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Capitolo 4 Discussione –
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Un ostacolo fondamentale alla ricerca sulle cellule mesenchima-li staminamesenchima-li è l’impossibimesenchima-lità di avere colture cellulari omogenee. Infatti colture cellulari di MSC allestite partendo da tessuti diver-si, o utilizzando diverse metodologie di isolamento, differiscono ad esempio per capacità proliferative e per alcuni antigeni espressi. È plausibile che questo sia dovuto alla presenza di cellule a diver-si livelli di differenziamento nella coltura. Alcuni gruppi di ricerca sono riusciti ad isolare dei progenitori delle cellule mesenchimali, capaci di dare origine a colture omogenee. Sono state così indivi-duate linee cellulari quali le MAPC, le VSEL e le MIAMI20-23.
Come queste ultime le Mesodermal Progenitor Cell (MPC) rappre-sentano una tipologia di cellule, recentemente isolate24-25, con
carat-teristiche di progenitori di cellule mesenchimali e sulle è stato in-centrato questo studio.
Le MPC mostrano varie peculiarità rispetto agli altri precursori di cellule mesenchimali e rispetto alle MSC stesse. In particolare, vi-ste le grandi capacità adesive di questi progenitori e l’importanza che le cellule mesenchimali stromali ricoprono nella nicchia, dove i fenomeni di adesione sono fondamentali, l’attenzione in questo stu-dio si è focalizzata sulle molecole di adesione delle MPC, valutan-do le analogie e le differenze con le più studiate cellule
mesenchi-mali stromesenchi-mali.
I dati provenienti dall’indagine sia genetica che proteica sulle Inte-grine mostrano delle differenze sensibili nel pattern di espressio-ne di queste importanti proteiespressio-ne di membrana espressio-nelle due popolazio-ni cellulari esaminate.
L’adesione delle MPC a plastiche idrofobiche è risultato un dato particolarmente interessante: abbiamo quindi effettuato una ricer-ca bibliografiricer-ca su strutture di adesione particolari, individuando nel podosoma la struttura di adesione maggiormente compatibile con i dati a disposizione sulle MPC47. La presenza di adesioni
fo-cali sembra invece essere esclusa dalla negativita per l’espressione della Paxillina e per la particolare conformazione dell’Actina (imu-nofluorescenza).
I podosomi sono strutture di adesione descritte su alcune popo-lazioni cellulari, costituite molecole di Integrina disposte attorno ad un core puntiforme composto da Actina e altre proteine acces-sorie quali la Gelsolina. queste strutture sono presenti su tutta la superficie cellulare. Una prima analogia rispetto a strutture simil-podosomiali nelle MPC è data dalla particolare conformazione del-l’F-Actina che qui, invece di formare i tipici filamenti elastici che compongono il citoscheletro, si trova disposta in maniera puntifor-me lungo tutta l’estensione della cellula.
Dati di RT-PCR mostrano inoltre come le MPC trascrivano mR-NA per l’integrina β2, αL, αM e αX. Queste integrine si trovano solitamente associate tra loro (integrine αLβ2, αMβ2, αXβ2) e nel-la struttura podosomiale circondano i dots actinici. Gli esperimen-ti di microscopia a fluorescenza dimostrano che le integrine αM, αL sulle MPC colocalizzano con la β2 attorno alle strutture actini-che puntiformi. Inoltre la Gelsolina nelle MPC è localizzata in cor-rispondenza degli spot di actina polimerizzati, come si evince an-cora dagli esperimenti di immunofluorescenza.
Questi dati sembrano indicare una disposizione delle Integrine, dell’Actina e della Gelsolina del tutto compatibile con quella che si ha nel podosoma.
I risultati di Real Time PCR evidenziano infine come vi sia una maggior trascrizione dei geni per la sintesi di metalloproteinasi (MMP7, MMP8, MMP9, MMP12) che in letteratura sono riporta-te48 come gli enzimi principali sintetizzati in prossimità di un po-dosoma. L’RNA messaggero per queste proteinasi inoltre è espresso a bassissimi livelli nelle cellule mesenchimali stromali, ad indicare
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una loro minor capacità di aderire e di invadere certi tessuti. L’espressione dell’integrina β2 e delle altre Integrine ad essa solita-mente collegate (αL, αM ed αX) è interessante non solo perché di solito sono presenti in strutture di tipo podosomiale, ma anche, e sopratutto, perché sono molecole di superficie implicate in fenome-ni di invasione: ad esempio l’integrina αLβ2 è fondamentale per far raggiunger i tessuti sede di infiammazione ai leucociti circolanti. Questa integrina è infatti capace di legare la molecola di superficie ICAM ed attivare, con una segnalazione outside-in, i processi ne-cessari a far attraversare alla cellula l’endotelio e la membrana ba-sale, in letteratura l’espressione dell’integrina β2 è sempre associa-ta a cellule che mostrano la capacità di muoversi attraverso i tessuti. Particolarmente interessante, a questo proposito, è un lavoro di Rombouts et al. del 200349 il quale mostra come cellule
mesenchi-mali di topo, iniettate in modello animale irradiato siano in grado di fare homing nel midollo osseo ed in vari organi. Tale capacità è però persa con la coltura. Questo potrebbe essere spiegato con la presenza iniziale di un numero rilevante di MPC, le quali, grazie anche alla presenza di integrina β2, potrebbero essere in grado di colonizzare i vari tessuti. È ipotizzabile che le MPC agiscano come un pool di riserva di cellule non ancora differenziate in cellule me-senchimali, in grado di mobilizzarsi e di dare origine a vari tipi cel-lulari a seconda della necessità dell’organismo.
Riteniamo pertanto necessario allestire studi sia in vivo che in vitro in grado di evidenziare una eventuale capacità delle cellule MPC di dare luogo a fenomeni di intra/extra-vasation.
A supporto del possibile fenomeno di intra/extra-vasation delle MPC è interessante la presenza di mRNA per l’integrina α4. Cellu-le mesenchimali trasfettate in modo da avere un’espressione tran-siente di Integrina α4, mostrano infatti un’alta capacità di dar luogo a fenomeni di homing e quindi di colonizzare i tessuti in anima-li modello irradiati50. I livelli di espressione di mRNA
dell’integri-na α4 non sono però significativamente diversi tra MSC e MPC a causa della variabilità dei vari campioni, nonostante in media risul-ti circa duecento volte più espressa nelle MPC. Si rende quindi ne-cessario un ampliamento del numero di campioni, in modo da poter delineare meglio una possibile differenza a livello di trascrizione, nonchè eventuali analisi proteiche per cercare possibili processi di regolazione post-trascrizionale.
molecolar-mente le MPC, emerge che esse risultano positive riguardo all’e-spressione di Nestina, un filamento intermedio del citoscheletro, utilizzato come marcatore di cellule neuronali in fase di sviluppo. In un recente studio Frenette et al.51 hanno evidenziato come
cellu-le che, in vitro, si comportano in maniera del tutto simicellu-le alcellu-le MSC e risultano essere Nestina+ siano presenti e funzionalmente attive nella nicchia ematopoietica. Queste cellule si trovano a stretto con-tatto con le HSC, ricevono input da fibre nervose adrenergiche e, se eliminate, causano una diminuzione consistente nel numero delle cellule staminali emopoietiche (HSC).
Questo mostra come nella nicchia ematopoietica le HSC e le MSC coesistano sia strutturalmente che fuinzionalmente. Inoltre le cel-lule Nestina+ descritte potrebbero corrispondere alle MPC le quali, oltre a poter generare MSC e ad esprimere Nestina, esprimono an-che componenti di adesione implicate anan-che nella regolazione del-la nicchia ematopoietica.
Le MPC infatti, a differenza delle MSC, esprimono la proteasi MMP9, nota per aumentare la proliferazione e la mobilitazione del-le HSC52, in quanto capace di agire sulla molecola associata a
mem-brana Kit ligand (KitL), questa è così rilasciata in forma solubile (sKitL) e va ad attivare un complesso pathway, capace di favorire la proliferazione e lo spostamento verso la nicchia vasale delle HSC. Le MPC potrebbero quindi avere un ruolo attivo in questo proces-so o, vista la capacità di secernere diverse metalloproteinasi, esse-re implicate in eventi simili.
Altre due molecole fondamentali nella nicchia il cui mRNA è tra-scritto dalle MPC sono l’Osteopontina (OPN) e Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 (PECAM1).
L’Osteopontina nella nicchia è responsabile del movimento verso l’endostio delle HSC tramite il suo legame con le integrine β1. Le MPC, che esprimono fortemente OPN, potrebbero quindi entrare in contatto con le HSC e regolarne la funzione svolgendo un ruolo si-mile a quello degli osteoblasti implicati nella nicchia53.
PECAM è una molecola di adesione appartenente alla famiglia del-le immunoglobine, il cui ruolo nella nicchia è emerso più di recen-te. Solitamente espresso sulle HSC, ne regola la risposta al gradien-te di concentrazione di SDF-1 e regola i livelli di MMP954. La sua
Espressione sulle MPC potrebbe stare ad indicare un tipo di regola-zione molto simile a quello delle HSC.
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di Integrine, nello specifico l’integrina β2 associata a Integrina αL, αM o αX possa essere implicata in processi di mobilizzazione o di homing delle MPC. Infatti questa è una proteina presente solita-mente su cellule capaci di passare la barriera endoteliale. È inoltre noto il ruolo dell’integrina β1 nella mobilitazione, essendo la stessa integrina espressa dalle MPC, è ipotizzabile una simile funzionali-tà anche in questa popolazione cellulare.
La complessa nicchia ematopoietica, individuata inizialmente co-me ambiente regolatorio delle sole HSC, svolge in realtà anche un ruolo fondamentale per lo sviluppo dei vari lineage mesenchima-li. Secondo il modello attualmente riconosciuto, dalle MSC deriva-no osteoblasti condrociti, fibroblasti, adipociti dalle HSC derivaderiva-no invece tutte le cellule del sangue, mentre i precursori delle cellule endoteliali proverrebbe dal mesangioblasto, un precursore comune alle HSC. La possibilità delle MPC di generare sia cellule endote-liali che cellule mesenchimali stromali non si trova in completo ac-cordo con questo modello, ma evidenzia piuttosto come la compo-nente stromale della nicchia contenga vari tipi di progenitori, più o meno indirizzati verso una certa linea cellulare e la cui importanza è sempre più riconosciuta.
Le implicazioni delle MPC nella nicchia ematopoietica e quindi nell’omeostasi dell’intero organismo possono essere molto impor-tanti e la presenza di particolari molecole di adesione ne è un fon-damentale indizio. Servono però studi più approfonditi in vitro, ad esempio esperimenti che confermino il supporto delle MPC a cel-lule HSC, ed in vivo, come l’analisi dell’andamento del numero di HSC in relazione a particolari modificazioni nelle MPC.
La differente espressione di certe subunità integrinche potrebbe es-sere alla base anche della diversa capacità di adesione in vitro mo-strata da MSC e MPC. Ricapitolando infatti, da dati di RT-PCR e immunofluorescenza, emerge come le MPC esprimano, maggior-mente rispetto alle MSC, le integrine α6β1, αLβ2, αMβ2 e αXβ2. Queste molecole sono capaci di agire come recettori per Fibrinoge-no, ICAM, Laminina e Fattore X. Le peculiarità nelle capacità ade-sive emerse possono essere dovute a questa differenza nel pattern di Integrine espresse. A conferma di ciò sarà però necessario alle-stire esperimenti successivi che provochino il blocco delle integri-ne tramite anticorpi diretti verso i siti attivi di legame o che saturi-no le Integrine stesse con una alta concentrazione di usaturi-no specifico ligando.
La presenza specifica di certi marcatori superficiali, come le Inte-grine, può essere inoltre utilizzata per isolare ex vivo queste cellule partendo da sangue midollare. Questo è infatti un campo di ricer-ca molto interessante e potrebbe facilitare in seguito l’utilizzo clini-co di queste cellule. Attualmente le caratteristiche antigeniche delle MPC utilizzate per questo scopo sono CD105+, SSEA-4+, CD90- e
MCSA-1-. L’espressione di Integrine può quindi essere utilizzata,
assieme a quella dei marcatori elencati, per migliorare le metodo-logie di isolamento ex vivo delle MPC in fase di studio. In partico-lare, sulla base di esperimenti di citometria, le popolazioni MPC e MSC appaiono ben distinte sulla base dell’espressione dell’Integri-na αX (CD11c), questo può quindi essere proposto come un antige-ne adatto per esperimenti di isolamento ex vivo di MPC.
In maniera sinottica è possibile concludere che:
• Vi sono evidenze ottenute tramite RT-PCR e immunofluore-scenza che le popolazioni MPC e MSC esprimano diverse in-tegrine. Nello specifico le MPC trascrivono una maggior quan-tità di mRNA per le integrine α6, αL, αM, αX, β2 e β4 e sono positive ad esperimenti di immunofluorescenza per le integri-ne β2, αL, αX. Questo può portare a mostrare capacità adesive diverse, in particolare aumenterà l’affinità per ICAM, Fibrino-geno, Laminina e Fattore X.
• Ancora evidenze di RT-PCR ed immunofluorescenza mostra-no come strutturalmente siamostra-no presenti strutture simil-podo-somiali. Infatti si ha la presenza di F-Actina polimerizzata distribuita in punti lungo tutta la superficie cellulare, questa co-localizza con la proteina Gelsolina ed è circondata da inte-grine β2, αL e αX proprio come nelle strutture podosomiali fi-nora descitte. Inoltre si ha una iper-trascrizione nelle MPC ri-spetto alle MSC di metalloproteinasi MMP7, MMP8, MMP9 e MMP12, le quali sono esattamente le proteinasi implicate nel-le strutture podosomiali.
• La presenza di integrine β2 e αL, αM e αX potrebbe essere cor-relata con l’eventuale capacità delle MPC di invadere i tessuti. • Pur senza una differenza significativa rispetto alle MSC le
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lule MPC esprimono integrina α4, la quale pare essere implica-ta nei processi di intra/extra-vasation
• Le MPC potrebbero comporre la parte Nestina+ della nicchia
ematopoietica. Oltre alla Nestina esse esprimono infatti mole-cole implicate nella regolazione della nicchia quali PECAM1, OPN, MMP9 e Integrina β1 e β2. Si può ipotizzare che le MPC subiscano una fine regolazione con meccanismi comuni anche alle HSC e a loro volta mostrino capacità regolatorie sulle HSC Gli esperimenti che saranno messi a punto in un prossimo futuro per rispondere alle domande rimaste in sospeso:
• Verifica dell’effettiva presenza di podosomi con analisi di mar-catori specifici (Wasp/N, Cortactina, Arp2/3) e con test funzio-nali (invasione di Matrigel e UVEAL cells).
• Approfondita analisi proteomica volta a chiarire quali subunità integriniche sono tra loro associate nelle MPC, ad esempio con esperimenti di Co-immunoprecipitazione.
• Analisi della capacità di invadere tessuti in modelli animali. • Verifica in vivo della presenza di MPC nella nicchia
ematopoie-tica ed esperimenti quali la verifica in vitro ed in vivo del sup-porto alle HSC.
• Blocco delle integrine con Ab o tramite saturazione con speci-fici ligandi per valutarne gli effetti sull’adesività.
• Utilizzo delle Integrine assieme a marcatori superficiali quali CD105 e SSEA-4 per l’isolamento ex vivo delle MPC da midol-lo osseo umano, per eventuali applicazioni cliniche.
