2. Materiali e Metodi
Materiali e Metodi
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2.1 Clonaggio (Sambrook et al., 1989)
Frammenti lineari di DNA, detti inserti, possono venire inseriti in opportuni vettori plasmidici tramite una reazione di “ligation” e poi amplificati sfruttando la capacità delle cellule batteriche di replicare, insieme al proprio genoma, anche molecole di DNA extracromosomico. Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato soprattutto il vettore pCS2+. Esso contiene due
"polylinker", cioè sequenze con all'interno siti di restrizione, che consentono
l'introduzione di DNA esogeno; un promotore di Citomegalovirus, che consente la trascrizione costitutiva dei geni, inseriti a valle, nelle cellule eucariotiche; si trova, anche, una sequenza di poliadenilazione di SV40. Inoltre, un SP6 promoter permette la trascrizione in vitro dell' mRNA senso dell'inserto di interesse, mentre un T7 promoter è utilizzato per la sintesi dell'mRNA antisenso. Il vettore pCS2+ contiene anche un'origine di replicazione batterica (COLE1 ori), in grado di guidare la replicazione del vettore all'interno delle cellule batteriche; infine, è presente un gene per la resistenza all'ampicillina (amp), in grado di conferire resistenza a tale antibiotico, alle cellule batteriche che contengono questo plasmide.
L’inserto da clonare può venire escisso da un altro plasmide, attraverso la digestione con appositi enzimi di restrizione, o amplificato per mezzo di specifici primers con il metodo della PCR. Ove possibile, sia l’inserto, sia il plasmide, vengono linearizzati usando lo stesso enzima di restrizione o enzimi che producono estremità compatibili, in modo che le due estremità siano in grado di appaiarsi tra loro. Dopo la digestione, vettore ed inserto vengono sottoposti, entrambi, ad elettroforesi su gel di agarosio ed osservati mediante
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transilluminazione ai raggi ultravioletti. Successivamente, le bande corrispondenti al frammento di DNA e al vettore vengono eluite dal gel. Per evitare reazioni di circolarizzazione del vettore, è opportuno effettuare una defosforilazione mediante la SAP (fosfatasi alcalina di gambero). Per effettuare la reazione di defosforilazione, occorre calcolare il numero di picomoli (pmol) di estremità 5' del vettore plasmidico linearizzato presente nel campione, mediante la formula:
pmol(estremità 5') = µg (DNA) . 3,04 / Kb (dimensione vettore)
in cui µg indicano la quantità di DNA presente nel campione da sottoporre alla reazione di defosforilazione, mentre Kb corrisponde alla dimensione del vettore plasmidico espressa in kilobasi. Per ogni pmol di estremità 5' adesive (generate da endonucleasi che creano estremità protrundenti) occorre 1 µl di SAP. Si prepara una miscela di reazione, secondo il seguente protocollo:
10 µl di DNA X µl di SAP
2 µl di buffer SAP 10x
H2O mq (fino a 20 µl di volume finale) (H2O mq è H2O bidistillata, ultrapura)
Si fa procedere la reazione per 10 minuti a 37°C, poi si inattiva la SAP a 65°C per 15 minuti.
Il passo successivo prevede il legame tra l’inserto ed il vettore, per mezzo dell’enzima T4 DNA ligasi. Questa reazione di ligation permette di unire le estremità di un plasmide linearizzato con quelle di un frammento lineare di DNA. Per ogni reazione di ligation abbiamo utilizzato:
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T4 DNA ligasi buffer 5X
0.5 unità di T4 DNA ligasi (Fermentas) 100 ng di plasmide linearizzato
quantità variabili di inserto (a seconda delle dimensioni dell'inserto stesso) H2O mq (fino a 20 µl di volume finale)
Per ciascun clonaggio abbiamo eseguito più reazioni di ligation, variando in esse la quantità di inserto (generalmente abbiamo utilizzato un rapporto molare vettore: inserto 1:3). Inoltre, è importante eseguire anche dei controlli interni: uno è rappresentato dalla “self-ligation”, una reazione di ligation in cui non viene aggiunto l’inserto alla miscela, per valutare la capacità del vettore di richiudersi su se stesso ed avere una stima dell'efficacia della defosforilazione del vettore.
Le varie reazioni di ligation vengono utilizzate per trasformare cellule batteriche competenti. Le cellule sono piastrate su un terreno selettivo (LB-agar contenente 100 µg/ml di ampicillina). Il giorno seguente si prelevano dalle piastre singole colonie, che risultano cloni derivati da un’unica cellula iniziale. E' opportuno che le piastre del controllo, ottenute trasformando con la reazione di self-ligation, contengano poche colonie in confronto a quelle ottenute con la ligation, potendo così ritenere che la reazione di circolarizzazione sia sfavorita in assenza dell'inserto. D’altra parte, molte colonie nel controllo indicano che il vettore si richiude facilmente su se stesso e perciò sono sintomo di una defosforilazione insoddisfacente del vettore.
Infine, si effettua uno "screening" delle colonie positive, mediante PCR su singole colonie.
