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8.1 REATTIVI, SOLVENTI E PRECURSORI COMMERCIALI

Acido cloridrico (37 %, Panreac): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. Acido solforico (96 %, J. T. Baker): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. Tetraidrofurano (≥ 99%, THF - J. T. Baker): usato come tale e conservato a Tamb.

Bifenile (≥ 99%, Aldrich): usato come tale senza ulteriori purificazioni e conservato a Tamb. Diclorometano (> 99,9 %, Fluka): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. Acetone (≥ 99,8 %, Carlo Erba): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. Acqua per HPLC (Sigma - Aldrich): usata come tale e conservata a Tamb.

Acido levulinico (98 %, Aldrich): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. Furfurale (> 99 %, Aldrich): usato come tale e conservato al buio a - 18 ° C.

Idrossimetilfurfurale (HMF - Fluka): usato come tale e conservato al buio a - 18 ° C. Etil levulinato (99 %, Aldrich): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. Etilen glicol (≥ 99%, Aldrich): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. 2-undecanone (99%, Aldrich): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. KHCO3 (99 %, Carlo Erba): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb. Glucosio (99 %, Aldrich): usato come tale senza ulteriori purificazioni e conservato a Tamb. Xilosio (99 %, Aldrich): usato come tale senza ulteriori purificazioni e conservato a Tamb. Arabinosio (99 %, Aldrich): usato come tale senza purificazioni e conservato a Tamb.

Galattosio (99 %, Aldrich): usato come tale senza ulteriori purificazioni e conservato a Tamb. Fruttosio (99 %, Aldrich): usato come tale senza ulteriori purificazioni e conservato a Tamb. Maltosio (99 %, Aldrich): usato come tale senza ulteriori purificazioni e conservato a Tamb. Lattosio (99 %, Aldrich): usato come tale senza ulteriori purificazioni e conservato a Tamb. H-Zeolite Beta, CP 811C-300 in polvere (Codice IED: 20733/21F): conservata a temperatura ambiente ed usata dopo trattamento termico a 510 °C per 2 ore.

H-Zeolite Y, CBV 720 in polvere (Codice IED: 20745/49): conservata a temperatura ambiente ed usata dopo trattamento termico a 510 °C per 2 ore.

H-Zeolite ZSM-5, PZ-2/25 H in polvere (Codice IED: 20552/97): conservata a temperatura ambiente ed usata dopo trattamento termico a 510 °C per 2 ore.

H-Zeolite ZSM-5, PZ-2/50 H in polvere (Codice IED: 20552/95): conservata a temperatura ambiente ed usata dopo trattamento termico a 510 °C per 2 ore.

8.2 STRUMENTAZIONE

8.2.1 HPLC

Per le determinazioni HPLC (High Performance Liquid Chromatography) di acido levulinico, furfurale, glucosio, xilosio e arabinosio è stata utilizzata una piattaforma HPLC Perkin Elmer Flexar Isocratica equipaggiata con:

- colonna POLYPORE CA la cui fase stazionaria è costituita da polistirene reticolato solfonato all’8 % (lunghezza 220 mm, diametro interno 4,6 mm, spessore del film 10

µm);

- pompa con testa di pompaggio singola; - iniettore manuale Flexar con loop da 20 µm; - detector a indice di rifrazione differenziale Flexar; - forno per colonna Perkin Elmer serie 2000;

- programma di acquisizione CHROMERA ver. 2.0.3.1496; - degasatore Perkin Elmer Flexar Solvent Manager.

8.2.2 GC

Le analisi gas-cromatografiche per la determinazione dell’acido levulinico sono state effettuate utilizzando un gas-cromatografo Perkin Elmer, modello AUTOSYSTEM XL, fornito di un rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID); la colonna capillare utilizzata è una ZB - WAX la cui fase stazionaria è costituita al 100 % da polietilenglicol (lunghezza 30 m, diametro interno 0,32 mm, spessore del film 0,50 µm). È stato impiegato l’elio come gas di trasporto. La separazione dell’acido levulinico è stata effettuata per mezzo del seguente programma di temperatura:

- temperatura iniziale 55 °C per 15 minuti;

- rampa di temperatura: riscaldamento 10 °C / min; - temperatura finale 200 °C per 10 minuti.

Le analisi gas-cromatografiche per la determinazione dell’etil levulinato, dell’etilen glicol e del rispettivo chetale (ElEgK) sono state effettuate utilizzando un gas-cromatografo DANI GL 1000, fornito di un rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID); la colonna capillare utilizzata è

una DN-5 la cui fase stazionaria è costituita dal 95 % di dimetilpolisilossano e dal 5 % di fenilpolisilossano (lunghezza 30 m, diametro interno 0,25 mm, spessore del film 0,25 µm). È stato impiegato un flusso di 1,4 ml / min di azoto come gas di trasporto.

La separazione del ElEgK dall’acido levulinico e dal bifenile (standard interno) è stata effettuata adottando il seguente programma di temperatura:

- temperatura iniziale 70 °C per 1 minuto;

- rampa di temperatura: riscaldamento 20 °C al minuto; - temperatura finale 250 °C per 5 minuti.

8.2.3 GC-MS

Le analisi GC-MS (Gas Cromatograhy - Mass Spectrometry) sono state effettuate per verificare la purezza dei reagenti e dei prodotti coinvolti nella reazione di chetalizzazione tra l’etilen glicol e l’etil levulinato. Lo strumento utilizzato è un Hewlett - Packard HP 6890 equipaggiato con detector MSD HP 5973 e con colonna Phenonex Zebron la cui fase stazionaria è costituita al 100 % da dimetilpolisilossano (lunghezza 30 m, diametro interno 0,25 mm, spessore del film 0,25 µm). È stato impiegato l’elio come gas di trasporto.

8.2.4 Spettroscopia UV - Visibile

La determinazione quantitativa del furfurale è stata eseguita mediante spettroscopia di assorbimento UV - Visibile: le analisi sono state effettuate a temperatura ambiente con uno spettrofotometro a doppio raggio JASCO V - 530. La gestione dello strumento è affidata ad un programma V - 500 MANAGER.

8.2.5 Spettroscopia 1H-NMR

La determinazione della quantità di ElEgK presente nel grezzo di reazione è stata determinata mediante spettroscopia 1H-NMR condotta a temperatura ambiente per mezzo di uno spettrometro Varian Gemini VXR-300 operante a 300 MHz su soluzioni dei campioni in CDCl3 (standard interno TMS).

8.2.6 Reazioni in microonde

Le biomasse sono state convertite in acido levulinico, furfurale e carboidrati mediante un sistema a microonde CEM Discover S - Class. Lo strumento impiegato in questo lavoro di tesi è rappresentato in figura 1. Il sistema, che sfrutta la produzione di potenza continua (valori compresi tra 0 e 300 W), impiega la tecnologia Power Max: è in grado di raffreddare e riscaldare contemporaneamente il reattore, con un controllo della potenza automatizzato basato sulla risposta della temperatura. Il controllo della temperatura è effettuato mediante un sensore di temperatura a infrarossi. Il raffreddamento del reattore è effettuato mediante aria.

Lo strumento permette di operare in due modalità: nella prima si imposta la temperatura finale desiderata e lo strumento modifica la potenza per raggiungere il valore desiderato; nella seconda metodologia si imposta una potenza desiderata a cui lo strumento lavora costantemente.

Lo strumento è dotato di una sorgente di microonde, di un applicatore e di una cavità che contiene il campione, che alloggia in un apposito vial. Il reattore impiega una cavità single - mode che garantisce una

distribuzione omogenea e consistente dell’energia su tutto il sistema, permettendo di ottenere condizioni altamente riproducibili ed evitando hotspots nella miscela di reazione [1].

Figura 2 - Sistema CEM Discover S - Class.

Figura 2 - Applicatore per microonde CEM in single-mode con autoregolazione.

Lo strumento è altamente flessibile, grazie alla cavità circolare di cui dispone, che permette l’autoregolazione ottimale dell’applicatore al variare delle quantità e delle proprietà fisiche del campione (polarità e proprietà conduttive) (Fig. 2).

L’uso delle microonde permette di trasferire direttamente l’energia alle molecole presenti nel mezzo di reazione, in modo da ottenere, a differenza dai tradizionali sistemi di riscaldamento basati sulla conduzione, un rapido incremento della temperatura e una minore degradazione termica di reagenti e prodotti [2 ]. Il risparmio energetico derivante dall’uso dei sistemi a microonde rispetto ai sistemi tradizionali di riscaldamento è quindi rilevante.

8.3 DETERMINAZIONI ANALITICHE

8.3.1 Determinazione di emicellulosa, cellulosa, lignina e ceneri nelle materie prime

Le determinazioni analitiche dell’emicellulosa, cellulosa, lignina e ceneri nelle materie prime oggetto di questa tesi di laurea sono state effettuate dai ricercatori del Dipartimento di Agraria dell’Università di Pisa secondo quanto riportato nella metodica di riferimento [3].

8.3.2 Determinazione contemporanea di furfurale, acido levulinico e carboidrati

Tutte le determinazioni quantitative di acido levulinico, furfurale e carboidrati riportate nel presente lavoro di tesi sono state determinate mediante HPLC.

È stata necessaria una accurata messa a punto della metodologia di analisi per ottenere la miglior risoluzione cromatografica possibile. È stata variata la fase eluente, la temperatura del forno, il flusso e la diluizione ottimale da effettuare sull’idrolizzato iniettato in colonna. In particolare le condizioni ottimali utilizzate sono:

- fase mobile costituita da una soluzione acquosa acida per H2SO4 0,005 M; - temperatura del forno 60 °C;

- flusso 0,1 ml / min;

- 2 g di idrolizzato sono portati ad un volume di 10 ml con la fase eluente; - tempo di acquisizione 60 minuti.

- glucosio 14,72 min; - xilosio 15,91 min; - arabinosio 17,98 min; - acido levulinico 21,25 min; - furfurale 52,67 min.

Al termine della reazione la miscela viene rapidamente raffreddata, centrifugata e filtrata per la separazione del residuo solido; si prelevano 2 g di idrolizzato e si portano a 10 ml con la soluzione di acido solforico 0,005 M; la soluzione viene ultra filtrata e 20 µl vengono iniettati in HPLC. Per la determinazione quantitativa di ogni prodotto è stata costruita una retta di calibrazione a partire da soluzioni standard a concentrazione nota di acido levulinico, furfurale, glucosio, xilosio e arabinosio.

8.3.3 Determinazione dell’acido levulinico

Nella prima parte del presente lavoro di tesi la determinazione quantitativa dell’acido levulinico nell’idrolizzato è stata effettuata mediante analisi gas-cromatografica utilizzando un gas-cromatografo Perkin Elmer, modello AUTOSYSTEM XL, fornito di un rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID). La separazione dell’acido levulinico è stata effettuata per mezzo di uno specifico programma di temperatura (temperatura iniziale 55 °C per 15 minuti, rampa di temperatura: riscaldamento 10 °C / min, temperatura finale 200 °C per 10 minuti) e la sua determinazione è stata effettuata con il metodo della standardizzazione interna. Come standard interno è stato impiegato il tetraidrofurano (THF).

8.3.4 Determinazione del furfurale

Nella prima parte del presente lavoro di tesi la determinazione quantitativa del furfurale è stata condotta utilizzando la spettrofotometria UV - Vis a 280 nm [4]. È stata costruita una retta di calibrazione assorbanza / concentrazione a partire da soluzioni standard di furfurale a concentrazione nota. Si prepara una soluzione madre all’ 1 % w/v del campione proveniente dalla reazione di idrolisi e, a partire da questo, una soluzione diluita; generalmente una diluizione di 5 - 15 volte a partire dalla soluzione madre fornisce dei valori di assorbanza che rientrano nei valori della retta di calibrazione. Si procede alla lettura dell’assorbanza della

soluzione a concentrazione di furfurale incognita alla lunghezza d’onda fissa di 280 nm. Utilizzando una retta di calibrazione costruita sulla base degli standard, nota l’assorbanza del campione incognito a 280 nm, si risale alla concentrazione di furfurale nella soluzione diluita del campione incognito.

8.3.5 Determinazione del chetale

La determinazione quantitativa dell’etil levulinato, dell’etilen glicol e del ElEgK è stata effettuata mediante analisi gas-cromatografica utilizzando un gas-cromatografo DANI GL 1000 fornito di un rilevatore a ionizzazione di fiamma. La separazione dell’etil levulinato dal ElEgK e dallo standard interno è stata effettuata per mezzo di uno specifico programma di temperatura (temperatura iniziale 70 °C per 1 minuto, rampa di temperatura: riscaldamento 20 °C / min, temperatura finale 250 °C per 5 minuti); la determinazione del ElEgK è stata effettuata con il metodo della standardizzazione interna. Come standard interno è stato impiegato il bifenile. In figura 3 è riportato un tipico cromatogramma ottenuto: il primo picco è quello del solvente utilizzato (tetraidrofurano).

La quantità di ElEgK presente in un grezzo di reazione è stata determinata mediante spettroscopia 1H-NMR.

BIBLIOGRAFIA

1. R. G. Giguere, T. L. Bray, S. M. Duncan, Tetrahedron Lett., 1986, 27, 4945-4948. 2. R. Gedye, F. Smith, K. Westaway, H. Ali, Tetrahedron Lett., 1986, 27, 279-282. 3. P. J. Van Soest, J. B. Robertson, B. A. Lewis, J. Dairy Sci., 1991, 74, 3583-3597. 4. H. D. Mansilla, J. Baeza, G. Maturana, Bioresource Technol., 1998, 66, 189-193.