Capitolo 4

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Capitolo 4

Materiali e metodi.

Gli esperimenti effettuati nel seguente lavoro hanno interessato tre specie già assuefatte alle condizioni microambientali del vaso di coltura in vitro. Le specie utilizzate sono l’ MM106, l’ MRS2/5 ed il BA29. Per ogni specie studiata è stato utilizzato uno specifico substrato di crescita; rispettivamente:

• Per l’ MM106 ed il BA29 il (DKW) ( Driver and Kuniyuki [61], 1984); • per l’ MRS2/5 il Murashige & Skoog, che è stato il primo substrato ad

essere impiegato per la micropropagazione delle specie arboree da frutto (Murashighe , Skoog , [62], 1962)

Gli stessi substrati sono stati modificati nel loro bilancio ormonale (auxina/citochinina) in relazione al tipo di risposta fotomorfogenica che si doveva indurre nei germogli.

Il pH è stato aggiustato a 5.2 prima di aggiungere Agar (Fluka) alla concentrazione di 6 gr/l e dell’autoclavazione a 120°C per 20 minuti. All’interno della camera di crescita il fotoperiodo applicato è stato di 16 ore e la temperatura aveva un valore di 23 °C (±1°C). Gli esperimenti avevano durata di 30 giorni.

1) MM106.

È un portinnesto clonale del melo ottenuto dalla collaborazione di due Istituti di ricerca inglesi, East Malling e John Innes a Merton (Valli, 2004). Come portinnesto ha la capacità di ridurre la taglia delle piante anche del 30% rispetto al franco; è mediamente vigoroso, con un apparato radicale sviluppato che garantisce un ottimo ancoraggio degli alberi e una precoce messa a frutto.

2) MRS2/5.

È un portinnesto clonale delle drupacee, ottenuto da libera impollinazione del mirabolano (Prunus cerasifera) dal Dipartimento di Coltivazione e Difesa delle Specie Arboree dell’Università di Pisa. Induce buona produttività e una migliore colorazione del frutto.

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3) BA29.

È il portinnesto del pero selezionato da cotogno di Provenza presso l’ INRA da Angers (Valli, 2004). Su questa specie abbiamo ottenuto i risultati più importanti, considerando che è una coltura che tende a differenziare radici avventizie in vivo sulla pianta madre, mentre in vitro è molto difficile ottenere una radicazione soddisfacente.

4.1. Qualità di luce saggiate.

Per l’esecuzione dei diversi esperimenti sono state utilizzate le seguenti qualità di luce: bianca (controllo), rossa, blu, gialla, verde e buio. Le prove sono state condotte con periodi di esposizione variabili in camere di crescita appositamente predisposte col tipo di luce interessato. Le diverse qualità di luce sono state ottenute utilizzando tubi fluorescenti di tipo Philips TLD, in particolare:

• Per la luce bianca TLD 18W/33; • Per la luce rossa TLD 18W/18;

• Per la luce blu sono stati utilizzati tubi fluorescenti tipo TLD 18W/15; • Per la luce gialla sono stati utilizzati tubi fluorescenti tipo TLD 18W/16 • Per la luce verde TLD 18W/17

L’intensità luminosa è stata misurata utilizzando un Quantum Sensor Li-COR 1800. L’ intensità luminosa applicata è di 20± 2 mol m-2 s-1.

4.2 Esperimenti effettuati.

Lo scopo della tesi, come si è ampiamente detto in precedenza, era quello di valutare l’influenza di diverse qualità della luce sulla radicazione dei germogli delle specie in esame.

4.2.1 Esperimenti condotti su MM106.

Le luci utilizzate su questa specie erano due: rossa e blu il cui effetto veniva comparato a quello del buio e della luce bianca impiegata come controllo. In alcuni esperimenti i germogli sono stati coltivati singolarmente in provette di vetro (30x160mm), in altri esperimenti, invece, si è preferito utilizzare contenitori di vetro da 250 ml contenenti 60 ml di substrato e 10 germogli ciascuno. Gli esperimenti sono stati pianificati in modo da valutare gli effetti:

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m-2 s-1) ad intensità diversificate (10 e 50 mol m-2 s-1 );

2. dell’applicazione delle suddette luci per tutto il periodo di radicazione o

soltanto per 3, 6 e 9 giorni e successivo trasferimento alla luce bianca; 3. dell’applicazione contemporanea della luce rossa e blu ad intensità diverse

4.2.1.a Esperimento 1.

Obiettivo: valutare l’effetto che le singole luci rossa e blu (in continuo) ed il buio (in continuo) hanno sulla radicazione dei germogli rispetto alla luce bianca (controllo). Ogni prova si avvale di 15 ripetizioni, poiché i germogli sono posti in provette singolarmente.

I germogli sono stati sottoposti ai seguenti trattamenti luminosi:

• Luce bianca(BI)

• Luce rossa (RO) • Luce blu ( BLU) • Buio (BU)

Ciascun trattamento era rappresentato da 15 germogli omogenei coltivati singolarmente in provette da 30x160 mm e coperti da tappo di alluminio.

4.2.1.b. Esperimento 2

Obiettivo: valutare l’effetto sulla radicazione dei germogli di due intensità di luce rossa, 20 e 10 µmolm-2s-1, per periodi di esposizione oscillanti tra 3 e 6 giorni.

• Luce bianca (BI)

• Luce rosso continuo (RO)

• Luce rossa 3 giorni con intensità di 20 µmolm-2_s-1_(R3 20) • Luce rossa 6 giorni con intensità di 20 µmolm-2_s-1 _(R6

20) • Luce rossa 3 giorni con intensità di 10 µmolm-2_s-1_(R3

10) • Luce rossa 6 giorni con intensità 10 µmolm-2_s-1_{( R6}

10)

Ciascun trattamento era rappresentato da 15 germogli omogenei coltivati singolarmente in provette da 30x160 mm e coperti da tappo di alluminio. Dopo i vari trattamenti le colture sono state trasferite sotto luce bianca.

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4.2.1.c Esperimento 3.

Obiettivo: valutare l’ effetto che la luce rossa a diverse esposizioni ( in continuo, 3 giorni, 6 giorni) ha sulla radicazione dei germogli rispetto alla luce bianca ( controllo).

• Luce bianca continua a (BI) • Luce rossa continua (RO) • Luce rossa 3 giorni (R3) • Luce rossa 6 giorni (R6)

4.2.1.d Esperimento 4.

Obiettivo: valutare l’effetto sulla radicazione della luce rossa con le stesse modalità dell’esperimento precedente e del buio ( continuo, 3 giorni, 6 giorni) rispetto alla luce bianca ( controllo).

• Luce bianca continua (BI); • Luce rossa continua ( RO); • Luce rossa 3 giorni (R3); • Luce rossa 6 giorni (R6); • Buio continuo (BU); • Buio 3 (BU3); • Buio 6 giorni (BU6).

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Obiettivo: valutare l’effetto sulla radicazione della luce rossa e del buio a diverse esposizioni (continuo, 3 , 6, 9 giorni) e successivo passaggio in camera di crescita a luce bianca .

• Luce bianca continua (BI); • Luce rossa continua (RO); • Luce rossa 3 giorni (R3); • Luce rossa 6 giorni (R6); • Luce rossa 9 giorni (R9); • Buio continuo (Bu); • Buio 3 (BU3); • Buio 6 giorni (BU6); • Buio 9 giorni (BU9).

I germogli sono coltivati in contenitori di vetro da 250 ml in gruppi da 10

4.2.1.g Esperimento 6.

Obiettivo: valutare l’effetto sulla radicazione dell’azione combinata della luce bianca e luce rossa, rispetto alla luce bianca continua (controllo), utilizzando intensità diverse 20 e 50 µmolm-2s-1. I germogli sono stati allevati in provetta singolarmente e per ogni prova si hanno 15 ripetizioni.

I germogli sono stati sottoposti ai seguenti trattamenti luminosi: le prove con 20 µmolm-2_s-1 _{le combinazioni sono state:}

• 10 µmolm-2_s-1 _{bianco + 10 µmolm}-2_s-1 _{rosso (BI}

10 + RO10) • 15 µmolm-2_s-1 _{bianco + 5 µmolm}-2_s-1 _{rosso (BI}

15 + RO5) le prove con 50 µmolm-2_s-1 _{le combinazioni sono state:}

• 40 µmolm-2_s-1 _{bianco + 10 µmolm}-2_s-1 _{rosso (BI}

40 + RO10) • 45 µmolm-2_s-1 _{bianco + 5 µmolm}-2_s-1 _{rosso (Bi}

45+ R5) • luce bianca continua (BI)

Ciascun trattamento era rappresentato da 15 germogli omogenei coltivati singolarmente in provette da 30x160 mm e coperti da tappo di alluminio.

In tutti gli esperimenti, al termine del periodo di radicazione, sono stati effettuati i seguenti rilievi:

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• Numero di germogli radicati • Numero di radici per germoglio • Lunghezza dei germogli

I dati sono stati sottoposti ad analisi della varianza (ANOVA). Per il calcolo dei germogli radicati negli esperimenti 1, 2, 3, 4 e 6, è stato applicato il metodo statistico del X2.

4.2.2 Esperimenti condotti su MRS2/5.

Come l’ MM106, anche l’MRS2/5 è una specie molto conosciuta nel campo della micropropagazione, quindi non difficile da gestire nelle diverse fasi. Gli esperimenti condotti su questa specie hanno messo in evidenza, oltre agli effetti indotti sulla radicazione dalla luce rossa e blu, anche quelli da parte della luce verde e gialla, luci il cui effetto fotomorfogenico è pressoché sconosciuto.

L’ intensità luminosa è 20 µmolm-2_s-1_.

Obiettivo: valutare l’effetto sulla radicazione della luce rossa, gialla e verde e del buio in continuo applicate per soli 6 giorni, rispetto alla luce bianca continua (controllo).

• Luce bianca continua (BI); • Luce rossa continua (RO); • Luce rossa 6 giorni a (R6); • Luce gialla continua (GI); • Luce gialla 6 giorni (G6); • Luce verde continua (VE); • Luce verde 6 giorni (V6); • Buio 6 giorni (BU6).

I germogli coltivati in contenitori di vetro da 250 ml. In ogni vaso sono stati inseriti 10 germogli. Per ogni prova sono state utilizzate tre ripetizioni (vasi). Al termine delle prove di radicazione sono stati effettuati i seguenti rilievi:

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4.2.3 Esperimenti condotti su BA29.

Gli esperimenti condotti sul cotogno BA29 erano uguali a quelli effettuati su

MRS2/5, con l’unica eccezione che su questa specie sono stati effettuati

trattamenti anche con luce blu. L’ intensità luminosa era di 20 µmolm-2_s-1_{. Il}

BA29 è sicuramente la specie, tra quelle utilizzate, più critica soprattutto per la

fase di radicazione che di solito è piuttosto bassa anche con concentrazioni di auxina elevate. Infatti la concentrazione di IBA nel substrato di radicazione era di 2mg/l rispetto a 0,06 mg/l utilizzato per le altre specie

Obiettivo: valutare l’effetto sulla radicazione della luce rossa, gialla e verde e del buio in continuo e per esposizioni di 6 giorni rispetto alla luce bianca continua (controllo).

• Luce bianca continua (BI); • Luce rossa continua (RO); • Luce rossa 6 giorni (R6); • Luce gialla continua (GI); • Luce gialla 6 giorni (G6); • Luce verde continua (VE); • Luce verde 6 giorni (V6); • Buio 6 giorni (BU6).

I germogli trattati per periodi di esposizione alle diverse luci e al buio per 6 giorni,successivamente venivano trasferiti in camera di crescita con luce bianca. I germogli sono stai allevati in contenitori da 25° ml. In ogni vaso sono stati coltivati 10 germogli. Per ogni prova sono state utilizzate tre ripetizioni.

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4.2.3.b. Esperimento 9.

Obiettivo: verificare, rispetto all’esperimento precedente, gli effetti esercitati dalle qualità di luce sulla radicazione di germogli di cotogno BA29.

• Luce bianca continua(BI); • Luce rossa continua ( RO); • Luce rossa 6 giorni (R6); • Luce gialla continua (GI); • Luce gialla 6 giorni (G6); • Luce verde continua (VE); • Luce verde 6 giorni (V6); • Luce blu continua (BLU); • Luce blu 6 giorni (BL6); • Buio 6 giorni(BU6).

Sono state applicate le stesse condizioni di crescita dello esperimento 8. In questo caso anche la luce blu è stata comparata alle altre qualità di luce.

4.5.3.c Esperimento 10.

Obiettivo: confermare i risultati dei due esperimenti precedenti.

Al termine delle prove di radicazione sono stati effettuati i seguenti rilievi: