4. Discussione
4.1. Ruolo di 5-HT2B nella morfogenesi
dell’occhio
Negli ultimi anni si è andata affermando l’idea che la serotonina, come altri neurotrasmettitori, svolga un ruolo molto importante nello sviluppo, agendo come segnale di regolazione in processi di differenziamento e morfogenesi (Lauder, 1993; Buznikov et al., 2001; Nguyen et al., 2001). Tutte le azioni della serotonina sono mediate da venti recettori diversi (Hoyer et al., 1994). Tra questi, quello che compare prima nell’embriogenesi e che è noto avere un ruolo importante nello sviluppo precoce è il recettore 5-HT2B (Choi et al., 1997). Nel nostro laboratorio è stato clonato il gene 5-HT2B di Xenopus laevis ed è stato dimostrato, durante lo sviluppo, che il suo mRNA è fortemente espresso nelle regioni proliferative dell’encefalo e della retina.(De Lucchini et al., 2003). Sulla base di questi dati è stato ipotizzato che questo recettore sia importante per lo sviluppo del sistema nervoso centrale. Parte del mio lavoro di tesi, perciò, è stato effettuare lo studio funzionale di X5-HT2B per vedere se è effettivamente coinvolto in processi di embriogenesi.
Esperimenti di perdita di funzione del recettore 5-HT2B sono stati eseguiti utilizzando la tecnica del morpholino. Lo studio del fenotipo di questi embrioni di
Xenopus a stadio 42, mi ha permesso di confermare che l’assenza di questo
recettore, durante l’embriogenesi, porta a difetti dello sviluppo. Gli embrioni iniettati, infatti, presentano l’occhio del lato iniettato ridotto in dimensioni e con dei difetti nella chiusura della fessura ottica rispetto a quello del lato wt. Inoltre questi embrioni hanno delle malformazioni a livello del cuore. Il fenotipo che ho riscontrato è in accordo con i dati presenti in letteratura. Infatti studi condotti su embrioni di topo in coltura, a 9 giorni di gestazione, a cui è stata somministrata
ritanserina, antagonista di questo recettore, hanno riportato che il blocco di 5-HT2B provoca delle forti alterazioni dello sviluppo tra cui gravi malformazioni generalizzate a carico del cuore e della regione cefalica (Choi et al., 1997). Simili risultati sono stati ottenuti con lo studio del topo “knock-out” per 5-HT2B che presenta gravi malformazioni cardiache (Nebigil et al., 2001).
Dall’analisi più dettagliata delle retine degli embrioni di Xenopus iniettati col morpholino, mediante immunoistochimica contro l’N-tubulina e colorazione dei nuclei cellulari con l’hoechst, ho potuto mettere in evidenza che nel lato iniettato dell’embrione, la struttura laminare della retina risulta profondamente disorganizzata. In particolare nei precursori retinici della CMZ (ciliary marginal zone) di queste retine, l’espressione dell’mRNA della ciclina D1, marcatore molecolare di cellule in attiva proliferazione, è fortemente ridotta. Questa osservazione è risultata molto interessante in quanto il topo “knock-out” per il recettore 5-HT2B, presenta un fenotipo letale a causa di difetti proliferativi e differenziativi dei cardiomiociti (Nebigil et al.,.2001). Inoltre alcuni studi condotti
in vitro sui cardiomiociti hanno mostrato che il recettore 5-HT2B, attivato dalla
serotonina, ha un effetto trofico per queste cellule perché è in grado di attivare i processi di proliferazione che coinvolgono i complessi ciclina D1/cdk4 e ciclina E/cdk2 (Nebigil et al., 2003).
Inoltre studi recenti hanno dimostrato che la regolazione del ciclo cellulare è cruciale nel determinare sia le dimensioni della retina che il corretto equilibrio tra i vari tipi cellulari che la costituiscono e che se tale regolazione viene perturbata, l’istogenesi e la funzionalità della retina risultano fortemente compromesse (Dyer and Cepko, 2001). Perciò, i risultati che ho ottenuto e i dati presenti in letteratura, ci hanno portati a concludere che tra i ruoli della serotonina mediati dal recettore 5-HT2B, ci sia quello di sostenere la corretta proliferazione dei precursori retinici in un periodo critico per la formazione dell’occhio.
Per vedere se le alterazioni che avevo riscontrato a livello dell’organizzazione della retina degli embrioni iniettati col morpholino fossero dovute solo alla diminuzione della proliferazione dei progenitori o anche all’attivazione di processi di morte cellulare, ho effettuato un saggio per visualizzare cellule in apoptosi. Ho analizzato gli embrioni processati e ho messo
in evidenza che il tasso di apoptosi aumenta notevolmente nelle retine degli embrioni iniettati rispetto a quelle dei controlli.
Esperimenti in vitro sui cardiomiociti, hanno dimostrato che la serotonina, attraverso il suo recettore 5-HT2B, ha un effetto citoprotettivo in quanto è in grado di mediare eventi antiapoptotici (Nebigil et al., 2003).
Perciò quello che emerge dallo studio che ho effettuato è che anche nella retina di Xenopus, come nei cardiomiociti di topo, la serotonina, attraverso il legame al recettore 5-HT2B è in grado di proteggere le cellule da morte apoptotica.
Inoltre per chiarire maggiormente il ruolo di questo recettore nello sviluppo dell’occhio, ho fatto degli esperimenti di sovraespressione genica.
Per avere la certezza che il recettore espresso ectopicamente venisse attivato ho somministrato serotonina agli embrioni iniettati a partire da stadio 25. Ho analizzato le retine di questi embrioni per vedere se ci fossero delle alterazioni sia a livello della struttura che del tasso di proliferazione. Ho riscontrato anche in questo caso che la retina degli embrioni iniettati e trattati con 5-HT, è completamente disorganizzata e non vi si distingue la tipica alternanza di strati nucleari e plessiformi. Inoltre in queste retine ho rilevato non solo un forte aumento del tasso di proliferazione cellulare rispetto ai controlli ma anche la comparsa di cellule in proliferazione in zone esterne alla CMZ, dove normalmente, a stadio 42, non c’è proliferazione. Ho riscontrato un leggero aumento del tasso di proliferazione anche nelle retine di embrioni in cui ho solamente sovraespresso il recettore, mentre le retine degli embrioni solamente trattati con serotonina non presentano differenze rispetto ai controlli. Perciò da questi studi funzionali emerge che il recettore 5-HT2B è in grado di stimolare la proliferazione delle cellule della retina e che questo suo effetto è stimolato dal legame con la serotonina.
I dati ottenuti con questo studio funzionale mettono in evidenza che la serotonina, attraverso il suo legame con il recettore 5-HT2B, è essenziale per la corretta morfologia della retina. Inoltre questi esperimenti, dimostrano, per la prima volta, che il recettore 5-HT2B anche nel sistema nervoso e in particolare nella retina può avere un ruolo importante in processi di morfogenesi precoce quali proliferazione e sopravvivenza cellulare. Resta ancora da chiarire però, se la
parte, durante la retinogenesi, a processi di differenziamento cellulare; questo potrà essere in parte chiarito mediante l’analisi, degli embrioni iniettati, con marcatori molecolari specifici per i vari tipi cellulari retinici.
4.2. Caratterizzazione spazio-temporale
della presenza di serotonina
nell’embrione di Xenopus laevis
Durante il mio lavoro di tesi mi sono occupata di studiare il ruolo della serotonina durante lo sviluppo del sistema nervoso di Xenopus. Come studio preliminare ho quindi caratterizzato la presenza di serotonina nel sistema nervoso durante lo sviluppo. Per fare questo ho effettuato esperimenti di immunoistochimica su sezioni con un anticorpo contro la serotonina. Con questa tecnica ho riscontrato la presenza di 5-HT a livello dei nuclei serotoninergici del
raphe a partire da stadio 35 fino all’adulto. Inoltre a stadio 42 ne ho rilevato la
presenza anche a livello di alcune cellule dello strato nucleare interno della retina e dell’epidermide. è possibile ipotizzare che le cellule retiniche immunoreattive per la serotonina siano cellule amacrine in quanto dati presenti in letteratura affermano che questo tipo di cellule è l’unico in grado di sintetizzarla (Huang and Moody, 1997).
4.3. Espressione spazio-temporale di
X5-HTT
Un tipo diverso di approccio allo studio del sistema serotoninergico è quello di perturbarne l’omeostasi aumentando o diminuendo i livelli di serotonina nell’embrione. Un modo di alterare la quantità di serotonina disponibile per le cellule è quello, ad esempio, di modulare la capacità delle cellule stesse direinternalizzarla, bloccando o sovraesprimendo l’mRNA del trasportatore (SERT).
Nel nostro laboratorio era presente un clone di una banca EST di cDNA di
Xenopus, contenente un frammento della sequenza di XSERT. Studi effettuati sui
mammiferi avevano già messo in evidenza che l’mRNA di 5-HTT è espresso nel sistema nervoso e in particolare nei nuclei serotoninergici del raphe (Chang et al., 1996; Hansson et al., 1998; Lesh et al., 1993).
Dato che questo gene non è ancora stato clonato in Xenopus laevis, per stabilire se effettivamente potesse essere utilizzato sia come marcatore specifico dei neuroni serotoninergici, sia in uno studio funzionale volto a perturbare l’omeostasi della serotonina nel sistema nervoso centrale, ne ho studiato il profilo di espressione spazio-temporale.
Ho effettuato esperimenti di ibridazione in situ sia su sezione che “whole mount” e ho riscontrato che l’mRNA di X5-HTT comincia ad essere espresso, nell’embrione di Xenopus, a partire da stadio 30 ed è localizzato nei nuclei del
raphe del rombencefalo ventrale. Analizzando diversi stadi embrionali, sino
all’adulto, è emerso che nei nuclei del raphe l’mRNA di X5-HTT resta espresso per tutto il ciclo vitale. Inoltre con questo studio ho riscontrato che c’è un’espressione transiente di X5-HTT nella ghiandola pineale, intorno a stadio 33 e che a stadio 45 c’è espressione anche in alcune cellule dello strato nucleare interno della retina.
Ho confrontato l’espressione dell’mRNA di X5-HTT in embrioni a stadio 42 con la presenza di serotonina in embrioni allo stesso stadio per avere un’ulteriore conferma del fatto che l’mRNA di SERT è espresso nei neuroni serotoninergici.
Perciò con questo studio preliminare ho stabilito che XSERT, in Xenopus
laevis, ha un profilo di espressione che rispecchia quello già noto in letteratura
per i mammiferi ed è un marcatore specifico dei neuroni serotoninergici del sistema nervoso centrale ed è adatto per studi funzionali di guadagno e/o perdita di funzione che saranno effettuati nel nostro laboratorio e costituiranno il naturale proseguimento del mio lavoro di tesi.
4.4. Espressione spazio-temporale di XTph1
Un altro modo per perturbare l’omeostasi della serotonina è quello di modulare l’espressione dell’mRNA dell’enzima che la sintetizza. In Xenopus laevis è stato clonato un gene che codifica per la triptofano idrossilasi, che è noto essere espresso nei fotorecettori dell’occhio, dove la sintesi di serotonina è una tappa della via biosintetica della melatonina (Green and Besharse, 1994). Negli ultimi anni è stato scoperto che in Zebrafish esistono 3 isoforme di questo enzima e che in topo, ratto e uomo ne esistono due isoforme, che sono la Tph1, espressa prevalentemente nei distretti periferici e la Tph2, espressa prevalentemente nel sistema nervoso centrale (Walther et al., 2003; Teraoka et al., 2003; Patel et al., 2004). Dall’allineamento della sequenza aminoacidica dedotta della triptofano idrossilasi di Xenopus con quelle degli omologhi per le due isoforme degli altri vertebrati, non era possibile stabilire con certezza a quale delle due isoforme corrispondesse, né era possibile escludere che in Xenopus esistesse un’unica forma della Tph. Perciò come studio preliminare ho caratterizzato il profilo di espressione dell’mRNA di XTph mediante esperimenti di ibridazione in situ sia su sezioni che “whole mount”.
Dall’analisi di embrioni processati ho messo in evidenza la presenza dell’mRNA di XTph, a livello della ghiandola pineale, a partire da stadio 28. Invece, a stadio 45, ho riscontrato che l’mRNA di XTph è espresso nei
fotorecettori dell’occhio, nella ghiandola pineale, in neuroni encefalici, probabilmente ipotalamici, e a livello dell’intestino e del faringe.
Per determinare con più precisione le regioni encefaliche in cui avevo rilevato l’espressione di XTph, ho eseguito ibridazione in situ per XTph e X5-HTT e immunoistochimica con un anticorpo contro la serotonina su sezioni adiacenti sia di embrioni a stadio 45 che di encefalo adulto. Ciò che ho messo in evidenza è che questi due geni sono espressi in regioni encefaliche diverse, sia negli stadi embrionali che nel cervello adulto. Poichè dalla letteratura e dai dati ottenuti sappiamo che X5-HTT è espresso nei nuclei del raphe, dal confronto dell’espressione di X5HTT e XTph posso concludere che il cDNA del gene XTph analizzato codifica per l’isoforma 1 (XTph1) in quanto il suo mRNA non è espresso nei nuclei del raphe. E’ noto inoltre che esiste una sottopopolazione di neuroni nella regione ventrale dell’ipotalamo in cui è sintetizzata serotonina (Ueda et al., 1984). I neuroni localizzati nella regione ventrale dell’encefalo adulto in cui ho rilevato l’espressione di XTph e in cui ho evidenziato presenza di serotonina potrebbero corrispondere ai neuroni ipotalamici descritti sopra.
Perciò possiamo dedurre che anche in Xenopus laevis esista almeno un’altra isoforma di questo enzima che sintetizza serotonina nei nuclei del raphe e che l’isoforma impiegata nel mio lavoro di tesi corrisponda alla Tph1. Questa isoforma non può essere quindi utilizzata per effettuare studi funzionali volti a modulare la quantità di serotonina prodotta dai nuclei del raphe nel sistema nervoso ma è utile per visualizzare i fotorecettori dell’occhio, i pinealociti e i nuclei serotoninergici ipotalamici.
