risciacquati in PBS e disposti in dischi per culture cellulari di 35 mm e seminati con 2,5×105cellule per disco.
Successivamente viene aggiunto l’NGF (nerve growth factor) un fattore di crescita che facilita l’estensione dei neuriti formando una rete neuronale
Colture cellulari
(fetal bovin serum), 5% di siero di cavallo, 2mM L-glutammina,
1
100µgmL− di streptomicina, 100 unità mL e incubate a 37°C in −1
atmosfera controllata al 5% CO e 95%2 O , 25ng 2 1 −
mL di NGF) è aggiunto due giorni dopo la coltura per indurre la differenziazione delle cellule.
Il mezzo di crescita con tutte le aggiunte è cambiato ogni 2-3 giorni e le cellule sono coltivate per un totale di 7 giorni fino alla formazione di una rete neuronale.
Risultati e discussione
La deposizione del pirrolo, lo strato di collagene e il fattore di crescita NGF, sono stati introdotti per modificare le proprietà elettriche, la superficie di adesione e la morfologia.
Fig. 2.8 Crescita delle cellule sui nanotubi
Dai risultati sperimentali è emerso che lo strato uniforme di collagene promuove la crescita e l’adesione cellulare. Le immagini al SEM mostrano che le PC12 sono cresciute con successo e hanno proliferato in diversi strati, creando una rete 3D
Fig. 2.9 Immagini al SEM della rete neurale
delle PC12 su CNT ricoperti da PPy
Fig. 2.10 Immagini al SEM della rete neurale
delle PC12 su CNT ricoperti da PPy
Il sottile strato di PPy aumenta la forza meccanica dei CNT cosicché essi rimangono nella loro originale forma verticale.
Lo strato di polimero elettroconduttivo, sulla superficie degli elettrodi, non solo aumenta l’efficacia della stimolazione elettrica e della biocompatibiltà, ma può fornire un metodo per il rilascio controllato di farmaco nell’ambiente circostante all’elettrodo.
Studi recenti hanno dimostrato che farmaci antinfiammatori, come ad esempio il dexamethasone, caricati sul film di polimero conduttivo sulla superficie del microelettrodo possono effettivamente rilasciare dalla contrazione del polimero guidata in tensione o semplicemente per
film di PPy e collagene non sono ottimali sistemi di rilascio e propone un metodo alternativo basato sull’uso di film di alginato combinati con l’utilizzo di film di PPy (per le proprietà elettriche e meccaniche dei CNT) e del film di adesione (per facilitare lo spreading cellulare).
L’obiettivo di questo lavoro di tesi sarà dunque la creazione di un array di nanotubi di carbonio a rilascio di farmaco per la realizzazione di interfacce neurali innovative.
