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3. DISEGNO DELLO STUDIO
3.1 OBIETTIVO
Il presente studio si propone di verificare l’ipotesi che un campione di pazienti affetti da depressione bipolare drug-resistant presenti differenze significative in termini di valori medi plasmatici dei peptidi Aβ40 e Aβ42 o del rapporto Aβ40/Aβ42 rispetto ad una popolazione di controllo.
Obiettivo dello studio è inoltre quello di correlare il profilo psicopatologico e le caratteristiche di decorso del disturbo dei pazienti con i livelli plasmatici dei peptidi Aβ e con il rapporto Aβ40/Aβ42.
3.2 PAZIENTI E METODI
3.2.1 Pazienti
Il campione di studio è costituito da 16 pazienti (8 uomini e 8 donne, con età media di 47 ± 12.4 anni) affetti da Disturbo Bipolare tipo I o II Episodio Depressivo Maggiore con o senza comorbidità lifetime per Disturbi d’Ansia (Disturbo di Panico, Fobia Sociale, Disturbo Ossessivo Compulsivo) e con o senza sintomi psicotici in accordo con i criteri diagnostici del DSM-IV-TR (2000). La diagnosi è stata confermata con la Mini International Neuropsychiatric
Interview (MINI) (Sheehan e coll., 1998). I pazienti sono stati reclutati presso la
Clinica Psichiatrica dell’Università di Pisa I criteri di inclusione sono stati: età superiore o uguale a 18 anni, EDM con punteggio iniziale alla Hamilton Rating
Scale for Depression a 21 items (HRSD-21) superiore o uguale a 20, storia di almeno
33 triciclici (TCA) (Thase & Rush, 1997; Fava, 2003). In particolare, l’insuccesso terapeutico in soggetti con disturbo bipolare era caratterizzato da persistenza di sintomi depressivi nonostante due cicli di almeno 8 settimane, di cui un ciclo con uno o più stabilizzanti dell’umore in associazione ad un TCA (200 mg al dì di imipramina o un suo equivalente alla massima dose tollerata), ed un altro ciclo con un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina (SSRI) (40 mg al dì di fluoxetina o di un suo equivalente) combinato con uno stabilizzatore dell’umore ed un TCA. Sono stati esclusi dallo studio i pazienti con diagnosi di Abuso o Dipendenza da Sostanze negli ultimi sei mesi, i pazienti in gravidanza, i pazienti non in grado di sottoscrivere un consenso informato, i pazienti affetti da disturbi neurologici o da disturbi internistici in fase acuta o non compensati. I pazienti sono stati valutati clinicamente e, contestualmente alla valutazione clinica, è stato effettuato un prelievo ematico per la determinazione dei livelli plasmatici dei peptidi Aβ.
Sono stati reclutati inoltre 16 soggetti di controllo con anamnesi negativa per disturbi somatici, anamnesi e familiarità negativa per disturbi psichiatrici, malattie neurologiche ed abuso di sostanze, assenza di disturbi psichiatrici in atto accertata mediante intervista clinica da parte di un clinico esperto. Anche i soggetti di controllo sono stati sottoposti al prelievo di sangue venoso per la determinazione dei valori plasmatici dei peptidi Aβ.
Il protocollo di studio è stato condotto in accordo con le linee guida del Servizio Sanitario Nazionale Italiano per una buona pratica clinica e con la Dichiarazione di Helsinki. È stata ottenuta l’approvazione dal Comitato Etico dell’Università di Pisa.
Le interviste, effettuate dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dai pazienti a cui si assicurava il completo anonimato dei dati clinici ottenuti, sono state condotte da un’equipe di valutatori che ha seguito un training di preparazione
34 per la conoscenza degli strumenti da impiegare, al fine di ottenere la massima attendibilità e omogeneità delle valutazioni.
3.2.2 Caratteristiche demografiche e cliniche del campione
Il gruppo di pazienti depressi (n=16) era costituito da 8 uomini (50%) e 8 donne (50%) con un’età media di 47 (± 12.4) anni. Otto pazienti (50%) erano coniugati, 6 (37.5%) celibi/nubili, 1 era vedovo (6.3 %) e 1 divorziato (6.3%). Solo 3 pazienti erano affetti da Disturbo Bipolare I, i restanti 13 da Disturbo Bipolare II con età d’esordio di 31 (± 13.4) anni. Il numero medio di episodi affettivi pregressi era di 4 (± 2.2) episodi, 4 pazienti presentavano anamnesi positiva per tentativi di suicidio e tutti i pazienti erano stati ospedalizzati almeno una volta in precedenza. Otto pazienti (50%) presentavano comorbidità lifetime per disturbo di panico, 4 (25%) per disturbo ossessivo-compulsivo.
Due pazienti avevano uno score CGI di 5 (notevolmente ammalato), i restanti 14 di 6 (gravemente ammalato). Sulla base del punteggio alla HRSD-21, 2 pazienti soffrivano di una depressione moderata (HRSD score tra 18 e 24) mentre i restanti 14 di una depressione grave (HRSD score ≥ 25). Per quanto concerne il punteggio alla MMSE, 6 pazienti avevano uno score < 24. La durata dell’episodio depressivo in atto è stata in media di 9.3 (± 1.8) mesi con un massimo di 12 mesi e un minimo di 6.
Per esprimere il tempo di vita che i pazienti hanno trascorso in malattia è stato elaborato il parametro Durata di Malattia, ottenuto con la formula (età attuale –
età di esordio) x 100/età attuale dove età attuale è l’età al momento
dell’arruolamento nello studio mentre età d’esordio è l’età al primo episodio affettivo. Il risultato della formula è un valore in percentuale che esprime la durata della malattia bipolare standardizzata per età. I pazienti avevano in media una Durata di Malattia del 34.4% (± 18.7%).
35 Il gruppo di controllo (n=16) era costituito da 5 uomini (31.3%) e 11 donne (68.8%) di età media di 38 (± 13.3) anni. Sette soggetti erano coniugati (43.8%) e 9 celibi/nubili (56.3%).
3.2.3 Strumenti di valutazione
Sono stati utilizzati i seguenti strumenti di valutazione:
a) Modulo anamnestico (Sistema Informativo per la Documentazione dell’Assistenza Psichiatrica).
Registra i Dati Anagrafici, l’Anamnesi Familiare, Fisiologica, le Condizioni Mediche Pregresse, il Pregresso Uso di Sostanze e l’Ananmesi Psichiatrica. b) M.I.N.I. (Mini International Neuropsychiatric Interview) (Sheehan e Lecrubier, 1994). La M.I.N.I. è stata progettata come intervista strutturata breve per i disturbi psichiatrici, sia per l’Asse I del DSM-IV che per l’ICD-10. La M.I.N.I. è la capostipite di questa “famiglia”: è uno strumento breve, semplice, chiaro e facile da somministrare; nell’ultima versione (5.0.0, Agosto 1988) consente la diagnosi di 16 disturbi, 14 di asse I, un disturbo di asse II, il Disturbo Antisociale di Personalità, incluso per la sua stabilità nel tempo, per la consistenza dimostrata nei vari disturbi di personalità e per il suo impatto sulla clinica e sulla prognosi, ed il Rischio Suicidario. Richiede mediamente non più di 15 minuti per la sua applicazione e può essere utilizzata, oltre che dallo psichiatra, anche dal medico generale che abbia fatto un breve training. Nella M.I.N.I. l’attenzione è focalizzata sui sintomi attuali (con l’eccezione del disturbo bipolare, per il quale è rilevante sapere se un soggetto con un episodio depressivo in corso ha nell’anamnesi un episodio maniacale o ipomaniacale), senza domande
36 relative alla disabilità, ai rapporti con la patologia somatica e con l’uso di sostanze. La M.I.N.I. consente, come abbiamo detto, di formulare 14 diagnosi di asse I (Episodio Depressivo Maggiore, Distimia, Episodio (Ipo)Maniacale, Disturbo di Panico, Agorafobia, Fobia Sociale, Disturbo Ossessivo-Compulsivo, Disturbo Post-Traumatico da Stress, Dipendenza/Abuso alcolico, Dipendenza/Abuso di Sostanze, Disturbi Psicotici, Anoressia Nervosa, Bulimia Nervosa e Disturbo d’Ansia Generalizzata), una di asse II (Disturbo Antisociale di Personalità) e quella di Rischio Suicidario. Non è consentita la diagnosi di Distimia in presenza di una Depressione Maggiore attuale e di Disturbo d’Ansia Generalizzata in presenza di una qualsiasi altra diagnosi di disturbo d’ansia. Il periodo valutato è specificato per ciascuna diagnosi e può andare dal momento dell’intervista a tutta la vita, in rapporto a ciò che è specificamente richiesto per ogni diagnosi. La M.I.N.I. viene generalmente impiegata una sola volta, in fase di inquadramento diagnostico del paziente.
c) HRSD-21 (Hamilton Rating Scale for Depression) (Hamilton, 1960).
L’HRSD-21 è composta da 21 items; di questi, il nº 16, Perdita di peso, è suddiviso in due sub-items mutuamente esclusivi che esplorano il primo la perdita di peso riferita, l’altro quella misurata con la bilancia; anche l’item nº 18, Variazioni diurne, è suddiviso in due sub-items, il primo che esplora la presenza di variazioni diurne della sintomatologia ed il senso verso il quale vanno le eventuali variazioni (peggioramento mattutino o serale), l’altro la gravità delle eventuali variazioni. Generalmente i primi 17 items sono considerati quelli nucleari della depressione ed è su questi che di solito viene definito il cut-off di gravità che può essere così schematizzato: ≥25 depressione grave
37 8-17 depressione lieve
≤7 assenza di depressione.
La HRSD-21 è adatta per pazienti adulti con sintomatologia depressiva di qualsiasi tipo. La scala è utilizzabile nella valutazione delle variazioni della sintomatologia sotto trattamento e può essere impiegata, perciò, nella fase precedente e in quella successiva alla terapia.
d) CGI (Clinical Global Impressions) (Psychopharmacology Research Branch (PRB) del NIMH – USA) (Guy, 1976).
La CGI è stata sviluppata per uno studio di vaste dimensioni sulla schizofrenia (PRB Collaborative Schizophrenia Studies). Ha lo scopo di valutare il rapporto rischio/beneficio (cioè l’efficacia) del trattamento in pazienti psichiatrici. È applicata dallo psichiatra il quale valuta ripetutamente, nel corso del trattamento, la gravità della malattia, le sue variazioni nel tempo e l’efficacia terapeutica, cioè il rapporto fra effetto terapeutico ed effetti indesiderati. La CGI è una scala “universale” che può essere impiegata per tutte le categorie di pazienti. La CGI consiste di 3 items : i primi due sono valutati su una scala a 7 punti, oltre alla risposta “Non è stato valutato”; il terzo, l’Indice di Efficacia, è una matrice simmetrica (4x4), che prevede 16 possibili risposte in rapporto alla diversa combinazione dell’ET e degli EC (più la risposta “Non valutato”). Ciascun item è valutato separatamente. Non esiste un punteggio totale. Il periodo da prendere in considerazione è, per la Gravità della Malattia, la settimana precedente, per il Miglioramento Globale e per l’Indice di Efficacia, invece, il tempo trascorso dall’inizio del trattamento. La scala è adatta per la valutazione del decorso clinico; la Gravità della Malattia deve essere valutata nel pre-trattamento e almeno una volta nel post-trattamento; il Miglioramento Globale e l’Indice di Efficacia non devono
38 essere valutati nel pre-trattamento e devono esserlo, invece, almeno alla fine del trattamento. Sono possibili (e consigliabili) valutazioni intermedie a discrezione del clinico.
e) MMSE (Mini-Mental State Examination) (Folstein e coll., 1975). E’ un test semplificato per la valutazione delle funzioni cognitive di tutti i soggetti. Richiede soltanto 5-10 minuti per la sua somministrazione e pertanto è diventato di impiego routinario. La sua somministrazione può essere ripetuta nel tempo al fine di ottenere informazioni sull’evoluzione delle funzioni cognitive. E’ composto da 11 items suddivisi in due sezioni, una verbale ed una prestazionale. La prima sezione esplora l’orientamento (2 items), la memoria a breve termine (2 items), l’attenzione e la memoria di fissazione (1 item ciascuna); la seconda esplora, con un item ciascuna, la capacità di denominare gli oggetti, la ripetizione di frasi, l’esecuzione di comandi scritti e verbali, la scrittura spontanea di frasi con senso compiuto e la copiatura di una figura geometrica complessa. Il punteggio varia nei diversi items (0 - 1, 0 - 2, 0 - 3 e 0 - 5) in funzione della difficoltà della prestazione. Il cut-off per escludere la presenza di una compromissione cognitiva varia, in funzione dell’età e del grado di scolarizzazione, da 19 a 29.
3.2.4 Metodi di laboratorio
I pazienti che hanno accettato di partecipare allo studio e hanno sottoscritto il consenso informato sono stati sottoposti a prelievo ematico tra le ore 8 e le 10 del mattino per il dosaggio dei peptidi Abeta.
Valutazione dei livelli plasmatici di Aβ40 e Aβ42: 1 provetta con EDTA (6ml). Il campione viene centrifugato a 2500 rpm x 10 min. Il plasma viene aliquotato in eppendorf e conservato a –20°C. L’analisi dei livelli di Aβ40 e Aβ42 viene fatta
39 tramite appositi kit ELISA (Invitrogen Hu Aβ40 e Aβ42) . I campioni vengono incubati a 4°C con anticorpi anti-Aβ40 e anti-Aβ42. L’anticorpo monoclonale specifico per la regione NH2 –terminale della Aβ umana è adeso sul fondo dei pozzetti della piastra, i campioni e gli standard vengono quindi co-incubati con anticorpi di coniglio specifici per l’estremità COOH della sequenza di Aβ40 o Aβ42. Successivamente, la quota di anticorpo legata viene messa in evidenza incubando con anticorpi anti-IgG di coniglio coniugati con HRP (Horseradish
peroxidase). L’aggiunta del substrato cromogeno (TMB) determina la produzione
di colore che è direttamente proporzionale alla concentrazione di Aβ nel campione. La misura dell’ assorbanza è stata effettuata a 450nm utilizzando un lettore per piastre (Biorad). La minima concentrazione rilevabile è < 6 pg/ml per la Aβ40 e < 10 pg/ml per la Aβ42.
3.2.6 Metodi statistici
I dati raccolti sono stati registrati in un database costruito appositamente, quindi sono stati elaborati mediante un programma statistico. Il confronto tra variabili quantitative a distribuzione non gaussiana è stato condotto tramite test statistici non parametrici: in particolare, per il confronto tra campioni indipendenti è stato impiegato il test di Mann-Whitney mentre per il confronto di dati appaiati il test di Wilcoxon. Coerentemente a tutto ciò, le correlazioni tre le variabili sono state studiate tramite il coefficiente di Spearman.
Per il confronto tra le variabili categoriali (sesso) è stato utilizzato il test chi quadrato mentre il confronto tra variabili a distribuzione gaussiana (età) è stato condotto con il test T di Student per campioni indipendenti.
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando lo Statistical Package for
