RIASSUNTO
L’Acromegalia è caratterizzata da eccessiva secrezione di ormone della crescita (GH),dovuta alla presenza di adenomi ipofisari, con il conseguente elevato aumento della sintesi del fattore di crescita insulino-simile di tipo I (IGF-I ).
L’isoforma gamma del recettore attivato dai proliferatori dei perossisomi (PPARgamma), è un fattore di trascrizione nucleare appartenente alla
superfamiglia dei recettori steroidei e tiroidei. PPARgamma è espresso negli adenomi ipofisari GH-secernenti, nella linea cellulare ipofisaria GH-secernente di ratto (GH3) e in misura minore, nel fegato. I tiazolidinedioni (TZDs), ligandi sintetici di PPARgamma, sono stati proposti come nuovi farmaci nel trattamento degli adenomi ipofisari. Nel fegato, il GH stimola la produzione di IGF-I
attivando STAT5b. Lo scopo del progetto di ricerca è stato quello di valutare il ruolo di PPARgamma e dei suoi ligandi nella regolazione dell’espressione di GH e di IGF-I, sia in vitro, impiegando due linee cellulari specifiche dell’ipofisi e del fegato (GH3 e HepG2, rispettivamente), sia in vivo, utilizzando un
modello acromegalico murino. I risultati dimostrano che nelle GH3, i TZDs inibiscono la sintesi e la secrezione dell’ormone della crescita, attraverso un meccanismo PPARgamma-dipendente che coinvolge la 5’flanking region del gene del GH (hGH). PPARgamma, come complesso eterodimerico con il recettore dell’acido 9-cis (RXRalfa), si lega al promotore di hGH in
corrispondenza della sequenza nucleotidica di 54 paia di basi (bp) tra la
posizione -330 e -276, indicando la presenza di un putativo elemento di risposta a PPAR (PPRE). Nelle HepG2, i TZDs inibiscono l’espressione di IGF-I con un meccanismo PPARgamma-dipendente; tuttavia, in esperimenti di trasfezione transitoria impiegando la 5’flanking region del gene di IGF-I, i ligandi di PPARgamma non modificano il livello di espressione del “reporter gene”, suggerendo un effetto indiretto. Inoltre, il trattamento con GH, come atteso, aumenta l’espressione di STAT5b, contrariamente ai TZDs che la riducono.
Perciò è probabile che l’azione del GH e dei ligandi di PPARgamma nella regolazione dell’espressione di IGF-I sia mediata, a livello molecolare, da STAT5b. D’altra parte, un esperimento pilota impiegando topi transgenici che sovraesprimono il GH bovino, dimostra che somministrando a lungo termine i TZDs (1mg/Kg die) non si modifica il livello di IGF-I circolante. Al contrario, trattando ratti Wistar-Furth portatori di tumori GH-secernenti con rosiglitazone (120mg/Kg die) si osserva una riduzione significativa della concentrazione sierica di IGF-I. In conclusione, i dati riportati suggeriscono che i TZDs
potenzialmente possono regolare l’espressione di GH nell’ipofisi e di IGF-I nel fegato con un meccanismo tessuto-specifico; tuttavia, sono necessari ulteriori studi per chiarire il loro ruolo nel trattamento dell’acromegalia.
ABSTRACT
Acromegaly is characterized by excessive growth hormone (GH) secretion due to the presence of pituitary adenomas, with the consequent elevated increase of insulin-like growth factor (IGF)-I synthesis. The peroxisome proliferators- activated receptor gamma is a nuclear transcription factor belonging to the steroid and thyroid receptor superfamily. PPARgamma is expressed in the GH- secreting pituitary adenomas, in the rat GH-secreting (GH3) cell line and to a lesser extent, in the liver. The thiazolidinediones (TZDs), synthetic ligands of PPARgamma, have been proposed as new drugs in the treatment of pituitary adenomas. In the liver, GH stimulates IGF-I production activating STAT5b. The aim of the research plan has been that to evaluate the role of PPARgamma and its ligands in regulating the expression of GH or IGF-I either in vitro using specific cell lines (GH3 and HepG2 cells, respectively), or in vivo with a mice model of acromegaly. The results demonstrate that, in GH3 cells, TZDs inhibit the synthesis and secretion of growth hormone, through a PPARgamma-
dependent mechanism involving the 5' flanking region of the GH gene (hGH).
PPARgamma, as heterodimeric complex with retinoic 9-cis receptor
(RXRalpha), binds to the hGH promoter in correspondence of the 54 base pairs (bp) nucleotidic sequence between position -330 and -276, indicating the
presence of a putative peroxisome-proliferator responsive element (PPRE).
Using HepG2 cells, TZDs inhibit the expression of IGF-I by a PPARgamma- dependent mechanism;however, in transient transfection experiments with the 5’flanking region of IGF-I gene, PPARgamma ligands did not modify the degree of the reporter gene, suggesting an indirect effect. In addition, GH treatment, as expected, enhanced STAT5b expression at variance with TZDs, which reduced the degree of STAT5b. Thus, it is likely that GH and PPARgamma ligands action in regulating the expression of IGF-I are mediated, at molecular level, by STAT5b. On the other hand, a test experiment using transgenic mice
overexpressing bovine GH,demostrate that long-term treatment with TZDs (1 mg/Kg die) do not change circulating IGF-I level. At variance, treating Wistar-Furth rats bearing transplantable mammosomatotrophic pituitary tumors with TZDs (120 mg/Kg die), serum IGF-I concentration is significantly
decreased. In conclusion, the reported data suggest that TZDs may regulate either the expression of GH in the pituitary or IGF-I in the liver levels with a tissue-specific mechanism; nevertheless, to clarify the role of TZDs in the treatment of the acromegaly further studies are needed.
1. INTRODUZIONE
1.1 Acromegalia
L’Acromegalia è una sindrome endocrina cronica caratterizzata da eccessiva secrezione di ormone della crescita (GH), con il conseguente elevato aumento della sintesi epatica del fattore di crescita insulino-simile di tipo I (IGF-I o somatomedina c) (Jones e Clemmons 1995; Giustina et al 2000). I tipici segni clinici della malattia acromegalica sono l’accrescimento delle estremità (mani, piedi, naso, mandibola, con accentuato prognatismo e diastasi interdentaria). I soggetti affetti lamentano astenia, iperidrosi, cefalea, disturbi della libido e della vista, alterazioni mestruali sino all’amenorrea, ingrossamento del tessuto
nasofaringeo con conseguente apnea ostruttiva. La cute è ispessita, seborroica e sudata con comparsa di cisti sebacee. Si verifica una generale ipertrofia dei visceri e degli organi (visceromegalia) tra cui si osserva la tipica macroglossia.
(Nabarro 1987). L’acromegalia è una malattia rara con una prevalenza stimata di circa sessanta casi per milione e un’incidenza annuale di circa 3-4 casi per
milione (Holdaway e Rajasoorya 1999 ), tuttavia a causa della sua natura indolente e insidiosa è diagnosticata dopo diversi anni ed è associata a una significativa mortalità, cui incidono principalmente lo sviluppo di artropatia e cardiomiopatia, ma anche la presenza di tumori del colon (Lamberts et al. 1995;
Orme et al. 1998; Scacchi e Cavagnini 2006). E’ stato infatti osservato che esiste una correlazione tra il livello elevato di GH e IGF-I circolante e sviluppo di
poliposi del colon ( Jenkins et al. 2000; Webb et al. 2002), anche se non tutti gli studi riportati sono concordi (Renehan et al. 2000). L’ipersecrezione di GH è causata quasi esclusivamente dalla presenza di adenomi ipofisari GH-secernenti (GH-omi)(Melmed 1990). Nel 40% dei GH-omi sono state individuate
mutazioni puntiformi dell’oncogene gsp che codifica per la subunità alfa della proteina G stimolatoria. La proteina G mutata, mimando l’effetto induttivo del GHRH, stimola costitutivamente l’enzima adenilato ciclasi, con il conseguente aumento di AMP ciclico, ipersecrezione di GH e sviluppo del tumore (Drange e Melmed 1999). L’adenomectomia costituisce l’intervento terapeutico di
elezione, seguito, se non risolutivo, da radioterapia in concorso con trattamento farmacologico. Tuttavia, è stato osservato che, in diversi casi, la secrezione di GH rimane incontrollata e la malattia attiva persiste ( Kreutzer et al. 2001).
1.2 Isoforma gamma del recettore attivato dai proliferatori dei perossisomi (PPARgamma)
L’ isoforma gamma del recettore attivato dai proliferatori dei perossisomi (PPARgamma), è un fattore di trascrizione nucleare appartenente alla
superfamiglia dei recettori steroidei e tiroidei. E’ altamente espresso nel tessuto adiposo dove svolge un ruolo importante nella differenziazione cellulare e nella regolazione del metabolismo lipidico, favorendo l’accumulo degli acidi grassi negli adipociti maturi e riducendone la concentrazione plasmatica. Nel fegato, il
livello di espressione di mRNA di PPARgamma è ridotto ( 30% rispetto al livello del tessuto adiposo); tuttavia la sua attivazione induce l’aumento della captazione degli acidi grassi e diminuisce la gluconeogenesi, riducendo la produzione di glucosio (Ferrè 2004). Recentemente, è stato dimostrato che PPAR-gamma è espresso nell’ipofisi normale (Bogazzi et al 2005) negli adenomi ipofisari GH-secernenti, e nella linea cellulare ipofisaria GH-
secernente di ratto GH3 (Heaney et al 2003), mentre il suo livello è ridotto nella mucosa del colon di soggetti con acromegalia attiva (Bogazzi et al.2002).
I tiazolidinedioni (TZDs) rosiglitazone (ros) e ciglitazone (cig) appartengono alla classe dei ligandi sintetici agonisti di PPARgamma (fig.1) Il rosiglitazone, costituisce il principio attivo di un farmaco (Avandia) impiegato nel trattamento del diabete tipo II, ed è efficace nel ridurre l’iperglicemia e nell’aumentare la sensibilità all’insulina Sebbene ros e cig abbiano caratteristiche differenti (ros possiede un’affinità di legame per PPARgamma maggiore rispetto a cig) hanno tuttavia effetti simili sul metabolismo glucidico e lipidico (Day 1999). Studi in vitro hanno evidenziato che i TZDs inducono l’espressione delle proteine GLUT1 e GLUT4 adibite al trasporto del glucosio all’interno delle cellule muscolari (Ciraldi et al. 1995; Wang 1997). Altre ricerche hanno riscontrato che il trattamento con i TZDs aumenta l’espressione e la secrezione di adiponectina, una proteina che migliora la sensibilità all’insulina incrementando l’ossidazione degli acidi grassi nel muscolo, sia nell’uomo che in modelli animali ( Yu et al.
2002). Negli ultimi anni è emerso che i TZDs possiedono anche proprietà
antiproliferative nei confronti di diverse linee cellulari tumorali bloccando il ciclo cellulare attraverso l’induzione degli inibitori proteici p21 e p27 o l’inibizione dell’espressione della ciclina D1 ( Qin et al 2003). Tali effetti possono anche esercitarsi indipendentemente dall’attivazione di PPARgamma, per interazione diretta con i mitocondri, riducendone la funzionalità (Feinstein et al. 2005). Studi in vitro impiegando linee cellulari tumorali di colon hanno dimostrato che i TZDs, attivando PPARgamma, contrastano l’azione
antiapoptotica di GH, inducendo l’espressione della proteina proapoptotica Bax (Bogazzi et al. 2004). Recentemente, è stato proposto che i TZDs possano essere utilizzati nel trattamento degli adenomi ipofisari GH secernenti. Infatti è stato osservato che, somministrando il rosiglitazone a topi nudi inoculati con GH3, si riduce lo sviluppo tumorale e la concentrazione di GH nel siero (Heaney 2003).
1.2.1 PPAR gamma: gene e proteina
Il gene di PPARgamma umano si estende per più di 100 Kb, contiene tre
promotori e codifica per tre mRNA che, in seguito a splicing alternativo, danno origine a tre isoforme proteiche tessuto-specifiche, differenti nella loro estremità amino-terminale: PPAR γ1, costituito da 477 aminoacidi (aa), è ubiquitario;
PPAR γ2, costituito da 505 aa, è espresso maggiormente nel tessuto adiposo mentre PPAR γ3, di 477 aa, è abbondante nei macrofagi e nell’intestino (fig.2A)
(Fajas et al.1997) La struttura proteica di PPARgamma è costituita dal dominio A/B amino-terminale, dal dominio C o DNA binding domain (DBD) adibito al legame con il gene bersaglio, da una regione “cerniera” centrale (hinge region o dominio D), dal dominio E o ligand binding domain, (LBD), sito di interazione con i ligandi naturali o sintetici, e dal dominio F carbossi-terminale (fig.2B).
Il dominio A/B amino-terminale contiene una regione di regolazione ligando- indipendente (activation function 1 domain, AF-1), che svolge un ruolo
importante durante la fosforilazione di PPARgamma. Il dominio C è formato da due motivi “a dita con zinco” con sei cisteine altamente conservate, capaci di riconoscere una sequenza specifica di DNA denominata “elemento di risposta a PPAR” (PPRE) (Desvergne 1999; Blanquart et al 2003).
La struttura terziaria di LBD è formata dal ripiegamento di 12 alfa-eliche ( H1- H12) e 4 piccoli filamenti a “foglietto” beta. All’interno di LBD, la 12° alfa- elica (H12) denominata anche “activation function 2 domain (AF-2)” ha un ruolo essenziale nella regolazione della trascrizione mediata da PPARgamma..
Le eliche H3, H7 e H10 delimitano i lati della larga cavità idrofobica centrale che costituisce il sito di legame con il proprio ligando. L’interfaccia asimmetrica di eterodimerizzazione tra PPARgamma e il recettore dell’acido retinoico 9-cis RXRalfa comprende una fitta rete di interazioni polari e idrofobiche che
coinvolgono i residui delle eliche H7, H8, H9 e, in larga misura, i residui
complementari dell’elica H10 di entrambi i recettori ( Nolte et al. 1998; Gampe et al. 2000).
1.2.2 Regolazione della trascrizione genica
I recettori nucleari interagiscono con diverse proteine coregolatrici nel
meccanismo di stimolazione della trascrizione genica. In assenza di ligando, i recettori nucleari sono associati a corepressori proteici (PPARgamma prende contatto con SMRT o N-CoR) con attività di deacetilazione che blocca la trascrizione (Robyr et al 2000). La presenza del ligando induce la dissociazione del corepressore e il reclutamento di un coattivatore proteico (PPARgamma si lega a SRC-1 così come ad altri coattivatori), con attività acetil-trasferasica che induce l’acetilazione delle proteine istoniche e la “de-compattazione” della cromatina permettendo ai recettori nucleari di regolare la trascrizione (Chen e Evans 1995).
1.2.3 Regolazione della trascrizione genica da parte di PPARgamma
In assenza di ligando, il corepressore N-CoR o SMRT forma un complesso proteico con LBD dell’eterodimero di PPARgamma-RXRalfa tramite la propria sequenza aminoacidica LXXXIXXXL/I ( dove le lettere L, I e X indicano, rispettivamente, i residui leucina, isoleucina e un qualsiasi aminoacido). Questa sequenza peptidica, altamente conservata, presenta una struttura secondaria a tripla “elica-curva-elica” e costituisce un ingombro sterico per l’elica AF-2 di
PPARgamma. L’elica AF-2, per consentire l’alloggiamento del corepressore, deve assumere una posizione poco compatta e instabile, non adatta al
reclutamento dei coattivatori. La regolazione della trascrizione genica mediata da PPARgamma si realizza quando uno dei suoi specifici ligandi si posiziona nella larga cavità di legame dentro il nucleo di LBD formando legami a
idrogeno direttamente con i residui polari delle eliche H3, H5, H10 e AF-2 Tali legami favoriscono l’interazione intramolecolare tra i residui idrofobici delle eliche H3, H5 e H10 e gli aminoacidi L468, L469 e I472 dell’elica AF-2 di PPARgamma. L’elica AF-2 assume così una conformazione più compatta e stabilizzata verso il nucleo di LBD, che risulta consolidata dall’asimmetria dell’
eterodimero, aumentando la superficie di interazione. L’elica AF-2 può così dissociarsi dal corepressore e legarsi alla sequenza aminoacidica altamente conservata del coattivatore, LXXXL, in un legame rafforzato dal “blocco di carica” di segno opposto per la presenza dell’acido glutammico (E471) con carica negativa nell’elica AF-2 e della lisina con carica positiva (K 301)
nell’elica 3 del recettore. Il complesso tra l’eterodimero PPARgamma-RXRalfa e il coattivatore può così prendere contatto con il promotore del gene-bersaglio riconoscendo una sequenza nucleotidica specifica denominata “elemento di risposta a PPAR” (PPRE) (fig.3) (Nolte et al. 1998; Gampe et al. 2000; Li et al.
2003).
1.2.4 Elemento di risposta a PPAR (PPRE)
I recettori attivati dai proliferatori dei perossisomi riconoscono sul DNA due copie di esameri specifici, ripetuti con la stessa orientazione (direct repeat) e separati da un unico nucleotide, denominati “ elemento di risposta a PPAR”
(PPRE o DR1) (Glass 1994) (fig.3).
L’analisi dei geni regolati dalle diverse isoforme di PPAR ha permesso di identificare la sequenza nucleotidica di base o “consensus motif”
(5’CAAAACT/AGGNCA/A/AGGTCA-3’) che caratterizza il PPRE. Esso è composto da un esteso emisito in posizione 5’, da un nucleo centrale imperfetto ( la lettera N indica una base relativamente variabile), dal nucleotide adenina come elemento separatore e dal conservato esamero in posizione 3’. La sequenza che fiancheggia l’emisito in posizione 5’ determina la polarità di legame tra il recettore, in forma di eterodimero, e il PPRE.
PPAR, tramite la regione carbossi-terminale del secondo “zinc finger” del suo DBD (Hsu et al. 1998), interagisce con l’esamero a monte del “consensus motif”
mentre RXR prende contatto con l’esamero in posizione 3’( Ijpenberg et al.
1997) (fig.3). E’ stato osservato che la maggior forza di legame dei PPRE con i recettori si basa sulla più alta corrispondenza nucleotidica tra l’emisito in posizione 5’ e il “consensus motif”( Juge-Aubry et al. 1997). Studi funzionali hanno portato alla scoperta di numerosi PPRE “positivi”, legandosi ai quali PPARgamma stimola l’attivazione della trascrizione, sopratutto all’interno dei
promotori dei geni implicati nel metabolismo lipidico (Martin et al. 1997; Juge- Aubry et al. 1997; Iwaki et al. 2003). Più controverso risulta invece il
meccanismo di inibizione trascrizionale mediato da PPARgamma. Si ritiene che esso si verifichi in particolare nella risposta anti-infiammatoria, attraverso la riduzione dell’attività di diversi fattori di trascrizione come NF-kB , SP-1 o AP- 1, in un processo regolatorio denominato “trans-repressione ligando-
dipendente”, che non implica il diretto contatto tra PPARgamma e il suo promotore bersaglio (Tan et al.2005).
1.3 Ormone della crescita (GH)
L’ormone della crescita (GH) è un polipeptide di 191 aminoacidi sintetizzato e secreto dalle cellule somatotrope dell’ipofisi anteriore.
Esercita i suoi effetti biologici su molteplici organi, promuovendo lo sviluppo postnatale e regolando il metabolismo lipidico, glucidico e proteico (Argetsinger e Carter-Su 1996). Il GH agisce legandosi al dominio extracellulare del proprio recettore transmembrana, il quale dimerizza e trasduce il segnale ormonale all’interno delle cellule (Cunningham et al.1991)(fig.4).
1.3.1Struttura, espressione e regolazione del gene di GH
Il gene del GH umano (hGH) è costituito da 2657 nucleotidi ed è localizzato nel braccio lungo del cromosoma 17( 17q22-24). Appartiene a un gruppo (cluster) di 5 geni , il cui locus si estende per 66,5 Kb, con omologia maggiore del 92%
(Kopchick e Andry 2000).
hGH, è formato da 5 esoni e 4 introni e codifica per una proteina di 22 kDa, la più abbondante nel plasma. Il trascritto primario, in seguito a splicing alternativo con sito accettore all’interno dell’esone 3, codifica anche per un’isoforma
di 20-kDa costituita da 176 aminoacidi, equivalente al 5-10% del GH monomerico dell’ipofisi (Estes et al. 1992; Palmetshofer et al. 1995).
Nella 5’-flanking region prossimale e nel promotore del gene del GH umano sono stati individuati numerosi elementi di sequenza cis/trans che legano fattori proteici ubiquitari o tessuto-specifici, regolando la trascrizione sia in senso positivo che negativo ( Peritz et al. 1988).
PIT-1( denominato anche GHF-1), il primo fattore proteico ipofisario
identificato, tramite il proprio DNA-binding domain, si lega a due siti altamente conservati, ricchi delle basi adenina e timina, localizzati tra la posizione –87 e -72 (sito di binding prossimale) e tra la posizione -127 e -107 (sito di binding distale) del promotore di hGH. E’ stato osservato che il legame ad alta affinità di PIT-1 al sito di binding prossimale, in sinergia con la proteina “a dita con zinco”
(zinc finger) Zn-15 (Lipkin et al. 1993) è essenziale per l’ottimale espressione
del GH in vitro (Lefevre et al. 1987)) mentre sono necessari altri tre siti di binding localizzati nella regione di controllo del locus genico (LCR), 14,5 Kb a monte del promotore di hGH, affinchè il GH sia espresso, con alta specificità, nell’ipofisi in vivo (Shewchuk et al. 2002, Ho et al 2004). Esperimenti di interazione proteina–DNA e studi funzionali in cellule tumorali della cervice uterina umana (HeLa) e dell’ipofisi di ratto GH-secernenti (GC) hanno dimostrato che anche il Fattore Nucleare 1 (NF-I), un peptide richiesto per l’efficace replicazione degli adenovirus e la proteina attivante 2 (AP-2) possono formare un complesso, in modo mutualmente esclusivo, con l’elemento di sequenza situato tra la posizione -289 e -267 del promotore di hGH, attivando la trascrizione del gene ( Courtois et al. 1990).
Impiegando la tecnica di biologia molecolare denominata “impronta mediante DNAsi-I” (DNase I footprinting), Lemaigre e collaboratori hanno identificato una sequenza ricca delle basi guanina e citosina (GC box) tra la posizione -136 e -127 del promotore di hGH, a cui si associa il fattore di trascrizione Sp1,
originariamente isolato e purificato durante gli studi sulla trascrizione in vitro del promotore del virus SV40 ( Lemaigre et al. 1989). Sono stati inoltre caratterizzati altri elementi di sequenza che partecipano alla regolazione della trascrizione di hGH mediata da ormoni. I primi risultati sono stati ottenuti già a partire dal 1986, quando esperimenti di binding competitivo hanno permesso di scoprire una sequenza nucleotidica tra la posizione -290 e -129 della 5’flanking region di hGH, riconosciuta come bersaglio dai recettori tiroidei (TR) estratti
dalla linea cellulare di linfoblasti umani IM-9.( Barlow et al. 1986). All’interno di questa sequenza nucleotidica, tramite analisi di delezione, è stato circoscritto un elemento di risposta agli ormoni tiroidei negativo (nTRE), mediante il quale la triiodotironina(T3) inibisce la trascrizione di hGH ( Morin et al. 1990).
L’effetto inibitorio del complesso TR-T3, probabilmente conseguenza di ingombro sterico su fattori di regolazione positivi (Sp1) o di cambiamento conformazionale del DNA è rafforzato dalla presenza di un secondo nTRE nella regione non tradotta del gene del GH (3’-UT/FR) (Zhang et al 1992).
1.4 Fattore di crescita insulino-simile di tipo I (IGF-I)
Il fattore di crescita insulino-simile di tipo I (IGF-I o somatomedina c) è una proteina di 70 aminoacidi con peso molecolare di 7,6 KDa, che esercita un ruolo importante nella regolazione della crescita somatica prenatale ( Woods et al.
1996) e post-natale ( Liu e Le Roith 1999), nella differenziazione tessutale e nel metabolismo intermedio (Jones e Clemmons 1995).
IGF-I è costituito da una catena polipeptidica con struttura secondaria ad alfa- elica e foglietto beta, stabilizzata da tre ponti disolfuro, nella quale si possono distinguere quattro sequenze specifiche: il dominio B amino-terminale di 29 aminoacidi; la regione C, di 12 aminoacidi, responsabile del legame ad alta affinità di IGF-I con il proprio recettore di membrana (IGFR), il dominio A di
21 aminoacidi e la regione D carbossi-terminale di 8 residui ( Vajdos et al.
2001). La maggior parte dell’IGF-I circolante è secreto dal fegato, sotto lo stimolo del GH. L’IGF-I è trasportato nel plasma in un complesso ternario di circa 150 kDa con la proteina di binding di tipo 3 (IGFBP3) e con la subunità acido labile. Tale complesso proteico favorisce l’allungamento dell’emivita e aumenta la distribuzione di IGF-I sulla superficie cellulare, agevolando
l’interazione con IGFR (Lewin et al. 1994).Per determinare il ruolo dell’IGF-I prodotto dal fegato sono stati impiegati modelli murini transgenici. Alterando il gene di IGF-I mediante delezione completa dell’esone 4 si osserva, negli
epatociti murini, una forte diminuzione dell’mRNA di IGF-I (> 95%) e una notevole riduzione del livello di IGF-I nel siero (> 80%), mentre non si
verificano variazioni nel tessuto adiposo, nel muscolo, nell’osso, nel cervello e nel cuore, dimostrando che la principale fonte di IGF-I circolante è il fegato (Sjogren et al.1999). E’ stato rilevato che alla diminuzione di IGF-I circolante di origine epatica si associa un incremento del livello sierico di GH ( Yakar et al.
1999), indicando che l’IGF-I epatico ha un ruolo importante nel meccanismo di regolazione a feedback negativo della secrezione di GH a livello ipofisario ( Wallenius et al. 2001).I topi con deficit di IGF-I epatico presentano un normale accrescimento scheletrico degli arti fino a 12 mesi di vita mentre la crescita dello scheletro del tronco risulta fortemente ridotta ( Sjogren et al. 2002). Dal punto di vista metabolico, i topi transgenici con delezione fegato-specifica del gene di IGF-I presentano un’elevata iperinsulinemia insieme a normale
glicemia, in accordo con una resistenza all’insulina adeguatamente compensata e una riduzione del contenuto di grasso in rapporto all’età rispetto agli animali wild-type ( Yakar et al. 2001; Sjogren et al. 2001).Liao e collaboratori, inducendo in un modello murino transgenico una sovraespressione fegato- specifica di IGF-I, hanno osservato un significativo aumento di IGF-I nel
plasma, accompagnato da incremento del peso corporeo e da allungamento delle ossa ( Liao et al. 2006). E’ stato provato che esiste una correlazione tra il livello di GH e la concentrazione di IGF-I circolante: nella maggioranza dei casi in cui il livello di GH è basso anche IGF-I è ridotto; quando il livello di GH circolante aumenta, come si osserva nel gigantismo o nell’acromegalia, anche la
concentrazione di IGF-I cresce, riflettendo l’incremento della secrezione di GH ipofisario e poi raggiunge il plateau quando il livello medio di GH delle 24 ore supera i 20 ug /l (Bates et al. 1995).D’altra parte, alcuni studi hanno dimostrato che, trattando i pazienti acromegalici con analoghi della somatostatina, con un antagonista del recettore del GH (pegvisomant) o intervenendo chirurgicamente con successo, si verifica la normalizzazione del livello di IGF-I circolante (Lamberts et al. 1988; Roelfsema et al. 1987; van der Lely et al 2001).La concentrazione di IGF-I circolante è utile per la diagnosi dell’acromegalia dal momento che non è fluttuante e risulta generalmente elevata anche in pazienti con malattia attiva che hanno valori di GH sovrapponibili agli intervalli normali e dopo il test di tolleranza al glucosio(OGTT)(Dimaraki et al. 2002).Inoltre è emerso che anche durante il monitoraggio dei pazienti dopo intervento
chirurgico o trattamento farmacologico è opportuno misurare, in modo comparato, oltre al livello medio di GH nel siero anche la concentrazione circolante di IGF-I( Kaltsas et al. 2001). A livello, trascrizionale, nel fegato, il GH induce la produzione di IGF-I attraverso l’attivazione di una proteina
coinvolta nella regolazione della trasduzione del segnale all’interno della cellula epatica denominata STAT5b (Teglund et al. 1998) (fig.4). che interagisce con il DNA del gene di IGF-I. E’ stato osservato che in topi knock-out per STAT5b, l’espressione dell’mRNA di IGF-I epatico era ridotta del 50%; similmente, la concentrazione di IGF-I nel siero era più bassa del 30% rispetto ai topi wild-type (Davey et al. 2001). Recentemente, l’analisi di un’ampia regione cromosomica contenente il gene di IGF-I umano ha portato all’identificazione di una sequenza distale della 5’flanking region di 700 bp in cui sono presenti due elementi di risposta a STAT, che mediano l’attivazione dell’espressione del gene di IGF-I, indotta dal GH ( Wang e Jiang 2005).
1.4.1 Struttura, espressione e regolazione del gene di IGF-I
Il gene di IGF-I (hIGF-I) si estende per 45 Kb ed è costituito da 5 esoni e 4 introni. I primi tre esoni contengono i nucleotidi codificanti per la regione non tradotta in posizione 5’ (5’-UTR), per il peptide segnale e i domini A, B, C e D del peptide maturo. Lo splicing alternativo tra l’esone 4 e 5 produce nel fegato umano due principali RNA messaggeri che codificano per i peptidi precursori
IGF-IA, di 153 aminoacidi e IGF-IB, di 195 residui, differenti nella regione carbossi-terminale (peptide E) ( Rotwein 1991). Il taglio del peptide E origina la forma di IGF-I secreta e funzionalmente attiva (Duguay et al. 1995). Nei
mammiferi, la trascrizione del gene di IGF-I è controllata da due promotori, denominati P1 e P2, localizzati rispettivamente nell’esone 1 e 2. Nel promotore P1 umano è stato identificato un segmento nucleotidico di 158 paia di basi (bp) contenente diversi siti di inizio di trascrizione con struttura eterogenea senza la presenza a monte di specifiche sequenze consenso (TATA-box ) (Kim et al.
1991). La regione non tradotta in 5’ (5’UTR) di hIGF-I, altamente conservata tra le specie, ha un ruolo essenziale nella regolazione dell’attività trascrizionale di P1 ( Mittanck et al. 1997). Essa contiene numerosi siti di binding riconosciuti da differenti fattori di trascrizione come il fattore epatico nucleare 1 alfa (HNF- 1alfa, la proteina C/EBP e l’elemento GATA (Nolten et al. 1995).E’ stato osservato che la regione 5’UTR ha un ruolo importante nell’induzione della trascrizione di hIGF-I nei macrofagi. Al contrario, la 5’ flanking region dell’esone 1 contiene elementi che riducono l’attività di P1 come è stato
dimostrato anche in diverse linee cellulari (Wynes e Riches 2005). Nell’uomo, P1, il promotore maggiore, è attivo in tutti i tessuti che esprimono IGF-I ed è responsabile del 65% della trascrizione del gene di IGF-I che avviene nel fegato (Adamo 1995).
1.5 Modello murino di acromegalia
Già da molti anni la comunità scientifica dispone di animali utili per studiare gli effetti della sovraespressione dell’ormone della crescita, come modelli che riproducono le caratteristiche della malattia acromegalica, i più impiegati dei quali sono topi transgenici per il GH bovino e ratti portatori di tumori GH- secernenti. Nel 1982 è stato creato il primo topo transgenico per l’ormone della crescita inserendo il gene del GH di ratto (rGH), la cui espressione è regolata dal promotore della metallotioneina I (MT-I), nel pronucleo maschile di uova
fecondate, a loro volta reimpiantate in femmine pseudogravide, rese tali
mediante accoppiamento con maschi sterilizzati da vasectomia. Il transgene di ratto risulta integrato stabilmente nel genoma del 30% dei topi, sia nelle cellule somatiche sia nelle cellule germinali ed è trasmesso secondo le leggi di Mendel.
Dopo circa tre settimane dalla nascita l’accrescimento dei topi transgenici aumenta nettamente rispetto agli animali wild-type, indicando che il gene
chimerico introdotto è funzionale (Palmiter et al. 1982). Successivamente, con la stessa tecnica di microiniezione pronucleare, è stato inserito nel DNA
cromosomico murino il gene eterologo del GH umano (MThGH)( Palmiter et al.1983) e del GH bovino (MTbGH)( Hammer et al 1985). Il peso corporeo dei topi della linea MTbGH è circa 1,5-2 volte maggiore rispetto agli animali non transgenici dopo 14 settimane di vita e il livello sierico medio del GH è
0,58±0,03 ug/ml, circa 10 volte maggiore rispetto al valore normale (fig.5).
L’accrescimento dei topi transgenici risulta più accelerato rispetto agli animali wild-type solo a partire dalla seconda settimana di vita. L’assenza di risposta all’ormone della crescita subito dopo la nascita, non è dovuta a insufficiente produzione di GH, dal momento che il promotore di MT-I che controlla l’espressione di bGH è attivato anche durante lo sviluppo fetale, ma
probabilmente rispecchia il livello di IGF-I. Infatti l’espressione dell’mRNA epatico di IGF-I nei topi transgenici neonati è bassa e paragonabile ai topi normali, mentre risulta significativamente più elevata a cominciare dalla
seconda settimana di vita, raggiungendo il valore massimo alla terza settimana e mantenendosi stabile successivamente. Allo stesso tempo, il livello sierico di IGF-I nei topi transgenici aumenta sotto lo stimolo del GH solo dopo la seconda settimana dalla nascita, periodo nel quale è significativamente più elevato
rispetto agli animali normali, raggiungendo il valore massimo alla quarta settimana, maggiore di 1,5-2 volte rispetto ai topi wild-type (Mathews et al.
1988). E’ stato osservato che, a 14 settimane dalla nascita, i topi della linea MTbGH presentano una significativa splancnomegalia. Il peso dei reni è circa il doppio del normale, con un incremento della parte glomerulare che si presenta alterata da pronunciata sclerosi. Il peso del fegato è circa 1,5-3 volte maggiore rispetto ai controlli per la presenza di iperplasia e ipertrofia cellulare. L’analisi citofluorimetrica dei nuclei indica che il 5% degli epatociti ha un contenuto di DNA otto volte più grande rispetto al valore normale. Nel siero, la
concentrazione di proteine totali, di albumina e globulina rientra nei normali
intervalli di riferimento, dimostrando che la funzione epatocellulare non è alterata (Quaife et al. 1989), anche se, nel fegato, l’espressione di alcuni geni codificanti per enzimi implicati nella beta-ossidazione degli acidi grassi e nella produzione di corpi chetonici, è ridotta (Olsson et al. 2003). I topi transgenici per bGH sono iperinsulinemici, ma presentano normali o lievemente ridotti valori di glicemia, indicando la presenza di insulino-resistenza, in conformità con una delle caratteristiche dell’acromegalia (Quaife et al. 1989; Frick et al.
2001). Recentemente, è stato dimostrato che i topi che sovraesprimono il GH nel sistema nervoso centrale sono iperfagici, obesi, iperinsulinemici con marcata iperplasia delle isole di Langerhans e contemporaneamente presentano
alterazioni del metabolismo lipidico, suggerendo che il GH può avere un effetto duale a livello centrale stimolando l’assorbimento di cibo e a livello periferico incrementando la lipolisi ( Bohlooly-Y et al. 2005). Tuttavia, malgrado
l’incremento della lipolisi, il livello circolante degli acidi grassi liberi (FFA) e dei trigliceridi è ridotto nei topi della linea MTbGH, contrariamente alla condizione che si verifica nei pazienti acromegalici, probabilmente perchè aumenta il loro assorbimento nel cuore e nel tessuto muscolare (Frick et al.
2001). E’ stato osservato che nei topi transgenici bGH, si verificano alterazioni morfologiche e funzionali a livello cardiaco che influenzano il bilancio
energetico, in sintonia con la condizione acromegalica umana (Melmed 2006):
ipertrofia del cuore per l’ aumento del diametro fibrillare (Fu et al. 2000), in particolare del ventricolo sinistro, proliferazione dei mitocondri, riduzione della
funzione sistolica e riduzione del rapporto creatina-fosfato/ATP (Bollano et al.
2000). Il livello di GH circolante nei ratti Wistar-Furth che sviluppano tumori ormono-secernenti comincia ad aumentare dopo circa due settimane dall’inoculo sottocutaneo di cellule tumorali GH e prolattina (PRL)-secernenti (GH3) e dopo nove settimane raggiunge valori anche duecento volte superiori a quelli dei controlli (Yamashita et al. 1986). Dopo sei settimane il livello sierico di IGF-I è circa due-tre volte maggiore rispetto a quello misurato negli animali che non sviluppano tumori, in seguito all’aumentata espressione dell’mRNA di IGF-I epatico. In questi animali si osserva anche un incremento dell’espressione dell’mRNA dell’IGF-I ipofisario che sembra essere dipendente dalla concentrazione dell’ormone della crescita circolante, dal momento che l’espressione del GH ipofisario risulta inibita (Fagin et al. 1988). Il livello di prolattina circolante è otto volte superiore al normale, mentre l’estradiolo plasmatico è significativamente più basso rispetto a quello dei ratti di controllo costituendo un modello di acromegalia con disfunzione gonadica dovuta a iperprolattinemia (Morimoto et al. 2000). La differenza di peso corporeo rispetto ai controlli comincia ad essere evidente dopo 5 settimane dall’inoculo delle GH3 (Yamashita et al. 1986) così come è possibile osservare un’accentuata organomegalia; il peso del cuore aumenta del 40% circa, sebbene la sua
contrattilità si riduce per la diminuita attività ATPasica del ventricolo sinistro (Rubin et al. 1990); le miofibrille del muscolo scheletrico risultano ipertrofiche con un aumentato contenuto di DNA ( McCusker e Campion 1986), mentre il
diametro e il volume medio degli adipociti si riducono (McCusker et al.1986).
L’artropatia è la causa più frequente di morbilità e inabilità nella sindrome acromegalica. Il livello di IGF-I circolante influenza il metabolismo degli osteoblasti, aumentando l’apposizione e il riassorbimento osseo e la densità ossea corticale, indipendentemente dalla funzione gonadica, mentre
l’ipogonadismo sembra contrastare l’effetto anabolico del GH sull’osso trabecolare (Lesse et al. 1998; Chiodini et al. 2001). Sjogren e collaboratori, studiando l’effetto a lungo termine dell’inattivazione fegato-specifica di IGF-I in topi transgenici adulti, hanno osservato che l’accrescimento scheletrico assiale e la quantità di osso corticale sono ridotti, mentre non varia la crescita dello scheletro appendicolare (Sjogren et al. 2002). Studi recenti hanno valutato il ruolo di PPARgamma e dei TZDs nella regolazione del metabolismo osseo: nei topi, il rosiglitazone riduce la densità minerale ossea (BMD) alterando la
differenziazione degli osteoblasti (Ali et al. 2005); in topi mancanti di un allele del gene di PPARgamma si osserva un volume elevato di osso trabecolare, assenza di midollo osseo giallo e protezione contro la perdita ossea in relazione all’età (Akune et al. 2004). L’individuazione nel cromosoma 6 murino di un locus per la determinazione di un carattere quantitativo (quantitative trait locus QTL) per IGF-I sierico e BMD in vicinanza del gene di PPARgamma, ha messo in luce la relazione tra attivazione di PPARgamma, regolazione di IGF-I e differenziazione degli osteoblasti (Bouxsein et al. 2004).
2. SCOPO DELLO STUDIO
Considerando la correlazione tra acromegalia e ipersecrezione di IGF-I nel fegato e il rapporto tra espressione di PPARgamma ed effetto antiproliferativo e inibitorio dei TZDs nei tumori ipofisari è stato realizzato un progetto di ricerca allo scopo di:
- dimostrare che i TZDs possono influenzare l’espressione e la secrezione di GH nell’ipofisi e di IGF-I nel fegato.
- dimostrare che PPARgamma media l’effetto dei TZDs sulla regolazione dell’espressione di GH e di IGF-I
- dimostrare che PPARgamma interagisce con il promotore di hGH e hIGF-I - individuare un putativo PPRE nella 5’-flanking region di hGH e hIGF-I - valutare la concentrazione di IGF-I circolante in un modello acromegalico murino dopo trattamento a lungo termine con rosiglitazone
3. MATERIALI E METODI
3.1 Colture cellulari
La linea cellulare ipofisaria GH-secernente di ratto (GH3) è cresciuta nel mezzo di coltura F10, contenente 2 mM di glutamina, antibiotici (Sigma-Aldrich, Milano) e il 10% di siero bovino fetale (FBS) (Invitrogen, Milano).
La linea cellulare di fibroblasti di topo NIH3T3 è cresciuta nel mezzo di coltura Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), contenente 2 mM di glutamina, antibiotici (Sigma-Aldrich, Milano) e il 10% di siero fetale di vitello (FCS) (Invitrogen, Milano).
La linea cellulare di epatocarcinoma umano HepG2 è cresciuta nel mezzo di coltura Minimum Essential Eagle Medium (MEM) contenente 2 mM di
glutamina, 1% di aminoacidi non essenziali, antibiotici (Sigma-Aldrich, Milano) e il 10% di siero bovino fetale (FBS) (Invitrogen, Milano).
Ciascuna linea cellulare è mantenuta a 37°C in atmosfera umida con il 5% di anidride carbonica.
3.2 Animali
I topi transgenici acromegalici (acro) che esprimono la sequenza codificante del gene del GH bovino sotto il controllo del promotore della metallotioneina (MTbGH) (fig.5) sono generosamente forniti dal Dr. M.Bohlooly-Y (Università di Goteborg, Svezia). L’identificazione dei topi acro è ottenuta amplificando, mediante PCR, un frammento di DNA genomico estratto da campione bioptico murino con i seguenti primers localizzati nel promotore di MT e nel gene di bGH, rispettivamente (Fu et al. 2000):
primer senso 5’-GCGAATGGGTTTACGGA-3’;
primer antisenso 5’-CTCCAGGGACTGAGAACA-3’.
I topi wild-type C57Bl/6JxCBA (wt) e i ratti Wistar-Furth di cinque settimane sono forniti da Harlan Italy, Udine. Gli animali sono mantenuti in ambiente controllato con ciclo luce/ buio di 12 ore, umidità relativa di 45-55% e temperatura di 20°C.
3.3 Tiazolidinedioni (TZDs) e GH
I TZDs Ciglitazone (cig) (Alexis Biochemicals, San Diego, USA) e
Rosiglitazone (ros) (Glaxo-Kline-Beecham, Milano) sono risospesi in etanolo alla concentrazione di 1,5 mM e 10 mM, rispettivamente, e poi diluiti alle concentrazioni sperimentali appropriate.
L’inibitore specifico di PPARgamma, GW9662, (Sigma Aldrich, Milano) è risospeso in etanolo e impiegato alla concentrazione sperimentale di 10uM.
Il GH umano (Calbiochem, Milano) è risospeso in acqua alla concentrazione di 9,2 uM e poi diluito alla concentrazione sperimentale di 50 nM.
3.4 Protocollo sperimentale in vitro
Le GH3 sono esposte a mezzo deprivato di siero per 24 ore, e poi trattate in presenza o assenza di cig e ros 1-50 uM fino a 72 h. Le HepG2 sono esposte a mezzo deprivato di siero per 24 ore e poi trattate con cig e ros 1-10uM per 12 ore consecutive, in presenza o assenza di GH 50nM. Le HepG2, alle stesse condizioni di incubazione sopra riportate, ma in mezzo fresco, sono trattate per altri due intervalli successivi di 4 ore ciascuno, per un totale di 20 ore
complessive. In alcuni esperimenti è impiegato anche l’antagonista sintetico specifico per PPARgamma GW9662 alla concentrazione di 10uM. Al termine dell’incubazione il mezzo viene raccolto e conservato per il dosaggio. Questo protocollo sperimentale, che prevede nel complesso tre stimolazioni da parte del GH, è stato adottato perchè si è dimostrato il più idoneo per valutare gli effetti dei TZDs sull’espressione , GH-dipendente, di IGF-I.
3.5 Protocollo sperimentale in vivo
L’esperimento pilota, approvato dal locale Comitato Etico per la
sperimentazione animale dell’Università di Pisa, utilizza complessivamente 20 topi maschi di 12 settimane di età (10 wt e 10 acro) e 10 ratti Wistar-Furth di 5 settimane di età.
n=5 topi acro e n=5 topi wt sono trattati con dieta standard (global diet 2018, Harlan Italy, Udine).n=5 topi acro (acro-ros) e n=5 topi wt (wt-ros) sono trattati per 30 giorni con dieta standard contenente rosiglitazone 12 mg/Kg dieta
(Avandia, GlaxoSmithKline, Milano)(tab.1) Alla fine del trattamento il rosiglitazone assunto giornalmente dagli animali risulta circa 1 mg/Kg peso corporeo. I campioni di sangue all’inizio e alla fine dell’esperimento sono prelevati dalle code degli animali acro e wt. Il siero è separato e conservato. Gli animali alla fine del trattamento sono sacrificati sotto anestesia e gli organi prelevati sono conservati in azoto liquido.
n=10 ratti Wistar-Furth sono inoculati sottocute con 2x106 cellule tumorali GH- secernenti (GH3). Dopo lo sviluppo tumorale (circa due settimane), gli animali sono trattati per 20 giorni con rosiglitazone 120mg/Kg die (n=5) o 40mg/Kg die (n=5), somministrato attraverso una sonda esofagea (tab.2). Alla fine del
trattamento il siero è prelevato e conservato.La concentrazione di IGF-I nel siero è misurata con un kit commerciale, mediante dosaggio
radioimmunologico, come descritto in materiali e metodi.
ID peso medio (g) inizio tratt.
peso medio (g) fine tratt
peso medio (g) fegato
conc. media IGF-I (ng/ml) inizio tratt.
conc. media IGF-I (ng/ml) fine tratt.
wt 23,0 24,5 1,90 476,8 467,7
wt-ros 24,0 27,5 1,55 399,7 425,1
acro 31,5 36,5 2,9 559,4 551,4
acro-ros 32 35,5 2,7 539,2 495,3
TABELLA 1 Confronto tra i valori del peso medio del fegato, del peso medio corporeo e della concentrazione media di IGF-I dei topi impiegati
nell’esperimento pilota descritto in Materiali e metodi.
ID:denominazione identificativa topi wild-type e transgenici. wt: topi wild type;
acro: topi acromegalici; wt-ros: topi wild type trattati con rosiglitazone; acro- ros: topi acromegalici trattati con rosiglitazone.
ID dose rosiglitazone
(mg/Kg die)
conc. IGF-I (ng/ml) inizio tratt.
conc. IGF-I (ng/ml) fine tratt.
WF1-a 120 530,45 357,58
WF2-a 120 538,20 389,51
WF3-a 120 595,63 474,84
WF4-a 120 521,98 357,94
WF5-a 120 550,18 359,44
WF1-b 40 475,58 336,83
WF2-b 40 615,66 538,47
WF3-b 40 583,66 570,44
WF4-b 40 551,66 514,44
WF5-b 40 573,90 551,47
TABELLA 2 Confronto tra i valori medi di IGF-I circolante misurato all’inizio e alla fine del trattamento con rosiglitazone nei ratti Wistar-Furth portatori di tumori GH-secernenti, impiegati nell’esperimento pilota descritto in Materiali e metodi.
ID:denominazione identificativa ratti Wistar-Furth
3.6 Dosaggio di GH e IGF-I
Per ottenere gli estratti cellulari le GH3 sono trattate con lysis buffer (50 mM di Tris-HCl, pH 6,8, 10% glicerolo, 2,5% SDS, 10 mM DTT), centrifugate e il sovranatante sonicato. Il livello di GH nelle GH3 e di IGF-I nelle HepG2 è determinato mediante dosaggio radioimmunologico (Amersham Biosciences, Milano) e normalizzato in base alla concentrazione proteica ( Bio-Rad
Laboratoires, Milano). La concentrazione di IGF-I nel siero murino è misurata con un kit commerciale, mediante dosaggio radioimmunologico (Diagnostic System Laboratoires, Webster, TE, USA).
3.7 Northern Blot
Dalle HepG2 trattate secondo il protocollo sperimentale riportato in Materiali e metodi, viene estratto l’RNA totale per omogenizzazione in solvente TRIZOL (Invitrogen, Milano). L’RNA (30 ug) è denaturato a 65°C per 10 minuti, separato elettroforeticamente su gel di agarosio e formaldeide, trasferito su membrana di nitrocellulosa (Amersham Biosciences), fissato con UV e ibridato per 16h a 42°C con un frammento di 210 bp del cDNA di hIGF-1 marcato con
32P (sonda). La membrana è poi estesamente lavata per eliminare i legami
aspecifici e sottoposta ad autoradiografia per 24 h a -70°C. I primers utilizzati per amplificare la sonda mediante PCR, sono:
esone 2, primer senso: 5’tggaccggagacgctctgcggg3’
esone 3, primer antisenso: 5’agctgacttggcaggcttga3’
Per normalizzare i risultati è utilizzato il cDNA della subunità ribosomiale 18s, amplificato tramite PCR con i seguenti primers:
primer senso 5’tgactcaacacgggaaacctcaac3’
primer antisenso 5’ctgtgatgcccttagatgtccg3’
3.8 Real-Time PCR
1ug di RNA totale ottenuto dalle GH3, NIH3T3 e HepG2 trattate secondo il protocollo sperimentale riportato in Materiali e metodi, è retro-trascritto in 20 ul di soluzione contenente 50 mM Tris HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2 , 10 mM DTT, 200 uM ciascuno dNTP, 10 mM oligo dT primer, 20 U di inibitore di RNAsi, Rnasin (Promega, Milano) e 200 U di enzima trascrittasi inversa M- MLV RT (Promega, Milano), per 1h a 42°C.
5ul di cDNA sono poi amplificati in un volume finale di 25ul contenente PCR buffer 1X ( Taq Man Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems,
Milano), 300 nM di ciascun primer e 200 nM di sonda fluoresceinata per 40 cicli alle seguenti condizioni: fase 1 : 50°C, 2 min; fase 2 :95 °C, 10 min; fase 3:
95°C, 15 sec, 60°C, 1 min. I campioni sono analizzati con ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Milano). I primers e la sonda per hGH sono i seguenti:
primer senso 5’-gctggctgctgacacctaca-3’;
primer antisenso 5’-cctgggcattctgaatggaa-3’;
sonda, 5’-6FAM-agttcgagcgtgcctacattcccga-TAMRA-3’.
I primers e la sonda per hIGF-1 sono i seguenti:
primer senso 5’cttcagttcgtgtgtggagacag3’;
primer antisenso 5’tccgactgctggagccatac3’;
sonda 5’-6FAM-cttttatttcaacaagcccac-TAMRA-3’.
I risultati sono normalizzati amplificando il cDNA dei geni ubiquitari RNA 18s e beta-actina per hGH e hIGF-1, rispettivamente.
3.9 Western Blot
25ug di proteine ottenute dagli estratti totali preparati in 50 mM di Tris-HCl, pH 6,8, 10% glicerolo, 2,5% SDS, 10 mM DTT sono separate su gel al 12% di poliacrilammide-SDS (SDS-PAGE) e trasferite su membrana di nitrocellulosa.
La membrana è saturata O/N a 4°C in soluzione formata per il 50% di TBS ( 200 mM Tris-HCl pH 7,6 e 1,4 M NaCl) e per il 50% di TTBS (TBS, 0,05%
Tween-20), contenente 5% di polvere di latte (Bio-Rad, Milano) a cui è aggiunto
l’anticorpo primario specifico anti-PPARgamma (H100 sc-7196) ( Santa Cruz Biotechnology), diluizione 1:200, anti-IGF-I(G-17 sc-1422) (Santa Cruz Biotechnology), diluizione 1:200 e anti-STAT5b (G-2 sc-1656 ) (Santa Cruz Biotechnology) diluizione 1:200, per 2h a RT. Dopo due lavaggi di 15 minuti con TTBS è aggiunto, per 1h a RT, un appropriato anticorpo secondario coniugato con l’enzima perossidasi di rafano, catalizzatore della reazione di chemiluminescenza (Bio-Rad, Milano) che permette di identificare le proteine di interesse.
3.10 Immunofluorescenza
Circa 300.000 cellule di GH3 e HepG2 per pozzetto sono piastrate in “chamber slides” ( BD Falcon Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) trattate come
descritto in Materiali e Metodi, fissate in 4% paraformaldeide per 10 minuti a RT , esposte a 1% BSA in PBS per 45 minuti al fine di bloccare i siti aspecifici e incubate con anticorpo primario anti-PPARgamma (H100 sc-7196) ( Santa Cruz Biotechnology), diluizione 1:100, anti-IGF-I(G-17 sc-1422) (Santa Cruz
Biotechnology), diluizione 1:100 e anti-STAT5b (G-2 sc-1656 ) (Santa Cruz Biotechnology) diluizione 1:100, per 1h a RT. IGF-I è rivelato con un anticorpo secondario coniugato con fluoresceina verde Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Milano); PPARgamma e STAT5b sono rivelati con un anticorpo secondario
coniugato con fluoresceina rossa Alexa fluor 546 (Molecular Probes, Milano).
La colorazione del nucleo delle GH3 e delle HepG2 è ottenuta con il colorante rosso sytox orange e con il colorante blu 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), rispettivamente.
3.11 Plasmidi
Il plasmide chimerico pACOPPRE è costruito subclonando una copia del PPRE distale dell’enzima Acil-CoA ossidasi di ratto (ACOA) (Dreyer et al. 1992), nel vettore reporter pBLCAT2 (Invitrogen, Milano) a monte del promotore
eterologo della timidina chinasi (TK) che controlla l’espressione del gene reporter codificante l’enzima cloramfenicolo acetil-transferasi (CAT). Il plasmide chimerico pHMG1PPRE è costruito subclonando una copia del PPRE dell’enzima 3-idrossi-3-metil-glutaril-CoA sintasi di ratto (HMG) (Rodriguez et al 1994), nel vettore reporter pGL3promoter (Promega, Milano), a monte del promotore eterologo di “simian virus 40” (SV40) che controlla l’espressione del gene reporter codificante l’enzima luciferasi (LUC). Il plasmide chimerico phGH è costruito subclonando la sequenza nucleotidica tra la posizione -397 e +1 del promotore di hGH, ottenuta per amplificazione mediante PCR da DNA genomico, nel vettore reporter pBLCAT3 (Invitrogen, Milano) privo di
promotore eterologo. Il plasmide chimerico phIGF-1 è costruito subclonando la
sequenza nucleotidica tra la posizione -1621 e +415 della 5’-flanking region di hIGF-I, ottenuta per amplificazione mediante PCR da DNA genomico, nel vettore reporter pGL3 (Promega, Milano), privo di promotore eterologo. I plasmidi di espressione pSG5-PPARgamma, pCMVXL4-PPARgamma1 pSG5- RXRalfa contengono il cDNA dei recettori PPARgamma2, PPARgamma1 e RXRalfa, rispettivamente. Il plasmide di espressione pCMVbeta-gal contiene il cDNA del gene dell’enzima beta-galattosidasi.
3.12 Trasfezioni
Gli esperimenti di trasfezione transitoria sono condotti in piastre da 24 pozzetti mediante la metodica del fosfato di calcio ( Ausubel et al. 1987). Per ogni pozzetto sono trasfettati 0,5 ug di plasmide chimerico, 0,25 ug di plasmide di espressione e 0,1 ug di plasmide pCMVbeta-gal, usato come controllo interno.
Dopo 48 ore di incubazione a 37°C in presenza o assenza di cig o ros 1-10uM, sono preparati gli estratti cellulari in lysis buffer 1X (Promega, Milano) e viene valutata la variazione di espressione del “gene reporter” CAT contenuto in pACOPPRE e phGH, misurando l’attività dell’enzima cloramfenicolo acetil- transferasi (CAT assay) (Gorman et al.1982) e la variazione di espressione del
“gene reporter” LUC contenuto in pHMG1PPRE e phIGF-I, misurando l’attività dell’enzima luciferasi (LUC assay, Promega, Milano). I risultati del CAT assay
e del LUC assay sono riportati come unità percentuali arbitrarie: il valore ottenuto in assenza di cig e ros è considerato 100%. L’attività della luciferasi è espressa anche come “unità di luce relativa”(RLU). La variazione di espressione dell’enzima beta-galattosidasi, è valutata come indice dell’efficienza della trasfezione.
3.13 Gel mobility shift assay (EMSA)
I recettori PPARgamma e RXRalfa umani sono sintetizzati in vitro utilizzando i plasmidi di espressione pSG5-PPARgammae pSG5-RXRalfa con un lisato di reticolociti di coniglio (Promega, Milano). La 5’flanking region tra la posizione -397 e -144 di hGH, ottenuta per amplificazione mediante PCR da DNA
genomico, è purificata e marcata con 32P (Amersham Biosciences, Milano) (sonda) impiegando l’enzima T4 polinucleotide chinasi. In un volume di 20 ul (20mM Hepes pH 7,9, 0,5 mM di DTT, 5 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 100 mM KCl, 2ug di poly(dI-dC), 10% glicerolo) sono pre-incubati in ghiaccio per 15 minuti 2,5 ul di lisato programmato (contenente i recettori PPARgamma e RXRalfa sintetizzati in vitro) o non programmato (controllo negativo), ai quali sono aggiunti circa 3 ng ( 15000 cpm) di sonda, in presenza o assenza di TZDs e di un eccesso di DNA competitivo specifico o non-specifico. Dopo 45 minuti, i complessi DNA-proteina sono evidenziati su gel di poliacrilammide non-
denaturante mediante elettroforesi in TBE 0,5X (45 mM Tris, 45 mM acido borico, 1 mM EDTA) e autoradiografia.
3.14 DNAse I Footprinting
La reazione di binding è formata da 4,5 ul di buffer ( Tris 125 mM pH 7,9; 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM KCl, 1,5 ug/ul poly(dA-dT), 50% glicerolo) e 17 ul di lisato programmato (contenente i recettori PPARgamma e RXRalfa sintetizzati in vitro) o non programmato, in 25 mM Hepes pH 7,6; 40 mM KCl;
0,1 mM EDTA, 1mM DTT, 10% glicerolo. Dopo 10 minuti di incubazione a RT è aggiunto 1ul (104 cpm) di sonda marcata con 32P (Amersham Biosciences, Milano) corrispondente al frammento tra la posizione -397e -144 del promotore di hGH e l’incubazione si protrae per ulteriori 30 minuti. Sono poi aggiunti 5 ul di Ca2+/Mg2+ solution ( 10mM MgCl2, 5mM CaCl2), 3 unità/ul di DNAsi I (Amersham, Milano). La digestione è bloccata dopo 1 minuto aggiungendo 140 ul di stop solution (768 mM sodio acetato, 128 mM EDTA, 0,56% SDS, 256 ug/ml di yeast RNA). La sonda marcata è separatamente digerita secondo il metodo di Maxam e Gilbert ( Maxam e Gilbert, 1980) e usata come marker. I campioni sono purificati, separati su gel di poliacrilammide 6% e urea 8 M e identificati con autoradiografia
.
3.15 Statistica
I valori sono espressi come media±S.D. Il confronto dei parametri è ottenuto attraverso l’analisi della varianza (ANOVA).
4.RISULTATI
4.1 Ros riduce la secrezione di GH dalle GH3
Le GH3 sono esposte a concentrazioni crescenti di ros (da 1 a 50 uM) fino a 72h. Il livello di GH nel mezzo di coltura e negli estratti cellulari è misurato mediante dosaggio radioimmunologico, come riportato in Materiali e Metodi.
Ros 10uM riduce in modo significativo il livello di GH nel mezzo di coltura delle GH3 da 8,3±1,4 a 1,9±0,7 ng/ml dopo 24h(p<0,04), da 16,5±3,7 a 3,6±0,9 ng/ml dopo 48h (p<0,03) e da 43,7±5,4 a 2,1±0,3 ng/ml dopo72h(p<0,0001) (fig.6A). Dopo 24h di incubazione, ros riduce la concentrazione di GH nel mezzo di coltura in maniera dose-dipendente (p<0,04) (fig.6B). Dopo 72h di incubazione, la concentrazione di GH negli estratti cellulari si riduce in modo significativo da 233±13 a 109±11 ng/ml (p<0,004) (fig.6C).
4.2 L’espressione dell’mRNA di GH nelle GH3 è ridotta dalla presenza di cig e ros
Le GH3 sono esposte a cig (1-10uM) e ros 1-10uM per 24h. Il livello di espressione di mRNA di GH è valutato con RT-PCR, come riportato in Materiali e metodi.
Le copie dei trascritti di mRNA di GH si riducono da 5,7x106 a 3,0x106 e 1,8x106 nelle GH3 trattate con cig 1 uM e 10uM, rispettivamente (p<0,002). La riduzione delle copie dei trascritti di mRNA di GH osservata nelle GH3 trattate con ros 1-10uM è paragonabile alla precedente. L’RNA ottenuto dalle NIH3T3 è utilizzato come controllo negativo (fig.7).
4.3 Nelle GH3 PPARgamma è espresso e funzionalmente attivo
Le GH3 sono esposte a cig 1uM fino a 12h. La presenza di PPARgamma è rivelata con la metodica dell’immunofluorescenza come riportato in Materiali e Metodi. PPARgamma è espesso nelle GH3 non trattate e trasloca nel nucleo quando le cellule sono esposte a cig 1 uM (fig.8A). Il plasmide chimerico pACOPPRE contenente il PPRE dell’enzima Acil-CoA Ossidasi, costruito come riportato in Materiali e Metodi, è trasfettato in maniera transitoria nelle GH3 e NIH3T3. Esponendo le due linee cellulari trasfettate a cig o ros 1uM l’attività di CAT, espressa come unità percentuale arbitraria, aumenta di 1,8 e 2,2 volte, rispettivamente, solo nelle GH3, indicando che in queste cellule PPARgamma è funzionalmente attivo. Nelle NIH3T3 è necessario cotrasfettare anche il
plasmide pSG5PPARgamma per indurre un aumento significativo dell’attività di CAT, suggerendo che in queste cellule PPARgamma è inattivo (fig.8B).
