F2, F5 IR MTHFR GENŲ PAŽAIDŲ SĄSAJŲ SU TROMBOZĖMIS TYRIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

Jurgita Žilinskaitė

F2, F5 IR MTHFR GENŲ PAŽAIDŲ SĄSAJŲ SU TROMBOZĖMIS TYRIMAS

Baigiamasis magistro darbas

Biomedicinos mokslų studijų kryptis

Laboratorinės medicinos biologijos studijų programa, valstybinis kodas 621B91002

Darbo vadovė:

dr. Virginija Ašmonienė

Kaunas, 2018 m.

TURINYS

SANTRAUKA ... 4

SUMMARY ... 6

INTERESŲ KONFLIKTAS ... 8

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8

SANTRUMPOS ... 9

ĮVADAS ... 11

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 13

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14

1.1 Trombozės ir trombofilijos sąvokos ... 14

1.2 Trombofilijų paplitimas ... 15

1.3 Trombofilijų klinikinės išraiškos ir gydymas ... 16

1.4 F2 genas ... 16

1.5 F5 genas ... 17

1.6 MTHFR genas ... 18

1.7 F2, F5 ir MTHFR genų sąsajos su trombozėmis ... 20

1.7.1 F2 genas, protrombinas ir trombozės ... 20

1.7.2 F5 genas, APC-R ir trombozės ... 21

1.7.3 MTHFR genas, homocisteinas ir trombozės ... 22

1.8 F2, F5 ir MTHFR genų sąsajos su nevaisingumu ... 22

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24

2.1 Tyrimo organizavimas ... 24

2.2 Tyrimo objektas ... 24

2.3 Tiriamųjų atranka ... 24

2.4 Tyrimo metodai ... 24

2.4.1 Ėminiai ... 24

2.4.2 DNR išskyrimas ... 24

2.4.4 F5 geno G1691A pažaidos tyrimo metodika ... 27

2.4.5 MTHFR geno A1298C ir C677T pažaidų tyrimo metodika ... 29

2.5 Duomenų analizės metodai... 32

3. REZULTATAI ... 33

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 40

5. IŠVADOS ... 44

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45

PRIEDAS

SANTRAUKA

Jurgita Žilinskaitė. „F2, F5 ir MTHFR genų pažaidų sąsajų su trombozėmis tyrimas“.

Tyrimo tikslas: Nustatyti F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos ir MTHFR geno C677T ir A1298C pažaidų sąsajas su trombozėmis.

Uždaviniai: 1. Išanalizuoti pacientų, tirtų dėl trombozių genetinių priežasčių, demografinius ir klinikinius duomenis. 2. Įvertinti F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos ir MTHFR geno C677T ir A1298C pažaidų dažnumą tiriamojoje imtyje. 3. Nustatyti F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos ir MTHFR geno C677T ir A1298C pažaidų ir demografinių bei klinikinių duomenų sąsajas.

Metodai: Retrospektyvinė demografinių ir klinikinių duomenų analizė. F2 geno G20210A, F5 geno G1691A ir MTHFR geno C677T ir A1298C pažaidų nustatymas PGR-RFIP metodu.

Tyrimo objektas: Pacientai, kurie LSMU ligoninėje Kauno klinikose tirti dėl buvusios GVT, PE, netipinių vietų trombozės arba nevaisingumo 2015-01-01 – 2017-11-30.

Rezultatai: Į tyrimą įtraukti 160 pacientų: 33,8 proc. vyrų ir 66,2 proc. moterų. GVT grupėje buvo 45 proc. pacientų, PE grupėje 23,1 proc., NTP grupėje 3,1 proc., NEV grupėje 28,8 proc. GVT sirgo 34,9 proc. moterų ir 64,8 proc. vyrų, PE sirgo 21,7 proc. moterų ir 25,9 proc. vyrų, NTP sirgo 9,3 proc.

vyrų, o NEV sirgo 43,4 proc. moterų. PE ir GVT-PE-NTP grupėse vyrų amžiaus vidurkis buvo statistiškai reikšmingai mažesnis už moterų (atitinkamai 42,4±11,8 m. ir 50,4±12,4 m. / 40,9±14,8 m.

ir 49,3±15,4 m.). Bent vieno geno pažaida nustatyta 40 pacientų (25 proc.) – 24/114 tirtų dėl GVT, PE arba NTP (21,1 proc.) ir 16/46 tirtų dėl NEV (34,8 proc.). Daugiausiai pažaidų nustatyta tiriant MTHFR geną (44,4 proc.), mažiau F5 (7,1 proc.) ir F2 (6,9 proc.) genus, sudėtiniai MTHFR geno C677T/A1298C heterozigotai sudarė 9,3 proc. tirtųjų. Moterims F5 geno G1691A pažaida nustatyta dažniau nei vyrams (atitinkamai 12,7 proc. ir 0 proc., p=0,016).

Išvados: 1. Pacientų, tirtų dėl trombozių genetinių priežasčių, daugiau nei 66 proc. buvo moterys.

Tiriamosios imties pacientų amžiaus vidurkis 42,3 m. 45 proc. tiriamųjų buvo diagnozuota giliųjų venų trombozė. Remiantis gautais rezultatais, I-III grupėse pagal klinikinę diagnozę vyrai buvo statistiškai reikšmingai jaunesni už moteris. 2. Bent vieno geno patologinė pažaida buvo nustatyta 25 proc.

tiriamųjų. I-III grupėje pagal klinikinę diagnozę F2 geno heterozigotinė G20210A pažaida nustatyta

beveik 9 proc. tirtųjų, F5 geno heterozigotinė G1691A pažaida nustatyta 7 proc. tirtųjų, MTHFR geno

heterozigotai pagal C677T pažaidą sudarė beveik 32 proc. tirtųjų, homozigotai pagal C677T pažaidą

beveik 16 proc. tirtųjų, sudėtiniai MTHFR geno C677T/A1298C heterozigotai sudarė šiek tiek daugiau

nei 5 proc. tirtųjų. IV grupėje pagal klinikinę diagnozę F5 geno heterozigotinė G1691A pažaida

nustatyta beveik 8 proc. tirtųjų, MTHFR geno heterozigotinė C677T pažaida nustatyta šiek tiek

daugiau nei 17 proc. tirtųjų, homozigotinė C677T pažaida šiek tiek daugiau nei 11 proc. tirtųjų,

sudėtiniai MTHFR geno C677T/A1298C heterozigotai sudarė šiek tiek daugiau nei 11 proc. tirtųjų. 3.

Statistiškai reikšmingų skirtumų lyginant F2 geno G20210A pažaidą, F5 geno G1691A pažaidą ir MTHFR geno C677T bei A1298C pažaidas su klinikiniais duomenimis nenustatyta. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant F5 geno G1691A pažaidą su demografiniais duomenimis – moterims ši pažaida nustatyta dažniau nei vyrams.

Raktiniai žodžiai: F2 geno G20210A pažaida, F5 geno G1691A pažaida, MTHFR geno C677T ir

A1298C pažaidos, trombozė.

SUMMARY

Jurgita Žilinskaitė. „An investigation of the associations of F2, F5 and MTHFR gene mutations with thrombosis“.

The aim: To determine F2 gene G20210A mutation, F5 gene G1691A mutation and MTHFR gene C677T and A1298C mutations associations with thrombosis.

Objectives: 1. To analize the demographic and clinical data of patients who underwent tests for genetic reasons of thrombosis. 2. To evaluate the frequency of F2 gene G20210A mutation, F5 gene G1691A mutation and MTHFR gene C677T and A1298C mutations in the tested population. 3. To determine the links of F2 gene G20210A mutation, F5 gene G1691A mutation and MTHFR gene C677T and A1298C mutations and demographic and clinical data.

Methods: A retrospective analysis of demographic and clinical data. Detection of F2 gene G20210A, F5 gene G1691A and MTHFR gene C677T and A1298C mutations using PCR followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis.

An object of study: Patients with DVT, PE, non-typical thrombosis or primary/secondary infertility diagnosis during 2015-01-01 – 2017-11-30 were included in this study.

Results: 160 patients were investigated: 33,8 % men and 66,2 % women. Most of patients were in DVT group – 45 %, 23,1 % were in PE group, 3,1 % were in non-typical thrombosis (NTP) group and the rest 28,8 % were in primary/secondary infertility (NEV) group. DVT was diagnosed in 34,9 % women and in 64,8 % men, PE was diagnosed in 21,7 % women and in 25,9 % men, 9,3 % of men were diagnosed with non-typical thrombosis while 43,4 % of women were diagnosed with primary/secondary infertility. An average age in PE and DVT-PE-NTP groups was statistically significant lower in men compared to women (42,4±11,8 years vs. 50,4±12,4 years and 40,9±14,8 years vs. 49,3±15,4 years, respectively). At least one pathological gene mutation was detected in 40 patients (25 %) – 24/114 investigated for DVT, PE or non-typical thrombosis (21,1 %) and 16/46 investigated for primary/secondary infertility (34,8 %). The most common pathological gene mutation was detected in MTHFR gene (44,4 %), less common was detected in F5 and F2 genes (7,1 % and 6,9

%, respectively) while double MTHFR gene C677T/A1298C heterozygous mutation was detected in 9,3 % of patients. Heterozygous F5 gene G1691A mutation was detected more often in women compared to men (12,7 % vs. 0 %, respectively; p=0,016).

Conclusions: 1. More than 66 % of patients tested for genetic reasons of thrombosis were women. An

average age of tested population was 42,3 years. 45 % of patients were diagnosed with deep venous

thrombosis. Based on the results men were statistically significant younger than women in I-III groups

by clinical diagnosis. 2. At least one pathological gene mutation was detected in 25 % of patients. In I-

III groups by clinical diagnosis heterozygous F2 gene G20210A mutation was detected in almost 9 %

patients were heterozygous carriers of MTHFR gene 677T mutation, almost 16 % were homozygous carriers of MTHFR gene 677T mutation while double MTHFR gene C677T/A1298C heterozygous mutation was detected in slightly more than 5 % of patients. In IV group by clinical diagnosis heterozygous F5 gene G1691A mutation was detected in almost 8 % of patients, heterozygous MTHFR gene C677T mutation was detected in slightly more than 17 %, homozygous MTHFR gene C677T mutation was detected in slightly more than 11 % of patients, double MTHFR gene C677T/A1298C heterozygous mutation was detected in slightly more than 11 % of patients. 3. No statistically significant differences between F2 gene G20210A mutation, F5 gene G1691A mutation and MTHFR gene C677T and A1298C mutations and clinical data were obtained. There was statistically significant difference between F5 gene G1691A mutation and demographic data – F5 gene G1691A mutation was more prevalent among women than men.

Keywords: F2 gene G20210A mutation, F5 gene G1691A mutation, MTHFR gene C677T and

A1298C mutations, thrombosis.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Etikos komiteto leidimą (Nr.: BEC – LMB(M) – 472) 2017-06-21 išdavė Lietuvos sveikatos

mokslų universiteto Bioetikos centras (žr. PRIEDAS).

SANTRUMPOS

5-metilTHF - 5-metiltetrahidrofolatas A1298C - MTHFR geno pažaida

APC - aktyvintas baltymas C

APC-R - rezistentiškumas aktyvintam baltymui C

bp - bazių pora

C4BP - C4b surišantis baltymas

C677T - MTHFR geno pažaida

C677T/A1298C - sudėtinė MTHFR geno pažaida

DIK - Diseminuotos intravaskulinės koaguliacijos sindromas DMSO - dimetilsulfoksidas

DNR - deoksiribonukleorūgštis

dNTP - deoksiribonukleotidas EDTA - etilendiamino tetraacetatas EPCR - endotelio baltymo C receptorius

F2 - II krešėjimo faktorių (protrombiną) koduojantis genas F5 - V krešėjimo faktorių koduojantis genas

G1691A - F5 geno pažaida (Leideno faktorius) G20210A - F2 geno pažaida

GVT - giliųjų venų trombozė

Hc - homocisteinas

hHc - hiperhomocisteinemija

KD - klinikinė diagnozė

K-Hm - homozigotinė kontrolė K-Ht - heterozigotinė kontrolė K-Sv - neigiama kontrolė

ll - laisvės laipsniai

LSMU - Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

m. - metai

MTHFR - 5,10-metilentetrahidrofolato reduktazė

MTHFR - 5,10-metilentetrahidrofolato reduktazę koduojantis genas

MTR - 5-metiltetrahidrofolato-homocisteino-metiltransferazę koduojantis genas

n - tiriamųjų skaičius

NEV - nevaisingumas

NTP - netipinių vietų trombozė

p - reikšmingumo lygmuo

PC - baltymas C

PE - plaučių embolija

PGR - polimerazės grandininė reakcija PI - pasikliautinasis intervalas

PS - baltymas S

RFIP - restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas

rpm - (angl. revolutions per minute) centrifugos rotoriaus sukimosi greičio matavimo vienetas

RR - reliatyvi rizika

SN - standartinis nuokrypis

SP - standartinė paklaida

VTE - venų tromboembolija

χ

- Chi kvadrato kriterijus

ĮVADAS

Tromboze vadinamas kraujo krešulių (trombų) susidarymas kraujagyslės spindyje.

Trombofilija apibūdinamas kraujo krešėjimo sistemos sutrikimas, kuriam esant padidėja trombozių išsivystymo rizika [1]. Trombų formavimasis giliosiose kojų, kirkšnies ar rankų venose vadinamas giliųjų venų tromboze (GVT), o trombo atitrūkimas ir patekimas į plautinį kamieną – plaučių embolija (PE). Abi šios būklės yra vienos kraujagyslių ligos - venų tromboembolijos (VTE) - klinikinės išraiškos [2]. Kasmet pasaulyje diagnozuojama apie 10 milijonų VTE atvejų [3]. Europoje kiekvienais metais priskaičiuojama apie 544 tūkst. mirties atvejų, susijusių su VTE sukeltomis komplikacijomis [4].

VTE gali sąlygoti tiek įgimti, tiek ir įgyti veiksniai, taip pat ir aplinkos bei genetinių veiksnių sąveika [5]. Maždaug pusei pacientų su VTE diagnoze nustatomi įgimti trombofiliniai sutrikimai, tokie kaip heterozigotinės F5 geno G1691A ir F2 geno G20210A pažaidos, antitrombino III, baltymų C ir S trūkumas ir kt. [6]. Paskutiniais dešimtmečiais vis plačiau tyrinėjama įvairių genetinių veiksnių įtaka trombozei išsivystyti. Daugelio klinikinių tyrimų duomenys parodė, kad yra ryšys tarp tam tikrų genų pažaidų, tokių kaip F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos, MTHFR geno C677T pažaidos, sudėtinės heterozigotinės MTHFR geno C677T/A1298C pažaidos ir padidėjusios trombozių išsivystymo rizikos [7-15].

VTE diagnostika yra pakankamai sudėtinga, kadangi nėra specifinių klinikinių požymių [16].

Pirmiausiai remiamasi bendriniais klinikiniais požymiais, atliekamas ultragarsinis tyrimas, D-dimerų koncentracijos nustatymas ir kiti tyrimai, priklausomai nuo situacijos sudėtingumo [17]. Genetiniai tyrimai nėra pirmo pasirinkimo tyrimai, kadangi daugumai pacientų, patyrusių pirmąjį VTE epizodą, pradinis ūminės VTE gydymas yra vienodas (išskyrus esant didelės rizikos PE) [18]. Tačiau genetinius tyrimus dėl paveldimos trombofilijos rekomenduojama atlikti esant šeiminei VTE anamnezei, pasikartojantiems VTE epizodams, idiopatinei VTE, netipinių vietų venų trombozei (v. mesenterica, v.

portae ar kt.), VTE jauniems žmonėms (iki 50 metų), VTE nėščiosioms, taikant hormoninę terapiją (pvz., vartojant estrogenus), VTE susijusiai su persileidimais, varfarino sukeltai odos nekrozei, naujagimių purpura fulminans ir kt. [19-21]. Nustačius įgimtą trombofiliją ir siekiant išvengti pirminio ar pakartotinio trombozės epizodo, gali būti taikomos profilaktinės priemonės, tokios kaip dažnesnė pacientų patikra bei ilgalaikis gydymas antikoaguliantais [22].

Genų pažaidų, susijusių su padidėjusia trombozių išsivystymo rizika, paplitimas populiacijose

nėra labai didelis bei skiriasi priklausomai nuo geografinio regiono ir etninės grupės [9, 23-25]. F2

geno G20210A pažaidos dažnumas Europoje yra maždaug 0,6 - 4,0 proc., [26], F5 geno G1691A

pažaidos – maždaug 3,5 proc. [27], MTHFR geno C677T pažaidos dažnumas siekia 35 proc. [28], o

sudėtinė MTHFR geno C677T/A1298C heterozigotinė pažaida nustatoma maždaug 15-20 proc.

žmonių [29]. Minėtų pažaidų buvimas didina trombozės pasireiškimo riziką nuo kelių iki keliasdešimties kartų, ypač esant ne vieno, o kelių genų pažaidų kombinacijai [14,15,22]. Svarbu charakterizuoti ir genetinius veiksnius, norint kuo geriau suprasti galimus trombozių išsivystymo mechanizmus ir pasitelkiant prevencines priemones užkirsti kelią trombozių bei jų sukeliamų komplikacijų išsivystymui.

Mūsų tyrimo tikslas yra nustatyti F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos,

MTHFR geno C677T ir A1298C pažaidų sąsajas su trombozėmis. Taip pat įvertinti šių genų pažaidų

dažnumą tiriamojoje imtyje bei nustatyti F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos ir

MTHFR geno C677T ir A1298C pažaidų ir demografinių bei klinikinių duomenų sąsajas.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Nustatyti F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos ir MTHFR geno C677T ir A1298C pažaidų sąsajas su trombozėmis.

Darbo uždaviniai:

1. Išanalizuoti pacientų, tirtų dėl trombozių genetinių priežasčių, demografinius ir klinikinius duomenis.

2. Įvertinti F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos ir MTHFR geno C677T ir A1298C pažaidų dažnumą tiriamojoje imtyje.

3. Nustatyti F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos, MTHFR geno C677T

ir A1298C pažaidų ir demografinių bei klinikinių duomenų sąsajas.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Trombozės ir trombofilijos sąvokos

Tromboze vadinamas kraujo krešulio (trombo) formavimasis kraujagyslėse ar širdyje.

Dažniausiai pasitaikanti yra venų trombozė [1]. Trombo susidarymas venose, dažniausiai kojų (blauzdos, pakinklio, šlaunies) giliosiose bei klubinėse venose, vadinamas giliųjų venų tromboze (GVT). Trombo atitrūkimas (virtimas embolu) ir nukeliavimas kraujagyslėmis į plautinį kamieną, sukeliant staigią plaučių arterijos ar jos šakų okliuziją, vadinamas plaučių embolija (PE). Kartu GVT ir PE apima venų tromboemboliją (VTE) [2]. VTE patofiziologija yra pakankamai sudėtingas procesas.

Paprasčiausiu VTE patogenezės mechanizmu laikomi sutrikimai Virchovo triadoje: (i) kraujo tėkmės pokyčiai (pvz., kraujo stazė), (ii) kraujagyslių endotelio pažeidimas ir (iii) kraujo komponentų pokyčiai (pvz., įgimtos ar įgytos hiperkoaguliacinės būklės, trombofilija) [14].

Trombofilija apibūdinama kaip kraujo krešėjimo sistemos pusiausvyros sutrikimas, pasireiškiantis padidėjusia trombozės išsivystymo rizika [1]. Pagal etiologinį principą trombofilijos skirstomos į dvi pagrindines grupes: įgimtas ir įgytas (1 lentelė) [30]. Įgimta trombofilija dažniausiai siejama su venų, o ne arterijų, tromboembolija [31].

1 lentelė. Įgimtos ir įgytos būklės, didinančios trombozių išsivystymo riziką [30]

Įgimtos būklės Įgytos būklės

Antitrombino III trūkumas Vėžys

Baltymo C trūkumas Chemoterapija (L-asparginazė, talidomidas, anti-angiogenezinė terapija)

Baltymo S trūkumas Mieloproliferaciniai susirgimai Atsparumas aktyvintam baltymui C Heparino-sąlygota trombocitopenija F5 geno G1691A pažaida (Leideno

faktorius)

Diseminuotos intravaskulinės koaguliacijos (DIK) sindromas

F2 geno G20210A pažaida Nefrozinis sindromas

Homocistinurija Trombozinė trombocitopeninė purpura

Hiperhomocisteinemija Oralinių kontraceptikų vartojimas

Disfibrinogenemija Estrogenų terapija

XIII krešėjimo faktoriaus polimorfizmas Nėštumas/pogimdyvinė būklė Padidėjęs plazmos krešėjimo faktorių (pvz.,

I, II, VIII, IX, XI) kiekis

Antifosfolipidiniai antikūnai (Lupus

antikoaguliantas, antikardiolipiniai antikūniai, anti- β2-glikoproteino I antikūnai)

F5 geno G1691A pažaida ir F2 geno G20210A pažaida yra laikomos dviem dažniausiais

genetiniais polimorfizmais, didinančiais pirminio VTE epizodo išsivystymo riziką. Didesne rizika

laikomi homozigotinis ir sudėtinis šių genų heterozigotinis polimorfizmai [32-34].

Hiperhomocisteinemija, galinti išsivystyti dėl MTHFR geno pažaidų, taip pat siejama su kraujo krešėjimo sistemos sutrikimais ir padidėjusia venų trombozės rizika [35-38], tačiau rezultatai yra prieštaringi [39-41].

Trombofilijos didina ne tik pirminio, bet ir pakartotinio trombozės epizodo riziką. Esant nedidelės rizikos trombofilijai (pvz., heterozigotiniams F2 geno G20210A ar F5 geno G1691A pažaidų variantams), pakartotinio trombozės epizodo rizika padidėja nežymiai, o gydymo antikoaguliantais trukmė dažniausiai nekoreguojama. Pacientams, kuriems nustatomos didelės rizikos trombofilijos, tokios kaip homozigotiniai F2 geno G20210A ar F5 geno G1691A pažaidų variantai ar sudėtinis šių genų heterozigotinis variantas, pakartotinio trombozės epizodo rizika smarkiai išauga (žr.

2 lentelę) [42]. Esant tokioms trombofilijos formoms, galimas ilgalaikis gydymas antikoaguliantais [43]. Vis dėlto, rizikos veiksniai rodo veikiau polinkį į patologiją negu jos priežastingumą [44].

2 lentelė. Pirminio ir pakartotinio trombozės epizodo išsivystymo reliatyvi rizika priklausomai nuo trombofilijos tipo [42]

Trombofilija

Trombozės išsivystymo reliatyvi rizika (RR)*

Pirminio trombozės epizodo

Pakartotinio trombozės epizodo

Hiperhomocisteinemija 2,5 k. -

F2 geno G20210A heterozigotai 1,5-3,8 k. 1,4 k.

F5 geno G1691A heterozigotai 5-10 k. 1,3 k.

F2 geno G20210A heterozigotai + F5

geno G1691A heterozigotai 20-60 k. 2,5 k.

F5 geno G1691A homozigotai 50-100 k. -

* lyginant su pacientais be trombofilijos (1 k. = rizika nepadidėjusi)

1.2 Trombofilijų paplitimas

Trombofilijų paplitimas populiacijose skiriasi. Kaukazo regione jis siekia nuo <0,01 proc.

esant sumažėjusiam antitrombino III aktyvumui, homozigotinei F5 geno G1691A pažaidai ir

disfibrinogenemijai iki 0,2-0,3 proc. esant sumažėjusiam baltymų S ir C aktyvumui [45]. F2 geno

G20210A pažaidos dažnumas Europoje yra maždaug 0,6 - 4,0 proc., Lenkijoje apie 2,5 proc.,

Ukrainoje – apie 1,7 proc. [26, 46]. F2 geno G20210A pažaida nustatoma 3-8 proc. pacientų su VTE

[47]. Europoje F5 geno G1691A pažaida nustatoma maždaug 3,5 proc., Centrinėje Europos dalyje –

0,6 - 5,1 proc., Ukrainoje apie 1,5 proc., Čekijoje apie 2,6 proc. žmonių [27,46,48]. F5 geno G1691A

pažaida nustatoma maždaug 25 proc. pacientų su pirmine idiopatine VTE ir apie 40-50 proc. su

pakartotine VTE [49, 50]. MTHFR geno C677T pažaidos dažnumas yra maždaug 35 proc., Ukrainoje

jis siekia 29 proc., Čekijoje apie 25 proc. [28, 46]. Sudėtinė heterozigotinė MTHFR geno C677T/A1298C pažaida nustatoma maždaug 15-20 proc. žmonių [29].

1.3 Trombofilijų klinikinės išraiškos ir gydymas

Trombofilijos kliniškai gali pasireikšti įvairiai: paviršinių ar giliųjų kojų venų tromboze bei plaučių embolija, netipinių lokalizacijų tromboze (pvz., vartų venos, kepenų venų, mezenterinių arterijų), purpura falminans, varfarino sukelta odos nekroze, arterine tromboze, pakartotiniais persileidimais, nėštumo komplikacijomis (pvz., sunkia preeklampsija) ir kt. [30]. Dažniausia trombofilijų išraiška yra laikoma venų tromboembolija [51].

Trombofilijų gydymo pagrindą sudaro kraujo krešėjimą slopinantys vaistai (pvz., nefrakcionuotas heparinas, mažos molekulinės masės heparinas ar fondaparinuksas). Specialus gydymas galėtų būti taikomas pacientams su tam tikrų kraujo krešėjimo komponentų, tokių kaip antitrombino III ar baltymo C, trūkumu [30].

1.4 F2 genas

F2 genas lokalizuotas 11-oje chromosomoje, trumpajame petyje (11p11.2) [7, 8]. F2 genas koduoja glikoproteidą protrombiną, sudarytą iš 622 aminorūgščių. Protrombinas yra α

-globulinas, dalyvaujantis krešėjimo sistemoje kaip vienas iš vidiniame krešėjimo kelyje dalyvaujančių faktorių [8].

Jis sintetinamas kepenyse, dalyvaujant vitaminui K. Pagrindinė protrombino funkcija – aktyvinti

trombiną. Neaktyvi jo forma cirkuliuoja kraujyje. Įvykus kraujagyslių pažeidimui, protrombinas

verčiamas trombinu dalyvaujant protrombinazės kompleksui, kurį sudaro Xa, V krešėjimo faktoriai,

Ca

jonai (IV krešėjimo faktorius) ir fosfolipidai. Šis kompleksas protrombiną aktyvina iki trombino,

kuris veikia fibrinogeną, virstantį fibrinu, taip užbaigiant krešėjimo kaskadą (1 pav.) [52, 53].

1 pav. Kraujo krešėjimo kaskada ir baltymo C kelias (adaptuota pagal Dahlbäck B. ir Villoutreix B.O.) [54]

C4BP – C4b surišantis baltymas; PS – baltymas S; PC – baltymas C; APC – aktyvintas baltymas C; EPCR – endotelio baltymo C receptorius.

Įvykus G20210A pažaidai F2 gene, guaninas pakeičiamas adeninu 20210-oje pozicijoje, 3′

netransliuojamame regione (2 pav.). Dėl šio vieno nukleotido polimorfizmo padidėja protrombino geno aktyvumas ir protrombino sintezė [8, 53]. Protrombino kiekis heterozigotams padidėja maždaug 30 proc., homozigotams – 70 proc. [55]. Dėl protrombino pertekliaus aktyvuojama daugiau trombino, fibrinogenas virsta fibrinu ir formuojasi krešuliai [8, 53].

2 pav. G20210A pažaida F2 gene (adaptuota pagal Dahlbäck B, ir kt.) [44]

1.5 F5 genas

F5 geno lokalizacija yra 1-oje chromosomoje, ilgajame petyje (1q24.2) [56]. F5 genas koduoja V krešėjimo faktorių, sudarytą iš 2224 aminorūgščių. V krešėjimo faktorius dalyvauja kraujo

Egzonai

krešėjime ir pagrindinė jo funkcija yra kartu su Xa faktoriumi ir fosfolipidais aktyvinti protrombiną iki trombino (1 pav.) [52, 53].

F5 gene įvykus G1691A pažaidai, 1691-oje pozicijoje guaninas pakeičiamas adeninu.

Prasideda pakitusių V krešėjimo faktoriaus molekulių, kuriose yra pašalintas vienas iš aktyvinto baltymo C (APC) veikimo sričių, sintezė (3 pav.), o pakitęs V krešėjimo faktorius dažnai įvardinamas Leideno faktoriumi [57]. G1691A pažaida lemia rezistentiškumą aktyvintam baltymui C (angl. APC- R) – būklę, kai organizme pasireiškia atsparumas baltymo C antikoaguliaciniam efektui į aktyvintą V krešėjimo faktorių. Dėl APC-R silpnėja antikoaguliacinis baltymo C poveikis ir nestabdoma krešėjimo kaskada [58].

3 pav. F5 geno (be pažaidos) ir F5 geno (su G1691A pažaida) aktyvacija ir degradacija (adaptuota pagal Dahlbäck B, ir kt.) [44]

Nors F5 geno G1691A homozigotų yra tik iki 1 proc., kliniškai jie pasireiškia dažniau dėl didesnės (50-100 kartų) trombozių išsivystymo rizikos [42].

1.6 MTHFR genas

MTHFR genas lokalizuotas 1-oje chromosomoje, trumpajame petyje (1p36.3). Šis genas žmogaus organizme koduoja fermentą 5,10-metilentetrahidrofolato reduktazę (MTHFR), sudarytą iš 656 aminorūgščių, kuris dalyvauja homocisteino metabolizme, jam virstant metioninu. MTHFR katalizuoja 5,10-metilentetrahidrofolato virtimą 5-metiltetrahidrofolatu (5-metilTHF) (4 pav.) [59].

baltymas

Normalus F5 genas:

Normalus baltymas:

F5 (G1691A):

Pakitęs baltymas:

4 pav. Homocisteino metabolizmo keliai (adaptuota pagal Maron B, ir kt.) [60]

Homocisteinas (Hc) – į baltymų sudėtį neįeinanti, sieros turinti aminorūgštis, tarpinis kitų aminorūgščių (metionino ir cisteino) biosintezės produktas. Ši aminorūgštis susidaro metionino, gaunamo su maistu, demetilinimo reakcijų metu [61]. Sutrikus homocisteino metabolizmui, išsivysto hiperhomocisteinemija (hHc) – homocisteino koncentracijos padidėjimas kraujo serume – būklė, siejama su kraujagyslių ligų atsiradimu ir progresavimu, aterosklerozinio proceso skatinimu bei krešėjimo sistemos aktyvinimu [36]. Yra manoma, kad hHc pažeidžia endotelines kraujagyslių sienelės ląsteles, dėl to sumažėja kraujagyslių elastingumas ir sutrinka kraujo krešėjimas. hHc padidina kitų širdies ir kraujagyslių ligų rizikos veiksnių įtaką (hipertenzijos, rūkymo, lipidų, lipoproteinų metabolizmo ir kt.) ir skatina uždegimo vystymąsi [37].

hHc gali išsivystyti dėl tam tikrų genų, koduojančių homocisteino metabolizme dalyvaujančių

fermentų sintezę, pažaidų. Pagrindiniai fermentai, dalyvaujantys homocisteino metabolizme, yra 5,10-

metilentetrahidrofolato reduktazė, metionino sintazė ir cistationino-β-sintazė (4 pav.). Dažniausia

laikoma 5,10-metilentetrahidrofolato reduktazę koduojančio MTHFR geno pažaida [62]. MTHFR

katalizuojamos reakcijos metu susidaręs 5-MTHF, dar žinomas kaip biologiškai aktyvi folio rūgštis,

yra pirminis metilo grupės donoras homocisteinui. Šios metilo grupės pagalba homocisteinas

paverčiamas metioninu. Dėl žemos 5-MTHF koncentracijos, nulemtos MTHFR geno pažaidos, gali

padidėti homocisteino koncentracija kraujyje, nes ne visas homocisteinas virsta metioninu [63, 64]. Be

MTHFR geno, yra ir kitų genų, dalyvaujančių homocisteino/metionino metabolizme, kurie taip pat gali

būti susiję su homocisteino koncentracijos kraujyje padidėjimu. Vienas iš tokių genų yra MTR (5-

metiltetrahidrofolato-homocisteino-metiltransferazės) genas, koduojantis metionino sintazę [65, 66].

Pagrindinės dvi metionino sintazės funkcijos yra prijungti metilo grupę nuo 5-MTHF prie vitamino B12, taip susidarant metilkobalaminui, bei paversti homocisteiną metioninu, panaudojant metilo grupę iš susintetino metilkobalamino. Šio geno pažaidos siejamos su sumažėjusiu metionino sintazės aktyvumu ir padidėjusia homocisteino koncentracija kraujyje [67].

hHc taip pat gali išsivystyti dėl folio rūgšties, vitamino B6 ir vitamino B12 trūkumo racione.

Inkstų funkcijos nepakankamumas, vėžys, psoriazė, cukrinis diabetas, padidėjusi kreatinino koncentracija kraujyje, įvairų vaistų, alkoholio vartojimas, rūkymas, vyresnis amžius ir menopauzė taip pat siejami su padidėjusia homocisteino koncentracija kraujyje [68].

Dažniausios MTHFR geno pažaidos, siejamos su hHc ir padidėjusia trombozių išsivystymo rizika, yra dvi – C677T ir sudėtinė C677T/A1298C. Įvykus C677T pažaidai, 677-oje pozicijoje citozinas yra pakeičiamas timinu, taip pakeičiant aminorūgštį alaniną valinu. Pradedama termolabilaus ir mažesniu aktyvumu pasižyminčio fermento sintezė [69]. Esant heterozigotiniam C677T pažaidos variantui, MTHFR aktyvumas siekia maždaug 55 proc., homozigotiniam – tik apie 18 proc. [70].

Pacientams su homozigotine C677T pažaida nustatomos didesnės plazmos Hc koncentracijos, ypač esant žemai (<15,4 nmol/l) plazmos folatų koncentracijai [71]. Nors homozigotinis C677T polimorfizmas lemiama vidutinio sunkumo hHc ir laikomas koronarinės širdies ligos [10, 11], venų trombozės [72, 73] bei insulto rizikos veiksniu [12, 74-76], ne visos studijos patvirtino šį teiginį [39- 41, 77- 79]

Įvykus A1298C pažaidai, adeninas 1298-oje pozicijoje pakeičiamas citozinu, taip aminorūgštį glutaminą pakeičiant alaninu [70]. Nors MTHFR geno A1298C polimorfizmas turi įtakos MTHFR aktyvumui (esant heterozigotiniam A1298C pažaidos variantui, MTHFR aktyvumas siekia apie 65 proc., homozigotiniam – apie 60 proc.), tačiau skirtingai nuo C677T, nelemia termolabilaus fermento sintezės ar padidėjusios Hc koncentracijos [80, 81]. Sudėtinis MTHFR geno C677T/A1298C pažaidų heterozigotiškumas lemia maždaug perpus sumažėjusį fermento MTHFR aktyvumą lyginant su vienos pažaidos heterozigotiškumu [70]. Šis sudėtinis C677T/A1298C heterozigotiškumas siejamas su padidėjusia Hc koncentracija lyginat su C677T heterozigotais [29, 82]. Nustatyta, kad sudėtinis C677T/A1298C heterozigotinis polimorfizmas pasižymi panašia klinikine išraiška kaip ir homozigotinis C677T variantas [83, 84].

1.7 F2, F5 ir MTHFR genų sąsajos su trombozėmis 1.7.1 F2 genas, protrombinas ir trombozės

Epidemiologinėse studijose nustatytas ryšys tarp padidėjusios tam tikrų krešėjimo faktorių,

tokių kaip XI, VIII:C ir fibrinogeno, koncentracijos kraujyje ir padidėjusios trombozių išsivystymo

rizikos [85-88]. Pastebėta, kad yra sąsajų ir tarp padidėjusios protrombino koncentracijos kraujyje bei

arterinės ir veninės trombozių pasireiškimo [89-91]. Viena iš padidėjusios protrombino koncentracijos priežasčių įvardinama G20210A pažaida protrombiną koduojančio F2 geno 3‘ netransliuojamame regione [89].

Suintensyvėjusi protrombino sintezė pati savaime nepaaiškina biocheminio mechanizmo, dėl kurio didėja trombozių išsivystymo rizika. Todėl manoma, kad padidėjusi protrombino koncentracija turi savitą fiziologinį poveikį, sutrikdantį kraujo krešėjimo sistemą ir skatinantį trombozių išsivystymą.

Kadangi protrombinas dalyvauja tiek prokoaguliaciniuose, tiek ir antikoaguliaciniuose procesuose, nėra visiškai aišku, kurioje krešėjimo sistemos dalyje pasireiškia neigiamas jo poveikis [92].

Išskiriamos trys hipotezės, kaip galimai šiuo atveju veikia protrombinas:

1. Padidėjusi protrombino koncentracija galimai suaktyvina prokoaguliacinius mechanizmus, aktyvuojant XIII faktorių ar padidinant trombocitų aktyvumą;

2. Padidėjusi protrombino koncentracija galimai susilpnina koaguliaciją, padidindama baltymo C aktyvumą ar nuslopindama Va bei VIIIa faktorius;

3. Padidėjusi protrombino koncentracija nedaro jokios įtakos kraujo krešėjimui [92].

Klinikiniai tyrimai parodė, kad pirmieji du procesai vyksta in vivo, todėl padidėjusi protrombino koncentracija siejama su padidėjusia trombozių išsivystymo rizika [93]. Tačiau tikslus šio proceso mechanizmas nėra žinomas [92].

Esant heterozigotiniam F2 geno G20210A pažaidos variantui, rizika pasireikšti giliųjų venų trombozei suaugusiems išauga 2-5 kartus, vaikams – 3-4 kartus, lyginant su šios pažaidos neturinčiais žmonėmis [94]. G20210A pažaidos heterozigotams trombozinės komplikacijos tai pat išsivysto dažniau nei homozigotams, pastebėtas ankstyvas (iki 30-ųjų gyvenimo metų) venų tromboembolijos pasireiškimas [25, 95].

1.7.2 F5 genas, APC-R ir trombozės

Baltymo C kelias yra svarbus antikoaguliacinis mechanizmas kraujo krešėjimo sistemoje,

slopinantis protrombiną ir X faktorių aktyvinančius kompleksus, inaktyvuodamas jų kofaktorius – V ir

VIII krešėjimo faktorius [96]. Funkciniai baltymo C kelio defektai, išsivystę dėl įgimtų ar įgytų būklių,

vadinami rezistentiškumu aktyvintam baltymui C (APC-R) [97]. Apie 95 proc. APC-R nulemia

pažaida, įvykusi V faktorių koduojančiame gene F5 [98]. Klinikinės studijos parodė nuo 5 iki 10 kartų

padidėjusią trombozių išsivystymo riziką pacientams, kuriems nustatyta heterozigotinė F5 geno

pažaida [42]. Todėl APC-R yra laikomas svarbiu venų trombozės rizikos veiksniu [99-101]. Taip pat

F5 geno G20210A pažaida laikoma papildomu trombozės išsivystymo rizikos veiksniu pacientams po

klubo ar sąnario protezavimo operacijų. Nustatyta, kad pastariesiems pacientams trombozės

išsivystymo rizika padidėja apie penkis kartus [102].

1.7.3 MTHFR genas, homocisteinas ir trombozės

VTE dažnai yra įvardinama kaip svarbi įvairių susirgimų bei mirties priežastimi, ypač tarp vyresnio amžiaus pacientų [2]. Nors didžioji dalis VTE atvejų pasireiškia dėl užsitęsusios imobilizacijos, sudėtingų operacijų, traumų ar vėžio, tačiau įgimti ar įgyti kraujo krešėjimo sistemos sutrikimai, tokie kaip padidėjusi plazmos homocisteino koncentracija, taip pat siejami su šia patologija [103].

hHc, galinti išsivystyti MTHFR gene įvykus tam tikroms pažaidoms, tokioms kaip C677T ar C677T/A1298C, galimai sukelia kraujagyslių endotelinių ląstelių pažeidimus, diastolinę disfunkciją ir elastingumo sumažėjimą dėl neigiamo poveikio kraujagyslių sienelei, taip trikdant krešėjimą sistemos pusiausvyra. Šie mechanizmai gali skatinti hipertenzijos išsivystymą, o kartu ir įvairių organų pažeidimus [35].

Vis dėlto, nors ir yra atliktų studijų, patvirtinančių padidėjusią homocisteino koncentraciją pacientams, sergantiems VTE ar ateroskleroze, vis dar nėra iki galo aišku, ar hHc tikrai sukelia tam tikrus pažeidimus, ar padidėjusi Hc koncentracija kraujyje yra tik to pažeidimo pasekmė [41]. 2004 metais atliktos studijos parodė, kad Hc koncentracijos kraujyje sumažėjimas nesumažina aterosklerozės ar VTE pasireiškimo rizikos [39, 40]. Tai iškėlė teoriją, kad Hc yra tik „nekaltas šalutinis poveikis“, o ne susirgimų priežastis. Kadangi anksčiau minėta hipotezė apie žalingą Hc poveikį kraujagyslių endotelio ląstelėms nėra iki galo aiški, ne visiškai aiškus ir tikrasis Hc ryšys su VTE ir ateroskleroze [41].

1.8 F2, F5 ir MTHFR genų sąsajos su nevaisingumu

Įgimtų trombofilijų ir pirminio nevaisingumo sąsajos aiškinamos neįvykusia gemalo implantacija [104]. Sąsajos tarp įgimtų trombofilijų ir antrinio nevaisingumo, pirmiausia stebėtos esant šeiminei venų trombozės anamnezei, buvo patvirtintos ne vienoje studijoje [21, 105-107]. Šios sąsajos aiškinamos tuo, kad sutrikęs placentos vystymasis ir funkcija, lydimas venų ir/ar arterijų trombozės, gali sukelti persileidimą [108]. Manoma, kad su vaisiaus netekimu siejamos trombozės išsivysto dėl ankstyvųjų placentos kraujagyslių trombozės ir dažniausiai pasireiškia pirmame nėštumo trimestre [109, 110]. Vėlyvasis vaisiaus netekimas ir sunki preeklampsija taip pat siejamos su trombofilijomis [21, 107] kai tuo tarpu vaisiaus augimo sulėtėjimas ar placentos atsidalijimas vis dar diskutuojamas [111]. Literatūros duomenimis, trombofilijų paplitimas tarp pacienčių su antrinio nevaisingumo diagnoze siekia apie 47 proc. [112].

Didžiosios Britanijos mokslininko Robertsono su kolegomis [21] atliktos 25 studijų meta-

analizės rezultatai parodė padidėjusią persileidimų riziką esant tam tikroms genų pažaidoms. Jie savo

laikotarpio vaisiaus netekimo rizika padidėjo 2,7 karto, o esant heterozigotinei pažaidai ankstyvojo nėštumo laikotarpio vaisiaus netekimo rizika padidėjo 1,7, vėlyvojo laikotarpio – apie 2 kartus.

Vertindami heterozigotinę F2 geno G20210A pažaidą tyrėjai nustatė 2,5 karto didesnę ankstyvojo nėštumo laikotarpio vaisiaus netekimo riziką ir 2,7 karto didesnę vėlyvojo nėštumo laikotarpio vaisiaus netekimo riziką. hHc atveju ankstyvojo nėštumo laikotarpio vaisiaus netekimo rizika padidėjo apie 6,3 karto.

Vis dėlto, yra ir prieštaringų rezultatų. Graikų mokslininkas Sotiriadis ir kt. [113] savo atliktoje studijoje tyrė sveikas moteris ir moteris su neaiškios kilmės pasikartojančiais persileidimais.

Jų gauti rezultatai neparodė statistiškai patikimo ryšio tarp F2 geno G20210A, F5 geno G1691A, MTHFR geno C677T pažaidų ir padidėjusios persileidimų rizikos. Bosnijos ir Hercegovinos mokslininkas Mahmutbegović su kolegomis [114] tyrė sveikas moteris ir moteris, patyrusias persileidimus. Jų tyrimo metu taip pat nebuvo nustatyta statistiškai reikšmingo F2 geno G20210A pažaidos dažnio skirtumo tarp sveikų ir persileidimus patyrusių moterų.

Nustačius homozigotinę MTHFR geno C677T pažaidą ar sudėtinį MTHFR C677T/A1298C heterozigotiškumą moterims su pasikartojančiais persileidimais, gali pakisti gydymo planas. Tokioms moterims, kurioms nustatyta hHc, skiriamos didesnės vitaminų B12 ir B6 bei folio rūgšties dozės [115].

F2, F5 ir MTHFR genų pažaidų sąlygota trombofilija galimai didina vaisiaus netekimo riziką,

todėl šių genų ištyrimas galėtų būti nemažiau svarbus nei kitų po įvykusio persileidimo atliekamų

tyrimų, kadangi skaičiuojama, jog apie 30–40% persileidimų lieka neaiškios priežasties net ir atlikus

standartinius ginekologinius, hormoninius ir kariotipo tyrimus [107].

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1 Tyrimo organizavimas 1. Pacientų atranka.

2. Klinikinių ir demografinių duomenų rinkimas.

3. Genų pažaidų nustatymo metodikos įsisavinimas.

4. Sukauptų duomenų analizė statistiniais tyrimo metodais.

2.2 Tyrimo objektas

Pacientai, kurie LSMU ligoninėje Kauno klinikose tirti dėl buvusios GVT, PE, netipinių vietų trombozės arba nevaisingumo 2015-01-01 – 2017-11-30.

2.3 Tiriamųjų atranka

Tyrimui buvo atrinkti pacientai, kurie LSMU ligoninės Kauno klinikų Genetikos ir molekulinės medicinos klinikoje buvo tirti dėl buvusios GVT, PE, netipinių vietų trombozė s arba nevaisingumo, atliekant genetinį F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos ir MTHFR geno C677T bei A1298C pažaidų nustatymą.

2.4 Tyrimo metodai

Retrospektyvinė demografinių ir klinikinių duomenų analizė.

F2 geno G20210A pažaidos, F5 geno G1691A pažaidos ir MTHFR geno C677T bei A1298C pažaidų nustatymas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) - restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo (RFIP) metodu pagal gamintojo pateiktą metodiką.

2.4.1 Ėminiai

Tyrimams buvo naudojamas veninis kraujas, standartinėmis sąlygomis paimtas į vakuuminį mėgintuvėlį su EDTA dvivalente kalio druska ir pristatytas į laboratoriją, esant 18–25

C temperatūrai.

2.4.2 DNR išskyrimas

DNR buvo išskirta iš periferinio kraujo, naudojant DNR išgryninimo rinkinį „QIAamp

DNA

Blood Mini Kit (50)“ („QIAGEN“, Vokietija) pagal standartinį gamintojo protokolą. Pirmiausiai

kraujas centrifuguojamas 10 min. 2700 rpm. Tada plazma nupilama ir užpilama 1,5 ml lizavimo

10 min. Procedūra kartojama dar du kartus. Paskutinį kartą nupylus supernatantą, likusios nuosėdos suspenduojamos ir supilamos į DNR išskyrimo kolonėlės mėgintuvėlį, jis įstatomas į adapterį ir dedamas į DNR išskyrimo aparatą QIA cube Pure efficiency („QIAGEN“, Vokietija), kuriame apie 1 valandą automatizuotai vykdoma DNR išskyrimo programa. Po išskyrimo spektrofotometriškai pamatuojama išskirtos DNR koncentracija, naudojantis QIAxpert („QIAGEN“, Vokietija) aparatu.

Gautos DNR koncentracija išreiškiama ng/μl. Toliau atliekant tyrimus, gautas DNR tirpalas praskiedžiamas iki tyrimui atlikti reikalingos koncentracijos. Išskirta DNR laikoma (+2 – +8

C) temperatūroje iki 7 dienų, -80

C – neribotą laiką.

2.4.3 F2 geno G20210A pažaidos tyrimo metodika

Pažaida G20210A F2 gene nustatyta PGR-RFIP metodu. Kiekvienai PGR reakcijai buvo naudojama 10 μl DNR tirpalo ir 10 μl PGR reakcijos mišinio, kurio sudėtis nurodyta lentelėje (3).

PGR vykdyta pagal (4) lentelėje aprašytas sąlygas.

PGR reakcija

Į Eppendorf tipo mėgintuvėlį gaminamas PGR reakcijos mišinys, kurio sudėtis nurodyta lentelėje (3).

3 lentelė. PGR mišinio sudėtis F2 geno pažaidos G20210A nustatymui

Komponentas Kiekis, μl

dejonizuotas vanduo 3,7

10x PGR buferis su (NH

)

SO

2,5

MgCl

tirpalo 2,5

darbinis PT3 pradmens tirpalas 0,3 darbinis PT5 pradmens tirpalas 0,3

darbinis dNTP mišinys 0,5

Rekombinantinę Taq DNR polimerazė 0,2

Bendras tūris 10

Pilama po 10 μl purtykle sumaišyto PGR reakcijos mišinio į atskirą PGR mėgintuvėlį

Pilama po 10 μl tiriamosios DNR į kiekvieną PGR mėgintuvėlį.

Pilama 10 μl žinomų kontrolinių homozigotinės, heterozigotinės teigiamos ir homozigotinės neigiamos reakcijos mėginių DNR į atitinkamus kontrolinius mėgintuvėlius.

Pilama 10 μl dejonizuoto vandens į neigiamos reakcijos kontrolės mėgintuvėlį (paskutinį).

Mėgintuvėliai uždaromi ir patalpinami į termomaišytuvą, PGR reakcija G20210A pažaidai nustatyti vykdomą pagal programą (4 lentelė). Po PGR mėgintuvėliai su amplifikuotu PGR produktu laikomi tamsoje, šaldytuve (+2 – +8

C).

4 lentelė. PGR programa F2 geno pažaidos G20210A nustatymui Temperatūra °C Trukmė Ciklų skaičius Procesas

94 °C 5 min 1 Pirminė denatūracija

94 °C 30 s

34

Denatūracija

56 °C 30 s Oligonukleotidų prisijungimas

72 °C 1 min DNR grandinės sintezė

72 °C 7 min 1 Sintezės užbaigimas

4 °C ∞.

Elektroforezė agarozės gelyje gautiems PGR produktams įvertinti

DNR elektroforezė vykdoma 2 proc. agarozės gelyje, dažytame etidžio bromidu. Naudojamas molekulinės masės žymuo pUC19 DNA/MspI („Thermo Scientific™“), pagal kurį vertinamas gautas signalas t.y. šis reagentas naudojamas DNR fragmentų dydžio identifikavimui. Analizė vykdoma gelio analizės ir dokumentavimo sistemos „BIO-RAD Molecular Imager

Gel Doc

XR

“ pagalba.

Stebimas 345 bp ilgio fragmentas.

Restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas (RFIP)

Gauti PGR produktai karpomi restrikcinėmis endonukleazėmis. RFIP mišinio sudėtis:

dejonizuotas vanduo, 10x buferis Tango ir Hind III restrikcinė endonukleazė. Mėgintuvėliai su reakcijos mišiniu sandariai uždengiami, dedami į termomaišytuvą ir laikomi ≥8 val. 37

C temperatūroje. Gaunamas RFIP reakcijos mišinys.

Elektroforezė agarozės gelyje restrikcijos fragmentų įvertinimui

Elektroforezė restrikcijos fragmentams įvertinti atliekama 4 proc. agarozės gelyje, dažytame etidžio bromidu. Gautų DNR fragmentų dydžiui įvertinti naudojamas molekulinės masės žymuo pUC19 DNA/MspI („Thermo Scientific™“). Analizė vykdoma gelio analizės ir dokumentavimo sistemos „BIO-RAD Molecular Imager

Gel Doc

XR

“ pagalba.

Rezultatų vertinimas

Rezultatai vertinami pagal stebimų fragmentų ilgį 4 proc. agarozės gelyje (5 pav.):

- 204 bp ir 141 bp ilgio fragmentai – F2 geno G20210A pažaida nenustatyta;

- 204 bp, 181 bp ir 141 bp ilgio fragmentai – nustatyta heterozigotinė F2 geno G20210A

pažaida;

- 141 bp ir 181 bp ilgio fragmentai – nustatyta homozigotinė F2 geno G20210A pažaida.

5 pav. F2 geno G20210A pažaidos nustatymo PGR-RFIP elektroforegrama pUC19 DNA/MspI – DNR molekulinės masės žymuo ; 1 – P (paciento), F2 geno G20210A pažaida

nenustatyta; 2 – heterozigotinė kontrolė (K-Ht); 3 - neigiama kontrolė (K-Sv).

2.4.4 F5 geno G1691A pažaidos tyrimo metodika

Pažaida G1691A F5 gene nustatyta PGR-RFIP metodu. Kiekvienai PGR reakcijai buvo naudojama 5 μl DNR tirpalo ir 20 μl PGR reakcijos mišinio, kurio sudėtis nurodyta lentelėje (5). PGR vykdyta pagal (6) lentelėje aprašytas sąlygas.

PGR reakcija

Į Eppendorf tipo mėgintuvėlį gaminamas PGR reakcijos mišinys, kurio sudėtis nurodyta lentelėje (5).

5 lentelė. PGR mišinio sudėtis F5 geno pažaidos G1691A nustatymui

Komponentas Kiekis, μl

dejonizuotas vanduo 12,0

10x PGR buferis su (NH

)

SO

2,5

MgCl

tirpalo 2,5

darbinis FV3 pradmens tirpalas 1,0 darbinis FV6 pradmens tirpalas 1,0

DMSO 0,5

darbinis dNTP mišinys 0,3

Rekombinantinę Taq DNR polimerazė 0,2

Bendras tūris 20

Pilama po 20 μl purtykle sumaišyto PGR reakcijos mišinio į atskirą PGR mėgintuvėlį.

Pilama po 5 μl tiriamosios DNR į kiekvieną PGR mėgintuvėlį.

204 bp 181 bp 141 bp

P K-Ht K-Sv

pUC19 DNA/MspI

242 bp

190 bp

147 bp

111 bp

Pilama 5 μl žinomų kontrolinių homozigotinės, heterozigotinės teigiamos ir homozigotinės neigiamos reakcijos mėginių DNR į atitinkamus kontrolinius mėgintuvėlius.

Pilama 5 μl dejonizuoto vandens į neigiamos reakcijos kontrolės mėgintuvėlį (paskutinį).

Mėgintuvėliai uždaromi ir patalpinami į termomaišytuvą, PGR reakcija F5 geno G1691A pažaidai nustatyti vykdomą pagal programą (6 lentelė). Po PGR mėgintuvėliai su amplifikuotu PGR produktu laikomi tamsoje, šaldytuve (+2 –+8

C).

6 lentelė. PGR programa F5 geno pažaidos G1691A nustatymui Temperatūra °C Trukmė Ciklų skaičius Procesas

95 °C 2 min 1 Pirminė denatūracija

95 °C 30 s

31

Denatūracija

60 °C 30 s Oligonukleotidų prisijungimas

72 °C 30 s DNR grandinės sintezė

72 °C 7 min 1 Sintezės užbaigimas

4 °C ∞.

Elektroforezė agarozės gelyje gautiems PGR produktams įvertinti

DNR elektroforezė vykdoma 2 proc. agarozės gelyje, dažytame etidžio bromidu. Naudojamas molekulinės masės žymuo pUC19 DNA/MspI („Thermo Scientific™“). Analizė vykdoma gelio analizės ir dokumentavimo sistemos „BIO-RAD Molecular Imager

Gel Doc

XR

“ pagalba.

Stebimas 147 bp ilgio fragmentas.

Restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas (RFIP)

Gauti PGR produktai karpomi restrikcinėmis endonukleazėmis. RFIP mišinio sudėtis:

dejonizuotas vanduo, 10x buferis G

ir Mn/I restrikcinė endonukleazė. Mėgintuvėliai su reakcijos mišiniu sandariai uždengiami, dedami į termomaišytuvą ir laikomi 2-16 val. 37

C temperatūroje.

Praėjus laikui, į kiekvieną PGR mėgintuvėlį pilama dar po 1,0 μl restrikcinės endonukleazės MspiI.

PGR mėgintuvėliai termomaišytuve 37

C temperatūroje laikomi 5-10 min. Gaunamas RFIP reakcijos mišinys.

Elektroforezė agarozės gelyje restrikcijos fragmentų įvertinimui

Elektroforezė restrikcijos fragmentams įvertinti atliekama 4 proc. agarozės gelyje, dažytame

etidžio bromidu. Gautų DNR fragmentų dydžiui įvertinti naudojamas molekulinės masės žymuo

pUC19 DNA/MspI („Thermo Scientific™“). Analizė vykdoma gelio analizės ir dokumentavimo

sistemos „BIO-RAD Molecular Imager

Gel Doc

XR

“ pagalba.

Rezultatų vertinimas

Rezultatai vertinami pagal stebimų fragmentų ilgį 4 proc. agarozės gelyje (6 pav.):

- 85 bp ilgio fragmentas – F5 G1691A pažaida nenustatyta;

- 85 bp ir 122 bp ilgio fragmentai – nustatyta heterozigotinė F5 geno G1691A pažaida;

- 122 bp ilgio fragmentas – nustatyta homozigotinė F5 geno G1691A pažaida.

6 pav. F5 geno G1691A pažaidos nustatymo PGR-RFIP elektroforegrama pUC19 DNA/MspI – DNR molekulinės masės žymuo ; 1 – P1 (pirmo paciento), F5 geno G1691A pažaida nenustatyta; 2 – P2 (antro paciento), heterozigotinė F5 geno G1691A pažaida; 3 – P3 (trečio

paciento), F5 geno G1691A pažaida nenustatyta; 4 – heterozigotinė kontrolė (K-Ht); 5 – neigiama kontrolė (K-Sv).

2.4.5 MTHFR geno A1298C ir C677T pažaidų tyrimo metodika

MTHFR geno A1298C ir C677T pažaidos nustatytos PGR-RFIP metodu. Kiekvienai PGR reakcijai buvo naudojama 2 μl DNR tirpalo ir 23 μl PGR reakcijos mišinio, kurio sudėtis nurodyta lentelėje (7). PGR vykdyta pagal (8) lentelėje aprašytas sąlygas.

PGR reakcija

Į Eppendorf tipo mėgintuvėlį gaminamas PGR reakcijos mišinys, kurio sudėtis nurodyta lentelėje (7).

7 lentelė. PGR mišinio sudėtis MTHFR geno A1298C ir C677T pažaidų nustatymui

Komponentas Kiekis vienai reakcijai, μl

dejonizuotas vanduo 16,55

10x PGR buferis su (NH

)

SO

2,5

MgCl

tirpalas 25mM 2,5

darbinio ATP7B ex13 dir pradmens

tirpalas 0,5

darbinio ATP7B ex13 rev pradmens

tirpalas 0,5

darbinio dNTP mišinio 0,2

Rekombinantinės Taq DNR polimerazė 0,25 Bendras reakcijos tūris 23

pUC19 DNA/MspI

P1 P2 P3 K-Ht K-Sv

122 bp

85 bp

Pilama po 23 μl purtykle sumaišyto PGR reakcijos mišinio į atskirą PGR mėgintuvėlį.

Pilama po 2 μl tiriamosios DNR į kiekvieną PGR mėgintuvėlį.

Pilama 2 μl žinomų kontrolinių homozigotinės, heterozigotinės teigiamos ir homozigotinės neigiamos reakcijos mėginių DNR į atitinkamus kontrolinius mėgintuvėlius.

Pilama 2 μl dejonizuoto vandens į neigiamos reakcijos kontrolės mėgintuvėlį (paskutinį).

Mėgintuvėliai uždaromi ir patalpinami į termomaišytuvą, PGR reakcija MTHFR geno A1298C ir C677T pažaidoms nustatyti vykdomą pagal programą (8 lentelė). Po PGR mėgintuvėliai su amplifikuotu PGR produktu laikomi tamsoje, šaldytuve (+2 – +8

C).

8 lentelė. PGR programa MTHFR geno A1298C ir C677T pažaidų nustatymui Temperatūra °C Trukmė Ciklų skaičius Procesas

95 °C 5 min 1 Pirminė denatūracija

94 °C 30 s

35

Denatūracija

62 °C 30 s Oligonukleotidų prisijungimas

72 °C 30 s DNR grandinės sintezė

72 °C 7 min 1 Sintezės užbaigimas

4 °C ∞.

Elektroforezė agarozės gelyje gautiems PGR produktams įvertinti

DNR elektroforezė vykdoma 2 proc. agarozės gelyje, dažytame etidžio bromidu. Naudojamas molekulinės masės žymuo pUC19 DNA/MspI („Thermo Scientific™“). Analizė vykdoma gelio analizės ir dokumentavimo sistemos „BIO-RAD Molecular Imager

Gel Doc

XR

“ pagalba.

Stebimas 198 bp ilgio fragmentas.

Restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas (RFIP)

Gauti PGR produktai karpomi restrikcinėmis endonukleazėmis. RFIP mišinio sudėtis C677T pažaidai: dejonizuotas vanduo, 10x buferis R ir RsaI restrikcinė endonukleazė. RFIP mišinio sudėtis A1298C pažaidai: dejonizuotas vanduo, 10x buferis R ir Bsp HI restrikcinė endonukleazė.

Mėgintuvėliai su reakcijos mišiniu sandariai uždengiami, dedami į termomaišytuvą ir laikomi ≥8 val.

37

C temperatūroje. Gaunami RFIP reakcijų mišiniai.

Elektroforezė agarozės gelyje restrikcijos fragmentų įvertinimui

Elektroforezė restrikcijos fragmentams įvertinti atliekama 4 proc. agarozės gelyje, dažytame etidžio bromidu. Gautų DNR fragmentų dydžiui įvertinti naudojamas molekulinės masės žymuo pUC19 DNA/MspI („Thermo Scientific™“). Analizė vykdoma gelio analizės ir dokumentavimo sistemos „BIO-RAD Molecular Imager

Gel Doc

XR

“ pagalba.

Rezultatų vertinimas

Rezultatai vertinami pagal stebimų fragmentų ilgį 4 proc. agarozės gelyje. MTHFR geno C677T pažaidos vertinimas (7 pav.):

- 198 bp ilgio fragmentas – MTHFR C677T pažaida nenustatyta;

- 198 bp, 175 bp ir 23 bp ilgio fragmentai – nustatyta heterozigotinė MTHFR geno C677T pažaida;

- 175 bp ir 23 bp ilgio fragmentai – nustatyta homozigotinė MTHFR geno C677T pažaida.

7 pav. MTHFR geno C677T pažaidos nustatymo PGR-RFIP elektroforegrama pUC19 DNA/MspI – DNR molekulinės masės žymuo ; 1 – P (paciento), MTHFR geno C677T pažaida

nenustatyta; 2 – homozigotinė kontrolė (K-Hm); 3 – heterozigotinė kontrolė (K-Ht); 23 bp ilgio fragmentas nesimato.

MTHFR geno A1298C pažaidos vertinimas (8 pav.):

- 79 bp, 37 bp ir 29 bp ilgio fragmentai – MTHFR A1298C pažaida nenustatyta;

- 108 bp, 79 bp, 37 bp ir 29 bp ilgio fragmentai – nustatyta heterozigotinė MTHFR geno A1298C pažaida;

- 108 bp ir 37 bp ilgio fragmentai – nustatyta homozigotinė MTHFR geno A1298C pažaida.

pUC19 DNA/MspI

P K-Hm K-Ht

198 bp

175 bp

8 pav. MTHFR geno A1298C pažaidos nustatymo PGR-RFIP elektroforegrama pUC19 DNA/MspI – DNR molekulinės masės žymuo ; 1 – P1 (pirmo paciento), MTHFR geno A1298C

pažaida nenustatyta; 2 – P2 (antro paciento), heterozigotinė MTHFR geno A1298C pažaida; 3– P3 (trečio paciento), MTHFR geno A1298C pažaida nenustatyta; 4 ir 6 – heterozigotinės kontrolės (K-Ht);

5 – homozigotinė kontrolė (K-Hm); 29 bp ilgio fragmentas nesimato.

2.5 Duomenų analizės metodai

Statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojant SPSS 22.0 for Windows (Statistical Package for Social Sciences, Microsoft Inc., Čikaga, Ilinojus, JAV) programinį paketą.

Apskaičiuoti požymių dažniai, vidurkiai ir standartinis nuokrypis − SN (angl. standart deviation). Kokybinių požymių tarpusavio priklausomumo hipotezei patikrinti buvo taikytas Chi kvadrato (χ

) kriterijus, o mažoms imtims taikytas tikslus Fišerio (Fisher's) kriterijus. Skirtumui tarp dviejų grupių vertinti taikytas Mann–Whitney testas (neparametriniams dydžiams).

Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp grupių apibrėžtas, jei reikšmingumo lygmuo p<0,05.

108 bp 79 bp 37 bp

DNA/MspI

P1 P2 P3 K-Ht K-Hm K-Ht

3. REZULTATAI

3.1 Tiriamųjų pasiskirstymas pagal demografinius ir klinikinius duomenis

Į tyrimą įtraukti 160 pacientų, 54 vyrų (33,8 proc.) ir 106 moterų (66,2 proc.), tyrimų duomenys. Tiriamųjų amžiaus vidurkis 42,3±14,3 m., mediana 39 m. (jauniausias 18 m., vyriausias 93 m.). Vyrų amžiaus vidurkis 40,9±14,8 m., mediana 39 m., moterų amžiaus vidurkis 42,9±14,1 m., mediana 38 m. Tiriamųjų vyrų ir moterų amžiaus vidurkis grupėse statistiškai reikšmingai nesiskyrė, (Mann-Whitney U testas, p=0,442).

Tiriamieji pagal amžių sugrupuoti į dvi amžiaus grupes – pacientus iki 50 m. amžiaus (n=106, amžiaus vidurkis 34,9±7,2 m., 66,3 proc.) ir 50 m. bei vyresnius pacientus (n=54, amžiaus vidurkis 61,6±9,5 m., 33,7 proc.), remiantis literatūros duomenimis. Genetiniai rizikos veiksniai, predisponuojantys trombofiliją ir atliekantys svarbų vaidmenį etiopatogeneziniame VTE vystymesi, yra vieni iš dažniausių (46,9 proc.) venų trombozės išsivystymo priežasčių jaunesniems kaip 50 metų amžiaus žmonėms [116, 117]. Be to, jaunesniems kaip 50 metų amžiaus pacientams dažniau pasireiškia giliųjų venų trombozės komplikacijos, tokios kaip potrombozinis sindromas [116, 118].

Tiriamieji pagal klinikinę diagnozę buvo suskirstyti į keturias grupes:

• I grupė: „GVT grupė“ – įtraukti pacientai su giliųjų venų trombozės diagnoze (n=72, 45 proc.);

• II grupė: „PE grupė“ – įtraukti pacientai su plaučių embolijos diagnoze (n=37, 23,1 proc.);

• III grupė: „NTP“ – įtraukti pacientai su netipinių vietų (smegenų venų, blužnies venos ir v. portae) trombozių diagnoze (n=5, 3,1 proc.);

• IV grupė: „NEV grupė“ – įtrauktos pacientės su pirminio arba antrinio nevaisingumo diagnoze (n=46, 28,8 proc.).

Tolesni šio tyrimo rezultatai pateikiami dvejose grupėse pagal klinikinę diagnozę – I, II ir III gr. apjungiamos į vieną, o IV gr. analizuojama atskirai dėl fiziologinio lyčių skirtumo lemiamos skirtingos trombozės patogenezės. I-III grupių pagal klinikinę diagnozę pasiskirstymas pagal lytį ir amžių yra pateikiamas 9 lentelėje. Į IV grupę pagal klinikinę diagnozę buvo įtrauktos tik moterys (43,4 proc. visų tirtųjų moterų), jų amžiaus vidurkis 34,6±5,3 m., pasikliautinasis intervalas (PI) 33,1-36,2, standartinė paklaida (SP) 0,8.

Vyrų ir moterų pasiskirstymas grupėse pagal klinikinę diagnozę statistiškai reikšmingai

nesiskyrė (p>0,05).

9 lentelė. Tiriamųjų imties pasiskirstymas pagal lytį ir amžių I-III grupėse pagal klinikinę diagnozę

KD grupė

Vyrai Moterys

n p (proc.)

Amžiaus vidurkis, m.±SN

Amžiaus

PI, m. SP n (proc.)

Amžiaus vidurkis, m.±SN

Amžiaus PI, m. SP I gr.

n=72

35

(64,8) 41,5±16,2 35,9-47,0 2,7 37

(34,9) 48,6±17,2 42,9-54,3 2,8 0,079 II gr.

n=37

14

(25,9) 42,4±11,8 35,6-49,2 3,1 23

(21,7) 50,4±12,4 45,1-55,8 2,6 0,049 III gr.

n=5

5

(9,3) 33,4±11,7 18,8-48,0 5,3 0

(0,0) 0±0,0 0,0-0,0 0,0 -

Visi 54

(100) 40,9±14,8 36,9-45,0 2,0 60

(100) 49,3±15,4 45,3-53,3 2,0 0,004 KD – klinikinė diagnozė; n – tiriamųjų skaičius; m. – metai; SN – standartinis nuokrypis; PI – pasikliautinasis intervalas; SP – standartinė paklaida; p – reikšmingumo lygmuo lyginant vyrų ir moterų amžiaus skirstinius.

Nustatyta, kad tiriamųjų, įtrauktų į II-ą grupę pagal klinikinę diagnozę, amžiaus skirstiniai vyrų ir moterų grupėse statistiškai reikšmingai skyrėsi (Mann-Whitney U testas, p=0,049). Lyginant amžiaus vidurkius II-oje grupėje pagal klinikinę diagnozę, vyrų amžiaus vidurkis buvo mažesnis lyginant su moterų, atitinkamai 42,4±11,8 m. ir 50,4±12,4 m. (vyrai jaunesni lyginant su moterimis).

I-III grupėse pagal klinikinę diagnozę amžiaus skirstinys vyrų ir moterų grupėse taip pat statistiškai reikšmingai skyrėsi (Mann-Whitney U testas, p=0,004), vyrų amžiaus vidurkis buvo mažesnis nei moterų, atitinkamai 40,9±14,8 m. ir 49,3±15,4 m. (vyrai jaunesni lyginant su moterimis).

3.2 F2, F5 ir MTHFR genų pažaidos ir jų pasiskirstymas

Iš 160 tirtų pacientų, bent vieno geno pažaida buvo nustatyta 40 pacientų (25 proc.) – 24 iš 114 tirtų dėl giliųjų venų trombozės, plaučių embolijos arba netipinių vietų trombozės (21,1 proc.) ir 16 iš 46 tirtų dėl nevaisingumo (34,8 proc.). F2, F5 ir MTHFR genų pažaidų skirstiniai lyginant I-III grupes su IV grupe statistiškai reikšmingai nesiskyrė (χ

=3,1, ll=1, n=160, p=0,133).

F2 geno pažaida tiriamojoje imtyje nustatyta septyniems iš 101 paciento (6,9 proc.), visiems tirtiems dėl giliųjų venų trombozės, plaučių embolijos arba netipinių vietų trombozės.

F5 geno pažaida tiriamojoje imtyje nustatyta devyniems iš 126 pacientų (7,1 proc.) –

septyniems iš 100, tirtų dėl giliųjų venų trombozės, plaučių embolijos arba netipinių vietų trombozės

(7,0 proc.) ir dviem iš 26, tirtų dėl nevaisingumo (7,7 proc.). Lyginant I-III grupes su IV grupe F5

geno pažaidos skirstiniai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p=0,825).