5. Discussione e conclusioni
Soltanto negli anni ’90 la comunità scientifica accettò come scientificamente valida la tesi della Neurogenesi nell’adulto, cioè la continua formazione di nuovi neuroni nelle fasi successive allo sviluppo embrionale e peri-natale in tutte le specie di vertebrato. Gli studi fatti su questa tematica sono perciò piuttosto recenti.
Tutti i vertebrati studiati mostrano di avere zone ad attività progenitrice nel loro cervello adulto e presentano, fra loro, una varietà nell’abbondanza di queste zone e nella loro capacità neurogenetica (Chapouton et al., 2007; Kaslin et al., 2008).
La neurogenesi adulta risulta un fenomeno plastico capace di intensificarsi con stimoli ambientali e con l’attività fisica (van Praag et al., 1999). In molte specie, uomo compreso, questo fenomeno tende però a diminuire esponenzialmente con l’età (Knoth et al., 2010). Questo declino è associato all’entrata in quiescenza delle cellule staminali neurali adulte le quali rimangono presenti nelle nicchie, ma perdono la loro attività neurogenica. Uno studio sulle cellule staminali della zona sottoventricolare (SVZ) di mammifero adulto ha ipotizzato che queste cellule, durante l’invecchiamento, mantengano integra la loro capacità neurogenica ma che tale capacità sia ostacolata da segnali restrittivi continuamente alimentati nell’ambiente circostante (Sequerra et al., 2013).
Questo declino della neurogenesi adulta durante l’invecchiamento si ritiene attribuibile alla diminuzione delle facoltà intellettive nell’individuo anziano. Difatti in uno studio condotto sul topo è stata bloccata neurogenesi nell’adulto provocando alterazioni nelle perfomance cognitive e nell’apprendimento (Lafenêtre et al., 2010). La presenza di cellule staminali neuronali nel sistema nervoso centrale adulto ha alimentato un forte interesse e grandi speranze per un potenziale impiego terapeutico. E’ infatti estremamente importante ampliare le conoscenze sui meccanismi molecolari che regolano la neurogenesi adulta e di come questi siano implicati in diverse condizioni patologiche.
Durante il lavoro del Dott. Alessandro Cellerino è stato effettuato il sequenziamento del trascrittoma del pesce teleosteo a vita breve N. furzeri (Baumgart et al., 2014). E’ stato così possibile identificare un ampio set di geni che mostrano una significativa variabilità nell’espressione genica nel cervello durante la vita del pesce. All’interno di questo gruppo di geni sono stati selezionati quelli che, in seguito alle analisi condotte, risultano avere un ruolo nella regolazione dell’espressione genica a livello di: conformazione della cromatina, attività trascrizionale o regolazione post-trascrizionale. Fra i geni selezionati troviamo: ZNF367, MEX3A e KRCP. Con questi geni sono state condotte ibridazioni in situ “whole mount” e immunoistochimiche per valutarne: l’espressione nelle sedi della neurogenesi embrionale in Zebrafish e l’espressione nelle sedi della neurogenesi adulta in N. furzeri a varie età. I risultati dimostrano che sono geni espressi nelle nicchie neurogeniche dell’embrione di Zebrafish (tetto ottico, lobi ottici e bulbi olfattivi) e dell’adulto di N. furzeri. Nel caso di N.furzeri l’espressione di questi geni diminuisce in funzione dell’età.
Il disegno sperimentale di questo lavoro si basa sull’ipotesi che gli stessi geni coinvolti nell'invecchiamento neurale siano coinvolti anche nella neurogenesi embrionale.
Sulla scia di questo lavoro è nato il mio progetto di tesi magistrale. Esso si propone di compiere un’analisi di espressione e di funzione di due dei geni selezionati, ZNF367 e MEX3A, utilizzando come animale modello Xenopus laevis. E’ infatti considerato l’organismo di eccellenza per eseguire in modo rapido ed efficace esperimenti di guadagno e perdita di funzione genica. Ciò grazie alla possibilità di microiniettare mRNA trascritti in vitro e oligonucleotidi antisenso, come i morpholini, insieme ad un tracciante (GFP) in un singolo blastomero dell’embrione. Si può così effettuare esperimenti di guadagno o perdita di funzione e analizzare i risultati ottenuti, comparando il lato manipolato con il lato non trattato che costituisce un ottimo controllo interno. Dunque lo scopo finale di questo progetto di tesi è quello di identificare se e come questi nuovi geni siano in grado di regolare la neurogenesi embrionale, contribuendo così alla neurobiologia dello sviluppo.
Il gene ZNF367 codifica per una proteina con motivo a dita di zinco (Cys2 Hys2) con attività di fattore di trascrizione. Questo gene risulta diminuire la sua espressione in funzione dell’età. Dall’analisi di espressione su Xenopus, condotta nel mio lavoro, si osserva che ZNF367 è localizzato allo stadio di neurula precoce e di “tailbud” in zone ad attività proliferativa e coinvolte nella neurogenesi embrionale: nel tubo neurale, nell’occhio, nella vescicola otica, nella parte anteriore del sistema nervoso in formazione e negli archi branchiali. Quest’ultima localizzazione potrebbe suggerire una possibile attività del gene ZNF367 nelle cellule delle creste neurali, una parte delle quali migrano proprio in questa sede per formare poi le strutture craniofacciali. Da questi risultati si potrebbe quindi ipotizzare un possibile coinvolgimento del gene ZNF367 nei processi neurogenetici in Xenopus.
Il gene MEX3A codifica invece per una “RNA binding protein” avente due domini KH e un dominio “RING finger”. Anche questo gene è stato identificato tra quelli che presentano una diminuzione di espressione in funzione dell’età. Dalla sua analisi di espressione si osserva che allo stadio di neurula precoce e tardiva è espresso in tutto il tubo neurale, sede della neurogenesi. Allo stadio di “tailbud”, sia precoce che tardivo, lo troviamo espresso nelle principali zone ad attività proliferativa e neurogenica: nella zona marginale ciliare della retina, nella vescicola otica, nei gangli cefalici, nella spina dorsale, in regioni anteriori del sistema nervoso (mesencefalo dorsale e mesencefalo ventrale) e negli archi branchiali, nello specifico nella regione sottoventricolare del romboencefalo. Anche qua questi dati ci suggeriscono una possibile attività regolatoria di MEX3A nei processi proliferativi neurogenici, con possibile coinvolgimento nelle cellule delle creste neurali. Questo profilo di espressione è simile a quello dell’omologo MEX3B in Xenopus il quale, allo stadio di neurula precoce, è localizzato nella piastra neurale e allo stadio di “tailbud” è localizzato nel cervello e negli archi branchiali (Takada et al., 2009).
Per avvalorare e comprendere meglio i dati raccolti dallo studio del profilo di espressione ho sottoposto i due geni ad uno studio funzionale di guadagno di funzione.
Per quanto riguarda MEX3A, la sua sovraespressione sembra indurre nel lato iniettato un evidente aumento della regione di espressione di Sox2. Questo gene è un marcatore molecolare di cellule staminali neurali, dunque allo stadio di neurula lo troviamo espresso in cellule indifferenziate, in piena attività proliferativa e con un destino neurale, cioè in tutto il tubo neurale. L’aumento della sua marcatura, indotto da sovraespressione di MEX3A, dovrebbe suggerire che questa “RNA binding protein” possa avere un ruolo nel mantenimento dello stato multipotente e proliferativo dei neuroblasti.
Per sciogliere il possibile dubbio che l’espansione del dominio di Sox2 sia dovuta ad una mancata chiusura del tubo neurale nel lato iniettato e non ad un effettivo aumento dell’espressione del marcatore stesso, ho analizzato neurule a stadi più precoci. Ho sovraespresso MEX3A e fissato gli embrioni manipolati a stadio 13/14 quando la piastra neurale è completamente aperta. Nel lato iniettato si osserva una netta espansione del dominio di Sox2, dunque confermiamo un possibile aumento dei livelli di espressione del marcatore.
Il marcatore molecolare p27 si trova espresso in quelle cellule che si avviano ad uscire dal ciclo cellulare. A livello di neurula crea una marcatura lieve ma diffusa in tutto il tubo neurale e una marcatura più definita e intensa in una striscia di cellule laterale che evidentemente costituiscono le prime cellule che si avviano verso il differenziamento. La sovraespressione di MEX3A rende più espanso ma meno intenso il dominio di p27 nel tubo neurale a livello dorsale e comporta una parziale perdita di segnale nella regione anteriore del tubo neurale. Inoltre appare meno definita e densa la striscia di cellule laterale. Ciò suggerisce che la sovraespressione di MEX3A induca una diminuzione nel numero di cellule che esprimono p27 e dunque che si avviano ad uscire dal ciclo cellulare. L’espansione del dominio dorsale di p27 potrebbe essere
dovuta all’aumento di espressione di Sox2.
XelrC è invece espresso da quelle cellule che sono già uscite dal ciclo cellulare e che iniziano a differenziarsi, lo ritroviamo dunque allo stadio di neurula, con un segnale molto intenso, in tre strisce di cellule ai due lati del tubo neurale e nei placodi del trigemino. La sovraespressione di MEX3A sembra comportare un’espansione del territorio delle tre strisce cellulari, rendendo però la marcatura meno intensa e più scompaginata. Ciò suggerisce la presenza di un maggior numero di neuroblasti, anche qua probabilmente indotto dall’aumento di espressione di Sox2 e di un minor numero di cellule in differenziamento.
Altro marcatore è Twist che viene espresso nelle cellule delle creste neurali e la sovraespressione di MEX3A tende a rendere leggermente alterato questo territorio di espressione, comportando una parziale perdita degli “streams” di migrazione. Ciò suggerisce che tale sovraespressione vada ad alterare anche lo sviluppo delle cellule delle creste neurali. Questa ipotesi è avvalorata da quanto osservato nel profilo di espressione di MEX3A, ovvero la sua localizzazione a livello degli archi branchiali. Dato che la proteina MEX3A svolge un’attività regolatoria post-trascrizionale nei confronti dei suoi RNA messaggeri target. La proteina MEX3 di Caenorhabditis elegans possiede due domini KH tramite i quali lega RNA messaggeri (Ciosk et al., 2006), la proteina MEX3B di Xenopus possiede anch’essa due domini KH e un dominio “RING finger”, entrambi con attività regolatoria (Takada et al., 2009). La famiglia di proteine umane hMEX3A-D è caratterizzata da due domini KH e un dominio “RING finger” ed è implicata in processi di: trasporto nucleo-citoplasmatico, modifiche post-trascrizionali e ubiquitinazione (Buchet-Poyau et al.,2007). Osservando i fenotipi ottenuti dallo studio del guadagno di funzione, si può ipotizzare che questa attività regolatoria di MEX3A abbia un ruolo anche nella neurogenesi embrionale di Xenopus laevis. Questo ruolo appare associato al mantenimento dei neuroblasti in uno stato indifferenziato e proliferativo, in questo caso si spiegherebbe l’aumento di espressione di Sox2, e alla resistenza verso quei segnali che invece inducono le cellule ad uscire dal ciclo cellulare e ad intraprendere un destino
differenziativo. In questo secondo caso invece si giustificherebbe i più bassi livelli di p27 e XelrC e le alterazioni nel dominio di espressione di Twist. L’ipotetico ruolo di MEX3A nel mantenimento delle staminalità neurale in Xenopus appare in accordo con quanto riscontrato nello studio dell’omologo di MEX3A nell’uomo (Pereira et al., 2013). In questo studio infatti è stato dimostrato che MEX3A, a livello del tessuto intestinale, svolge una specifica attività regolatoria post-trascrizionale. Fra i suoi mRNA target troviamo CDX2 che costituisce un fattore di differenziamento delle cellule intestinali a livello embrionale e tumorale. MEX3A regola negativamente CDX2 mantenendo le cellule intestinali in uno stato indifferenziato e proliferativo. Infine il fenotipo riscontrato con il marcatore Engrailed/Krox20 suggerisce che MEX3A non abbia un ruolo determinante nella formazione dell’asse antero-posteriore dell’embrione, infatti la sua sovraespressione non altera minimamente la regionalizzazione delle strutture neuronali lungo l’asse (mesencefalo e rombomero 3 e 5).
Per quanto riguarda lo studio del guadagno di funzione di ZNF367 osserviamo che la sovraespressione di questo gene comporta dei fenotipi, nei territori di espressione dei marcatori molecolari utilizzati, molto simili a quelli ottenuti per MEX3A. I marcatori utilizzati sono gli stessi: Sox2, p27, XelrC, Twist e E/K. Anche qua ho inoltre analizzato la sovraespressione di ZNF367 in neurule precoci (stadio13/14), ottenendo lo stesso risultato di MEX3A: un’espansione del dominio di Sox2. Dunque si può affermare che la proteina ZNF367 abbia attività di fattore di trascrizione, come dimostrano gli studi effettuati sui due geni omologhi umani ZFF29a e ZFF29b (Asano et al., 2004), e che questa attività sia coinvolta nei processi della neurogenesi embrionale di Xenopus, contribuendo al mantenimento dei neuroblasti in uno stato indifferenziato e proliferativo. Questa ipotesi non trova conferme nelle poche conoscenze presenti in letteratura, anzi è in contrasto con i risultati ottenuti dall’analisi del ruolo del gene ZNF367 nei tumori al sistema endocrino (Jain et al., 2014). Da questa analisi infatti il gene sovraespresso risulta inibire la proliferazione cellulare in linee cellulari tumorali mantenute in vitro. Questo risultato è però in
contrasto con il fatto che ZNF367 risulta essere espresso ad alti livelli nei processi tumorali al sistema endocrino analizzati.
Per confermare i risultati ottenuti e le ipotesi elaborate finora ho proseguito lo studio di funzione dei due geni tramite un’analisi di perdita di funzione. Per ciascuno dei due geni ho avuto a disposizione due morpholini che nelle due analisi sono stati utilizzati sia singolarmente che insieme. In entrambi i casi osserviamo che la microiniezione del o dei morpholini non comporta, né per MEX3A, né per ZNF367, alcuna alterazione dei domini di espressione dei tre marcatori molecolari utilizzati: Sox2, p27 e XelrC. Possiamo attribuire la spiegazione di questi risultati ai comuni limiti di questa tecnica e dunque al semplice non funzionamento dei morpholini disegnati: non sono riusciti ad appaiarsi in maniera specifica e stabile al 5’ UTR degli mRNA target, così da bloccarne la traduzione. Altro ostacolo da considerare è la presenza, allo stadio di due blastomeri, del trascritto materno dei due geni il quale al momento della microiniezione può sequestrare il morpholino a lui complementare. Dunque quest’ultimo se iniettato a concentrazioni troppo basse può non essere più disponibile al momento della trascrizione del suo mRNA target da parte dell’embrione. Per quanto riguarda MEX3A l’assenza di fenotipo può anche essere attribuibile ad un effetto di ridondanza genica dovuta alla presenza del suo omologo MEX3B, il quale riuscirebbe nell’embrione manipolato a compensare questa perdita di funzione. Mentre a supporto dei risultati ottenuti per ZNF367 troviamo le informazioni raccolte dal “Sanger Mouse Genetics Project (MGP)” da cui si apprende la perdita di funzione di ZNF367 nel topo non comporta anormalità significative.
Questi esperimenti condotti durante il mio lavoro di tesi risultano dunque interessanti. Essi sembrano confermare anche in Xenopus laevis la localizzazione dei due geni, ZNF367 e MEX3A, nelle nicchie neurogeniche embrionali. Tale localizzazione era stata infatti osservata in Nothobranchius furzeri e in Zebrafish durante il lavoro del Dott. Cellerino e del nostro laboratorio. Inoltre i risultati del guadagno di funzione suggeriscono un ruolo dei due geni nel mantenere una condizione di staminalità nei
neuroblasti. Ciò rafforzerebbe l’ipotesi portante del progetto e cioè la continuità fra i geni che regolano la neurogenesi embrionale e quelli che regolano la neurogenesi adulta e il suo invecchiamento.
Tutto questo è da considerarsi un supporto essenziale per incentivare analisi future. Dovranno essere condotte ulteriori analisi funzionali dei due geni, sia per confermarne il ruolo nella neurogenesi embrionale, sia per studiarne l’eventuale ruolo nella neurogenesi adulta. Sempre tramite analisi funzionali si dovrà confermare l’attività della proteina ZNF367 come fattore di trascrizione, cercando di identificare su quali promotori agisce e l’attività di MEX3A come proteina che lega gli mRNA, cercando di identificarne i target. Sarà inoltre necessario effettuare saggi di proliferazione cellulare per valutare il ruolo di questi geni in maniera più precisa e quantitativa. Queste analisi potranno essere condotte oltre che in Xenopus anche su altri modelli animali, primo fra tutti Zebrafish, affermato come modello per lo studio della genetica e dell’embriogenesi precoce nei vertebrati, grazie ai suoi numerosi vantaggi: le dimensioni ridotte (al massimo 5-6 cm di lunghezza), le quali ne consentono l’allevamento in spazi minimi, la facilità di accoppiamento, la notevole quantità di uova che ogni femmina può deporre (100 – 200 circa per evento riproduttivo) e la trasparenza degli embrioni che permettono analisi genetiche e molecolari su larga scala. Inoltre Zebrafish possiede un’eccellente e diffusa attività neurogenica che mantiene per tutta la sua vita e che gli permette di ripristinare continuamente nuovi neuroni.
Nel complesso i risultati presentati in questa tesi permettono di trarre alcune conclusioni:
E’ stato dimostrato per la prima volta nei vertebrati il profilo di espressione del gene ZNF367 e del gene MEX3A. Esso rivela la loro localizzazione in specifiche regioni ad attività neurogenica negli stadi di neurula, “tailbud” e larva precoce di Xenopus laevis.
Il guadagno di funzione del gene ZNF367 e del gene MEX3A comporta, nel lato manipolato dell’embrione di Xenopus laevis, un’alterazione nei domini di espressione di alcuni marcatori molecolari neurali. Ciò suggerisce che, all’interno della neurogenesi embrionale, entrambi i geni abbiano il ruolo di mantenere i neuroblasti in uno stato indifferenziato e proliferativo ma non siano implicati nella formazione dell’asse antero-posteriore.
La perdita di funzione del gene ZNF367 e del gene MEX3A, tramite l’utilizzo di morfolini, non comporta alcun fenotipo apprezzabile nel lato manipolato dell’embrione di Xenopus laevis.
