RISULTATI
5.1 Valutazione degli effetti di una soluzione contenente
ADP-Fe ed un sistema generante NADPH, su epatociti di ratto
di 3 mesi
Per comprendere se il dolicolo, abbia o meno effetti di protezione delle membrane dallo stress ossidativo, sono stati studiati gli effetti di un sistema generatore di radicali su epatociti isolati di ratto incubati in vitro. Oltre al dolicolo sono stati studiati i livelli di altre due molecole antiossidanti lipofile, notoriamente coinvolte nella protezione delle citomembrane contro lo stress ossidativo: vitamina E e ubichinone. E’ stato valutato il danno causato alle cellule dall’incubazione e l’entità della perossidazione lipidica NADPH-dipendente misurando il rilascio dei TBARS
.
5.1.1 Effetti dell’incubazione con una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sulla produzione di TBArs
L’entità del danno perossidativo subito dagli epatociti durante l’incubazione con un sistema generante NADPH è stato valutato dosando il rilascio di TBARs nel mezzo di incubazione (Fig. 1). La quantità di TBARs (rappresentata come malondialdeide ed espressa come nmol di MDA equivalente/gr di cellule), rilasciata dalle cellule di controllo e presente nel mezzo di incubazione è molto bassa e non varia con il tempo. La presenza della soluzione perossidante determina un aumento significativo della produzione di TBARs particolarmente evidente nei primi 5 minuti.
Effetti di una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sulla produzione di
TBArs in epatociti di ratto di 3 mesi
0 100 200 300 400 500 600 0 5 10 15 20 25
tempo d'incubazione (min)
M D A n m o l/g j controllo trattato
*
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Fig 1: Effetti di una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sulla produzione di TBArs in epatociti di ratto di 3 mesi.
I risultati rappresentano la media ± ESM di almeno sette casi. Analisi statistica (ANOVA): trattamento p<0,0001; Tempo d’ incubazione p<0,0001 (Significatività: Fisher’s test tempo 0 vs 10, 0 vs 20, 0 vs 5, 0 vs 25, 10 vs 20, 10 vs 20, 10 vs 5, 10 vs 25, 10 vs 5, 25 vs 5); Interazione trattamento * tempo p<0,0001.
un sistema generante NADPH sui livelli di vitamina E
Il contenuto di vitamina E negli epatociti isolati non risente in maniera significativa dell’incubazione con una soluzione isoionica di mantenimento per 0’, 5’, 10’, 20’ minuti. L’incubazione con una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH, per gli stessi tempi, determina un calo dei livelli di vitamina E. Il calo che risulta significativo già dopo i 5 minuti e pari al 25% si attenua con l’aumentare della durata dell’esposizione all’agente ossidante ed è descritto (R2 = 0,9716) da una
Effetto di una soluzione contenente
ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sui
livelli di vitamina E in epatociti di ratto di
3 mesi
0 20 40
0 5 10 15 20
tempo d'incubazione (min)
nmol /g controllo trattato
*
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Fig 2: Effetti di una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sui livelli di vitaminaE in epatociti di ratto di 3 mesi.
I risultati rappresentano la media ± ESM di almeno cinque casi. Analisi statistica (ANOVA): trattamento p<0,0001; Tempo d’ incubazione p=0,0020 (Significatività: Fisher’s test tempo 0 vs 5, 0 vs 10, 0 vs 20); Interazione trattamento * tempo p<0,0001.
un sistema generante NADPH sui livelli CoQ9
Il contenuto di CoQ9 negli epatociti isolati non risente in maniera significativa dell’incubazione con una soluzione isoionica di mantenimento per 0’, 5’, 10’, 20’ minuti. L’incubazione con una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH, per gli stessi tempi, determina un calo dei livelli di CoQ9 percentualmente modesto (6%), ma già significativo a partire dai 5 minuti d’incubazione, che poi si accentua progressivamente con l’aumentare del tempo d’incubazione (Fig. 3).
Effetti di una soluzione contenente ADP-Fe ed
un sistema generante NADPH sui livelli di CoQ9
in epatociti di ratto di 3 mesi
0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20
tempo d'incubazione (min)
μg /g controlli trattati
*
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Fig 3: Effetti di una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sui livelli di CoQ9 in epatociti di ratto di 3 mesi.
I risultati rappresentano la media ± ESM di almeno sei casi. Analisi statistica (ANOVA): trattamento p<0,0001; Tempo d’ incubazione p<0,0001 (Significatività: Fisher’s test tempo 0 vs 5, 0 vs 10, 0 vs 20, 10 vs 20, 10 vs 5, 20 vs 5); Interazione trattamento * tempo p<0,0001.
un sistema generante NADPH sui livelli di CoQ10
Il contenuto di CoQ10 negli epatociti isolati non risente in maniera significativa dell’incubazione con una soluzione isoionica di mantenimento per 0’, 5’, 10’, 20’ minuti. L’incubazione con una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH, per gli stessi tempi, determina un calo dei livelli di CoQ10 che risulta significativo solo dopo i 10 minuti e massimo ai 20 minuti (Fig. 4).
Effetti di una soluzione contenente
ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sui
livelli di CoQ10 in epatociti di ratto di 3
mesi
0 2 4 6 8 0 5 10 15 20tempo d'incubazione (min)
μg/ g controllo trattato
*
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Fig 4: Effetti di una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sui livelli di CoQ10 in epatociti di ratto di 3 mesi.
I risultati rappresentano la media ± ESM di almeno sei casi. Analisi statistica (ANOVA): trattamento p<0,0039; Tempo d’ incubazione p<0,0013 (Significatività: Fisher’s test tempo 0’ vs 10, 0 vs 20, 20 vs 5); Interazione trattamento * tempo p<0,0030.
un sistema generante NADPH sui livelli di dolicolo
Il contenuto di dolicolo degli epatociti isolati non risente in maniera significativa dell’incubazione con una soluzione isoionica di mantenimento per 0’, 5’, 10’, 20’ minuti. L’incubazione con una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH, per gli stessi tempi, non determina alcun calo dei livelli del dolicolo nei primi cinque minuti. I livelli di dolicolo calano poi a velocità crescente risultando poi all’ 11% e al 46% dei controlli a 20 minuti. (Fig. 5)
Effetti di una soluzione contenente
ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sui
livelli di dolicolo
0 20 40 60 0 5 10 15 20tempo d'incubazione (min)
μg/ g controllo trattato
*
*
Fig. 5: Effetti di una soluzione contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH sui livelli di dolicolo in epatociti di ratto di 3 mesi d’età.
I risultati rappresentano la media percentuale ± ESM di almeno sei casi. Analisi statistica (ANOVA): trattamento p=0,0002; Tempo d’ incubazione p<0,0001 (Fisher’s test tempo 0 vs 20, 10 vs 20, 20 vs 5); Interazione trattamento * tempo p<0,0001.
