3. RISULTATI
3.1. Diversità genetica all’interno dei campioni
Le analisi sono state effettuate sulle sequenze di 1143 bp del gene Cyt b ricavate da 75 animali campionati nelle 15 località considerate. L’allineamento nucleotidico è disponibile in appendice I, quello amminoacidico in appendice II. Dall’allineamento delle sequenze nucleotidiche risultano in tutto 51 aplotipi differenti, di cui 42 unici, cioè propri di un singolo animale. Sono stati rilevati complessivamente 89 siti polimorfici su 1143 (7.8%) con le singole sequenze che differiscono tra loro per un numero di basi variabile da 6 a 31. Il numero di aplotipi per località varia da 2 a 5 (Tab. 3.1). In generale, è stata rilevata un’alta diversità aplotipica (h) ed una bassa diversità nucleotidica (π) sia in totale che per i singoli campioni (Tab. 3.1).
Tab. 3.1 Stime di diversità genetica per campione. n: taglia del campione; Nh: numero di aplotipi; Np: numero di siti polimorfici; h: diversità aplotipica; π: diversità nucleotidica.
composizione nucleotidica (%) località n Nh Np C T A G h π Gal 5 2 7 23.50 30.99 28.62 16.89 0.400 ±0.237 0.003 ±0.002 Bai 5 4 11 23.54 30.90 28.57 16.99 0.900 ±0.161 0.004 ±0.003 Pal 5 5 31 23.43 30.97 28.66 16.94 1.000 ±0.127 0.011 ±0.007 Alg 5 5 23 23.53 30.90 28.63 16.94 1.000 ±0.127 0.011 ±0.007 Que 5 5 21 23.48 30.92 28.66 16.94 1.000 ±0.127 0.010 ±0.007 Pit 5 4 21 23.46 30.92 28.70 16.92 0.900 ±0.161 0.010 ±0.006 Ust 5 5 26 23.48 30.93 28.57 17.01 1.000 ±0.127 0.011 ±0.007 Cde 5 5 20 23.50 30.88 28.62 17.01 1.000 ±0.127 0.010 ±0.006 Anc 5 5 6 23.50 30.94 28.52 17.04 1.000 ±0.127 0.002 ±0.002 Les 5 5 13 23.48 30.90 28.63 16.99 1.000 ±0.127 0.005 ±0.003 Bri 5 5 17 23.62 30.83 28.63 16.92 1.000 ±0.127 0.006 ±0.004 Mlj 5 3 14 23.52 30.92 28.52 17.04 0.700 ±0.218 0.005 ±0.003 Nax 5 5 25 23.46 30.90 28.66 16.98 1.000 ±0.127 0.012 ±0.007 Sca 5 5 23 23.48 30.92 28.59 17.01 1.000 ±0.127 0.008 ±0.005 Rho 5 5 23 23.50 30.87 28.64 16.99 1.000 ±0.127 0.010 ±0.007 Totale 75 51 89 23.50 30.91 28.61 16.98 0.978 ±0.008 0.008 ±0.001
L’allineamento delle sequenze amminoacidiche ha rivelato la presenza di otto mutazioni non sinonime, cioè che determinano sostituzioni amminoacidiche. In sette casi si ha la sostituzione di un amminoacido con un altro del medesimo gruppo e quindi con le stesse caratteristiche fisico-chimiche; solo in un caso, nell’individuo Bai08, si ha la sostituzione di un amminoacido polare, la treonina, con un
amminoacido apolare, l’alanina, a causa di una mutazione puntiforme in posizione 52, riguardante la prima base di una tripletta (Appendice II).
3.2. Diversità genetica tra i campioni
La presenza di strutturazione genetica della specie è stata verificata complessivamente con il test esatto, basato sul metodo MCMC, la cui ipotesi nulla è l’assenza di strutturazione genetica. Il test non ha consentito di rigettare l’ipotesi nulla, in quanto ha fornito un valore di P = 0.282.
3.2.1 F-Statistica
I valori di F-statistica calcolati per i campioni di Paracentrotus lividus sono riportati nella Tab. 3.2. I valori più alti di FST sono stati riscontrati tra il campione di
Galway e tutti gli altri campioni analizzati; tutti questi valori sono risultati significativamente maggiori di zero al test di permutazione con 10000 repliche. Per gli altri campioni i valori più elevati si riscontrano tra Ancona ed Alghero (FST = 0.42,
P < 0.05), Ancona e Pittulongu (FST = 0.35, P < 0.05), Ancona e Rodi (FST = 0.41, P <
0.05). Il campione di Ancona presenta valori di FST significativamente maggiori di
Tab. 3.2. Valori di FST a coppie calcolati per i 15 campioni di Paracentrotus lividus analizzati.
Gal Bai Pal Alg Que Pit Ust Cde Anc Les Bri Mlj Nax Sca Rho
Bai 0.4653* -Pal 0.2083* -0.0071 -Alg 0.5069* 0.3311* 0.0526 -Que 0.4138* 0.1667 -0.0902 -0.0925 -Pit 0.4156* 0.2359** -0.0417 -0.0493 -0.1667 -Ust 0.3790* 0.1434 -0.1004 -0.0638 -0.1700 -0.1121 -Cde 0.4444** 0.1183 -0.0650 -0.0502 -0.1603 -0.0755 -0.1142 -Anc 0.7000** 0.1177 0.1592* 0.4186* 0.2992* 0.3498** 0.2720* 0.1626 -Les 0.5000* -0.0484 -0.0294 0.2857 0.1245 0.1974* 0.1120 0.0761 0.0790 -Bri 0.5196** -0.0211 0.0637 0.3009 0.1850* 0.2524** 0.1523* 0.1043 0.0164 -0.0127 -Mlj 0.4952* -0.0366 0.0466 0.3189 0.2115* 0.2737** 0.1875* 0.1139 0.0049 -0.0106 -0.0571 -Nax 0.3853* 0.1393 -0.0943 -0.0650 -0.1735 -0.1399 -0.1273 -0.1426 0.2418* 0.0703 0.1549 0.1667 -Sca 0.3800* -0.0143 -0.1458 0.0558 -0.0991 -0.0192 -0.0840 -0.0879 0.1286 -0.0754 0.0258 0.0404 -0.0857 -Rho 0.5068* 0.3366 0.0427 -0.0985 -0.1122 -0.0833 -0.0664 -0.1015 0.4098* 0.2971 0.3228 0.3409 -0.0989 0.0647 -Gal - .
3.2.2 Analisi della varianza molecolare (AMOVA)
L’AMOVA è stata eseguita inizialmente considerando solo due livelli gerarchici: “individui” e “campioni”. L’analisi ha attribuito l’88% della varianza al livello inter-individuale e il 12% rappresenta la componente tra i campioni (Tab. 3.3).
Tab. 3.3. Risultati dell’analisi della varianza molecolare (AMOVA) per i 15 campioni di Paracentrotus
lividus analizzati. Valori di P calcolati con un test di permutazione (10000 repliche).
Fonte della Varianza gl Componente della
Varianza
Percentuale
della Varianza Φ-statistica P
Tra campioni 14 0.62210 12.39
Tra individui all’interno
dei campioni 60 4.40000 87.61 ΦST = 0.124
0.005
L’AMOVA è stata effettuata inoltre considerando un ulteriore livello gerarchico (“gruppo”), che considera l’insieme dei campioni localizzati in ciascuna delle seguenti aree biogeografiche: Atlantico, Mediterraneo occidentale, Mediterraneo orientale e Adriatico. l’AMOVA in questo caso ha ripartito in maniera differente le componenti della varianza ed ha prodotto una componente negativa nel caso della varianza molecolare tra i campioni all’interno dei gruppi (Tab. 3.4.).
Tab. 3.4. Risultati dell’analisi della varianza molecolare (AMOVA) per 15 campioni di Paracentrotus
lividus. Valori di P- calcolati dopo un test di permutazione (10,000 repliche).
Fonte della Varianza gl Componente della
Varianza
Percentuale
della Varianza Φ-statistica P
Tra gruppi 3 1.11178 20.62 ΦCT = 0.206 <0.001
Tra campioni all’interno dei gruppi 11 -0.11909 -2.21 ΦSC = -0.028 0.015
Tra individui all’interno
dei campioni 60 4.40000 81.59 ΦST = 0.184 0.007
L’ottenimento di valori leggermente negativi è un fenomeno non raro, che avviene per un artefatto dell’algoritmo utilizzato. In questo caso la percentuale della componente della varianza per il livello considerato può essere considerata uguale a zero. Nel presente lavoro, quindi, considerando uguale a zero la componente negativa, si ottiene che circa l’80% della varianza molecolare è attribuita al livello
inter-individuale ed il restante 20% è a carico della varianza presente tra i gruppi (Tab. 3.4). L’AMOVA fornisce anche i valori della Φ-statistica, analoga all’F-statistica, che esprime quindi il grado di eterogeneità genetica esistente all’interno dei vari livelli gerarchici. Tutti i valori della Φ-statistica sono risultati significativamente diversi da zero al test di permutazione con 10000 repliche (Tab. 3.4.).
3.2.3 Network
I network di massima parsimonia (Fig. 3.1) e “median-joining” (Fig. 3.2) hanno evidenziato la presenza di due gruppi di aplotipi (“aplogruppi”), di cui uno è costituito da 13 e l’altro da 38 aplotipi, separati da undici mutazioni ed una connessione ambigua. I due network hanno fornito risultati sostanzialmente concordanti, essendo quasi totalmente sovrapponibili; l’unica differenza rilevabile è la diversa disposizione dell’aplotipo Alg05 che, nel caso del network di parsimonia, risulta non connesso agli altri, poiché eccede il limite di parsimonia stabilito. Data la similarità dei due grafici, nel primo (Fig. 3.1) sono stati riportate le sigle indicative degli individui analizzati, mentre nel secondo (Fig. 3.2) sono stati messi in evidenza, assegnando loro un diverso colore, le aree biogeografiche di provenienza dei vari aplotipi, così come definite per l’AMOVA. Da notare il fatto che mentre nel maggiore dei due aplogruppi troviamo aplotipi di campioni provenienti dall’intera area considerata nel presente studio, in quello più piccolo sono assenti aplotipi di provenienza atlantica o adriatica. Questa situazione risulta più apprezzabile nella Fig. 3.2, in cui è visibile in maniera immediata come nell’aplogruppo situato nella parte più bassa del grafico siano assenti i colori rosso e verde, corrispondenti rispettivamente ai campioni di Atlantico ed Adriatico.
Fig. 3.1. Network di massima parsimonia degli aplotipi rilevati nei 75 individui di
P. lividus analizzati. Da notare che in questa figura alcuni dei campioni sono
indicati con una sigla relativa alle province per cui: Liv = Que, Vib = Cde, Fog = Les, Cat = Nax, Lec = Sca. Per facilitare la lettura sono state omesse le sigle relative agli animali che presentano il medesimo aplotipo: Mlj04 = Mlj07, Mlj14, Rho03, Cde06, Bri13, Les05, Sca11; Anc07 = Bai01, Bai03, Sca09, Ust19, Cde08; Gal02 = Gal03, Gal19, Gal26; Alg05 = Pit03, Pit07, Rho01; Nax14 = Pal08, Rho06; Que01 = Pit06, Cde04; Alg38 = Que27; Les10 = Pal04; Alg10 = Mlj12.
Atlantic Ocean
W-Mediterranean
E-Mediterranean
Adriatic Sea
median vector
mutational step
Fig. 3.2. Network degli aplotipi rilevati nei 75 individui di P. lividus analizzati ottenuto con la tecnica del median-joining.
3.2.4 Multidimensional scaling (MDS)
Il risultato dell’MDS delle distanze genetiche di Tamura & Nei (1993) tra gli individui di P. lividus analizzati è riportato in Fig. 3.3.A L’analisi è stata ripetuta anche omettendo i dati relativi ai due campioni di provenienza atlantica (Fig. 3.3.B). Dal grafico risulta evidente una netta separazione lungo l’asse orizzontale che corrisponde alla divisione nei due aplogruppi riconoscibili nei network (Fig. 3.1 e 3.2). L’MDS è stato applicato anche alla matrice della distanze genetiche di Tamura & Nei (1993) tra ciascuna coppia di centroidi dei campioni (Fig. 3.4.A). Nel grafico si osserva una separazione lungo l’asse verticale delle località atlantiche da quelle mediterranee. Anche per i centroidi dei campioni l’analisi è stata ripetuta per le sole località mediterranee (Fig. 3.4.B). In questo caso i campioni adriatici risultano nettamente separati lungo l’asse orizzontale da quelli provenienti dal resto del Mediterraneo. In entrambi i casi i valori di stress sono superiori al valore di 0.05 e la rappresentazione è da considerarsi buona.
MDS
Tamura & Nei's (1993) Distance
ALG05PIT03PIT07 LIV07 CAT30 FOG02 LEC05 LIV04 RHO01 CAT34 FOG10PAL04 LEC10 GAL11 PIT01 UST14 BAI05 MLI02 GAL02 GAL03GAL19GAL26
PAL05 PAL03 UST06 BAI08 CAT09 MLI04 VIB06 FOG05 VIB07MLI14BRI13 PAL06MLI07RHO03LEC11 ANC05 FOG04 ANC01 ALG10MLI12 BRI04 ANC02 ANC06 BRI16 ANC07 LIV03UST15BAI01BAI03LEC9VIB08 BRI09
FOG03 BAI02BRI14
ALG09 ALG35
ALG38LIV27CAT14RHO06PAL08 VIB03LIV01 PIT06 VIB04 UST02 PIT02RHO04 LEC06 RHO02 UST16 CAT08 -1.0 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1.0 1.4 -1.2 -0.6 0.0 0.6 1.2 1.8 2.4
MDS (Atlantic samples omitted) Tamura & Nei's (1993) distance
ALG05PIT03PIT07 LIV07 CAT30 FOG02 LEC05 LIV04 RHO01 CAT34 FOG10PAL04 LEC10 PIT01 UST14 MLI02 PAL05 PAL03 UST06
CAT09FOG05MLI04VIB06 VIB07PAL06RHO03LEC11BRI13MLI07MLI14 ANC05 FOG04 ANC01 ALG10MLI12 BRI04 ANC02 ANC06 BRI16 ANC07 LIV03 LEC9 UST15VIB08 BRI09 FOG03 BRI14 ALG09 ALG35 ALG38LIV27 CAT14 PAL08 RHO06VIB03 LIV01 PIT06 VIB04 UST02 PIT02RHO04 LEC06 RHO02 UST16 CAT08 -1.0 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1.0 -1.5 A STRESS = 0.098 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 STRESS = 0.095 B
Fig. 3.3. A: MDS per tutti gli aplotipi secondo le distanze genetiche di Tamura & Nei (1993); B: MDS per gli aplotipi del Mediterraneo secondo le distanze genetiche di Tamura & Nei (1993). Da notare che in questa figura alcuni dei campioni sono indicati con una sigla relativa alle province per cui: Liv = Que, Vib = Cde, Fog = Les, Cat = Nax, Lec = Sca.
MDS
Tamura & Nei's distance
LIV ALG CAT ANC GAL PIT FOG LEC RHO PAL UST BAI MLI VIB BRI -1.2 -0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 -1.6 -1.2 -0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 MDS (Mediterranean) Tamura & Nei's distance
LIV ALG CAT ANC PIT FOG LEC RHO PAL UST MLI VIB BRI -1.0 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1.0 A STRESS = 0.057 -1.6 -1.0 -0.4 0.2 0.8 1.4 2.0 B STRESS = 0.054
Fig. 3.4. A: MDS per i centroidi relativi a tutti i campioni secondo le distanze di Tamura & Nei (1993); B: MDS per i centroidi dei campioni del Mediterraneo secondo le distanze di Tamura & Nei (1993). Da notare che in questa figura alcuni dei campioni sono indicati con una sigla relativa alle province per cui: Liv = Que, Vib = Cde, Fog = Les, Cat = Nax, Lec = Sca.
3.2.5 Stime di flusso genico
La stima di flusso genico più bassa è stata rilevata considerando il totale dei campioni; un valore leggermente più elevato è stato ottenuto considerando i soli campioni mediterranei (Tab. 3.5). All’interno delle singole regioni biogeografiche considerate, con l’eccezione dell’Atlantico, le stime di flusso genico risultano lievemente superiori, comprese tra Nm = 2.68 (Adriatico) e Nm = 3.90 (Mediterraneo occidentale). Il valore relativo al flusso genico tra i campioni atlantici risulta essere molto basso: ciò dipende dalla peculiarità del campione di Galway, che, come si è visto, proviene da un impianto di acquacoltura. È da notare come il flusso genico stimato non raggiunga mai il valore di 4.00, ritenuto corrispondente alla condizione di panmissia (Tab. 3.5) .
Tab. 3.5. Stime di flusso genico ottenute con la relazione γST = 1 / (1 + 2Nm). γST è un analogo dell’FST (Nei, 1982).
TOTALE DATI Nm = 1.26 MEDITERRANEO Nm = 1.66 MEDITERRANEANEO-W Nm = 3.90 ADRIATICO Nm = 2.68 MEDITERRANEANEO-E Nm = 3.65 ATLANTICO Nm = 0.75
3.2.6 Test di Mantel
Il test per verificare la presenza di “isolamento da distanza”, che utilizza le matrici di distanza genetica e di distanza nautica minima (Tab. 3.6) è risultato significativo, sia quando applicato sulla totalità dei campioni, sia quando sono stati omessi i campioni atlantici di Galway e Baiona. Nel secondo caso la distribuzione appare più dispersa e cambia la pendenza della retta di regressione (Tab. 3.7, Fig. 3.5 e 3.6).
Tab. 3.6. Sopra la diagonale: distanze nautiche minime (in Km); sotto la diagonale: valori di FST per ciascuna coppia dei 15 campioni di Paracentrotus lividus analizzati.
Gal Bai Pal Alg Que Pit Ust Cde Anc Les Bri Mlj Nax Sca Rho
Gal - 1289 3347 3503 3806 3698 3864 4116 5103 4883 4635 4854 4188 4506 5194 Bai 0.4653* - 2088 2244 2547 2439 2605 2857 3844 3624 3376 3595 2929 3247 3935 Pal 0.2083* -0.0071 - 457 620 581 970 1205 2159 1870 1645 1914 1215 1532 2338 Alg 0.5069* 0.3311* 0.0526 - 415 210 595 852 1787 1568 1333 1546 864 1179 1980 Que 0.4138* 0.1667 -0.0902 -0.0925 - 284 587 745 1739 1497 1255 1489 814 1118 1903 Pit 0.4156* 0.2359** -0.0417 -0.0493 -0.1667 - 394 607 1583 1357 1085 1309 685 973 1785 Ust 0.3790* 0.1434 -0.1004 -0.0638 -0.1700 -0.1121 - 252 1211 978 716 937 297 610 1439 Cde 0.4444** 0.1183 -0.0650 -0.0502 -0.1603 -0.0755 -0.1142 - 1074 837 579 792 150 466 1266 Anc 0.7000** 0.1177 0.1592* 0.4186* 0.2992* 0.3498** 0.2720* 0.1626 - 250 496 343 983 678 1649 Les 0.5000* -0.0484 -0.0294 0.2857 0.1245 0.1974* 0.1120 0.0761 0.0790 - 271 177 738 427 1420 Bri 0.5196** -0.0211 0.0637 0.3009 0.1850* 0.2524** 0.1523* 0.1043 0.0164 -0.0127 - 234 486 184 1153 Mlj 0.4952* -0.0366 0.0466 0.3189 0.2115* 0.2737** 0.1875* 0.1139 0.0049 -0.0106 -0.0571 - 711 401 1365 Nax 0.3853* 0.1393 -0.0943 -0.0650 -0.1735 -0.1399 -0.1273 -0.1426 0.2418* 0.0703 0.1549 0.1667 - 387 1187 Lec 0.3800* -0.0143 -0.1458 0.0558 -0.0991 -0.0192 -0.0840 -0.0879 0.1286 -0.0754 0.0258 0.0404 -0.0857 - 1118 Rho 0.5068* 0.3366 0.0427 -0.0985 -0.1122 -0.0833 -0.0664 -0.1015 0.4098* 0.2971 0.3228 0.3409 -0.0989 0.0647
Tab. 3.7. Risultati del test di Mantel applicato alle matrici di distanza genetica (FST) e di distanza geografica per saggiare la presenza di “isolamento da distanza”.
Z Intercetta slope p
Totale 37007.66 -0.14 ± 0.0243 0.000153 ± 0.00001155 <0.001
Mediterraneo 6545.76 -0.238 ± 0.034 0.000293 ± 0.0000306 0.007
Fig. 3.5. Retta di regressione per la correlazione tra distanze genetiche (FST) e distanze geografiche relativa al totale dei dati.
Fig. 3.6. Retta di regressione per la correlazione tra distanze genetiche (FST) e distanze geografiche relativa ai soli campioni mediterranei.
3.3 Aspetti di demografia storica
Le analisi sugli aspetti demografici storici, effettuate mediante la distribuzione mismatch, hanno fornito curve bimodali quando sono stati considerati la totalità calcolata per il totale dei campioni ed anche quando sono stati considerati i soli campioni del Mediterraneo. Una distribuzione bimodale è stata ottenuta anche considerando separatamente i campioni del bacino orientale e di quello occidentale del Mediterraneo, per l’insieme dei campioni dei due bacini mediterranei e, infine, per l‘insieme dei campioni del bacino orientale del Mediterraneo più quelli del Mar Adriatico. Al contrario la curva ottenuta per i soli campioni del Mar Adriatico presenta un andamento molto vicino a quello della curva attesa, prevista per una recente espansione demografica (Fig. 3.7).
MEDITERRANEO + ADRIATICO
MEDITERRANEO OCCIDENTALE
+ ORIENTALE Fig. 3.7. Distribuzione mismatchrelativa agli aplotipi delle varie aree
TOTALE MEDITERRANEO MEDITERRANEO ORIENTALE MEDITERRANEO OCCIDENTALE MAR ADRIATICO biogeografiche analizzate.
Il test R2 di Ramos-Onsins & Rozas (2002) è risultato altamente significativo (P
< 0.001) quando applicato ai campioni del Mar Adriatico; una significatività inferiore (P < 0.05) è stata invece rilevata considerando tutti i campioni, i campioni mediterranei, e considerando unitamente i campioni di Mediterraneo orientale ed Adriatico. Il test non è invece risultato significativo per il Mediterraneo occidentale, per il Mediterraneo orientale e per i due gruppi considerati congiuntamente (Tab. 3.8).
Tab. 3.8. Risultati dei test R2 di Ramos-Onsins & Rozas (2002), effettuati sui campioni di P. lividus raggrupati secondo differenti criteri biogeografici. La significatività dei valori è stata ottenuta con 10000 permutazioni.
θ0 θ1 τ R2 Totalea 5.664 18.263 4.205 0.050* Mediterraneo 5.679 17.707 4.459 0.054* Mediterraneo occidentale 5.515 14.136 5.379 0.083 ns Mediterraneo orientale 5.646 11.687 5.268 0.118 ns Adriatico 2.891 10.993 2.356 0.057** Mediterraneo orientale + Adriatico 5.679 15.298 3.128 0.060* Mediterraneo orientale + occidentale 5.609 15.046 5.154 0.074 ns
a il campione di acquacoltura di Galway è stato omesso. ns non significativo, * P<0.05, ** P<0.001.
