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Materiali e metodi
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4. MATERIALI E METODI
4.1 Animali
Nel corso degli esperimenti, per l’isolamento delle cellule staminali mesenchimali murine (mMSCs), ho utilizzato topi wilde type (WT) e topi mutanti knock-out (KO) per l’omeogene
Otx1, appartenenti al ceppo C57B/6J. Nei topi mutanti le sequenze codificate dall’esone 1 e 2
sono state sostituite dalla sequenza codificanti il gene LacZ. La genotipizzazione è stata effettuata attraverso PCR e conseguente corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
Otx1 PRIMERS: SENSO 5’-AGCAGACACATGGAAACCTTC-3’ ANTISENSO 5’-CACTTGGGATTTTGCACCCTC-3 LacZ PRIMERS: SENSO 5-GCGTTGGCAATTTAACCGCC-3’ ANTISENSO 5’-CAGTTTACCCGCTCTGCTAC-3’
4.2 Coltura della linea cellulare MC3T3-E1
La linea cellulare murina MC3T3-E1 è un clone, non trasformato, che cresce in aderenza allo stadio di pre-osteoblasti. Le cellule sono state mantenute in coltura utilizzando flask di plastica sterile da 25 cm2, in terreno di crescita DMEM Low Glucose (“Dulbecco’s Modified
Eagle Medium 1X”, Biowest Euroclone). Il mezzo contiene glutammina stabile, bassa
concentrazione di glucosio ed è stato supplementato con il 10% di FBS (Fetal Bovine Serum). Inoltre, sono stati aggiunti gli antibiotici Penicillina e Streptomicina 1:100 per evitare possibili contaminazioni batteriche, di lieviti e muffe. Le cellule sono state incubate a 37°C in atmosfera umidificata con 5% di CO2. Il mezzo viene cambiato ogni 2-3 giorni, fino a che le
cellule non raggiungono circa il 70-80% di confluenza. A questo punto possono venir espanse mediante passaggi successivi utilizzando opportune diluizioni.
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4.3 Espansione di cellule in aderenza
Il protocollo di espansione delle cellule in aderenza prevede un lavaggio in PBS 1X, dopo la rimozione del vecchio mezzo, e alcuni minuti in incubazione a 37° con Tripsina 0,25% EDTA in PBS (Biowest). La tripsina è un enzima proteolitico appartenente alla classe delle idrolasi che ha la capacità di disgregare le connessioni cellulari e quindi ne permette il distacco dalla plastica. L’EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) è un agente chelante che aumenta l’attività della tripsina rimuovendo calcio e magnesio dalla superficie delle cellule. La reazione è poi bloccata con un volume di mezzo doppio rispetto a quello usato per la tripsinizzazione, che permette la neutralizzazione dell’enzima. La sospensione cellulare può così essere recuperata e centrifugata a 1000 RPM per 7 minuti a 37°. Dopo la centrifuga si elimina il sovranatante ed il pellet viene risospeso in un adeguato volume di mezzo completo. Le cellule possono nuovamente essere piastrate con una densità opportuna o congelate.
4.4 Congelamento e scongelamento cellulare
Le cellule sono state congelate in DMEM con il 30% di FBS in presenza del crioconservante DMSO (dimetilsulfossido) al 10%, in un volume finale di 1,5 ml e ad una concentrazione finale di circa 1x106 cellule/vial. Grazie all’azione protettrice del DMSO le cellule possono essere conservate in azoto liquido dopo averle tenute qualche giorno a -80°C.
Le cellule vengono scongelate (velocemente in un bagnetto) a 37°C per accelerare il processo ed evitare possibili danni da parte del DMSO che è tossico a temperatura ambiente. La sospensione cellulare viene immediatamente trasferita in una provetta contenente DMEN con 30% di FBS (il mezzo), e poi centrifugata a 1000 RPM per 7 minuti. Il sovranatante deve essere aspirato velocemente, per eliminare il prima possibile il DMSO, e il pellet di cellule risospeso in DMEM con 10% di FBS e le cellule sono poste nuovamente in coltura nelle opportune condizioni.
4.5 Isolamento ed espansione di cellule staminali
mesenchimali murine (mMSCs)
I topi utilizzati per l’isolamento delle mMSCs sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale, dopo di che sono state rimosse tibie e femori da cui abbiamo prelevato il midollo
4 osseo facendo passare del mezzo di coltura completo attraverso la cavità midollare mediante una siringa da insulina (0,8x40mm). Il midollo è recuperato in 2 ml di MesenCult completo dopo aver reso la sospensione cellulare omogenea facendola passare attraverso l’ago di una siringa da insulina (0,8x40mm).
Il MeseCult completo (StemCell Technologies) è un terreno minimo privo di citochine, specifico per la crescita delle mMSCs. Viene preparato aggiungendo al “MesenCult MSC Basal Medium” il “Mesenchymal Stem Cell Stimulatory Supplements”, in rapporto 1:5, contenente il 10% di siero bovino e il 10% di siero di cavallo, oltre ad altri nutrienti. Le cellule, dopo la risospensione, sono state contate con il colorante vitale Trypan Blue (Biowest). Le cellule sono state piastrate in flask T-25 cm2 con una densità di 1x106 cellule/cm2 , in 10 ml di MesenCult completo e incubate a 37°C in atmosfera umidificata con 5% di CO2. Il mezzo deve essere cambiato per metà ogni settimana e le cellule devono essere
tripsinizzate e piastrate in nuove flask di espansione una volta raggiunto il 70-80% di confluenza. Nel corso dei nostri esperimenti la densità cui abbiamo piastrato le cellule nella fase di espansione è stata 1x105 cellule /cm2. Questi passaggi sono necessari sia per espandere le mMSCs in uno stato indifferenziato che per rimuovere le cellule ematopoietiche presenti nel midollo. Infatti le mMSCs crescono in adesione mentre la componente ematopoietica cresce in sospensione.
4.6 Saggio delle colonie CFU-F
Il saggio delle CFU-F è una delle modalità d’identificazione delle MSCs in quanto queste cellule una volta messe in coltura a bassa densità sono caratterizzate dalla capacità di formare colonie di tipo fibroblastoide, dopo circa 10 giorni, ognuna delle quale originatesi per divisione di uno stesso progenitore mesenchimale. Il saggio viene effettuato nelle 6-well
plate, con due diverse concentrazioni di cellule, 5x105 e 1x106 cellule per pozzetto. Dopo essersi formate, le colonie vengono colorate con Giemsa al 5%. La colorazione prevede due lavaggi in PBS 1X e una fissazione in metanolo per 5 minuti a RT, passati i quali il fissativo viene aspirato e le colonie incubate con il Giemsa per 5 minuti. Seguono dei lavaggi con acqua e la conta delle colonie.
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4.7 Differenziazione osteogenica di mMSCs
Per il differenziamento osteogenico le cellule sono state piastrate a una densità di 2,5x104 cellule/cm2 e poi esposte agli agenti inducenti una volta raggiunto il 70-80% di confluenza. Il protocollo di differenziazione osteogenica utilizzato è stato lo stesso per ambedue le popolazioni cellulari e prevede l’aggiunta, al rispettivo mezzo di coltura degli agenti inducenti: acido ascorbico 0,5 mM (Sigma-Aldrich), dexametasone 1μM (Sigma-Aldrich), β-glicerofosfato 10mM (Sigma-Aldrich). L’acido ascorbico contribuisce a ridurre il potenziale proliferativo delle cellule a favore del loro differenziamento, il dexametasone è l’agente chimico che svolge l’azione inducente vera e propria, il β-glicerofosfato rappresenta la fonte di fosfati necessari alla mineralizzazione della matrice. Il mezzo con le sostanze inducenti è stato cambiato ogni 3-4 giorni. Le cellule sono state analizzate al tempo zero (cellule proliferanti, indifferenziate, utilizzate come controllo), ai giorni 3, 7,14 e 21 di trattamento.
4.8 Colorazione citochimica mediante Alizarin Red S
Le cellule man mano che differenziano, cambiano morfologia e si assiste alla formazione di moduli di mineralizzazione che possono essere evidenziati dalla colorazione con Alizarin Red
S (Sigma-Aldrich), un colorante che si lega alla matrice sintetizzata e secreta dagli osteoblasti
maturi grazie alla sua affinità con i cristalli di fosfato di calcio. La soluzione di Alizarin utilizzata per la colorazione è all’1% (0.25g in 25 ml di acqua) e portata a pH 4.0-4.2, mediante NaOH 1N. La soluzione così preparata può essere conservata, al buio e a RT, per 3 mesi. Il protocollo di colorazione utilizzato prevede, dopo l’eliminazione del mezzo di coltura, un lavaggio in PBS 1X e la fissazione con formalina al 10% per 1 ora a RT. Quando le cellule sono fissate, si elimina la formalina e si aggiunge il colorante che va lasciato agire per 10 minuti (preferibilmente in agitazione). Seguono dei lavaggi in acqua e poi in PBS1X per rimuovere l’Alizarin Red in eccesso. A questo punto la colorazione è pronta per essere osservata al microscopio e fotografata.
4.9 Differenziazione adipogenica di mMSCs
Per la differenziazione adipogenica le cellule sono state piastrate ad una densità di 2,5x104 cellule/cm2. Sono state espanse fino ad un 70-80% di confluenza in presenza di MesenCult®
6 completo. Successivamente sono state esposte ad agenti inducenti, disciolti ad opportune concentrazione nel mezzo di coltura dopo aver abbassato anche la concentrazione dei supplementi, in modo da limitare la proliferazione e spingere le cellule verso un destino differenziativo. Il protocollo per la differenziazione adipogenica prevede l’incubazione per un tempo di 3 giorni con il mezzo di induzione costituito da Isobutilmetilxantina 0,5 mM Aldrich), Indometacina 0,2 mM Aldrich), Dexametasone 1 μM (Sigma-Aldrich) e Insulina 0,01 M (Sigma-(Sigma-Aldrich). Successivamente, le cellule vengono coltivate con un mezzo di mantenimento in cui viene aggiunta solo l’Insulina nel mezzo di coltura. Il mezzo di mantenimento così costituito viene cambiato ogni 3-4 giorni per il resto della differenziazione. Le cellule vengono raccolte in un pellet, utilizzato poi per le analisi molecolari, a diversi giorni del trattamento: al giorno zero, corrispondente ad uno stadio indifferenziato usato come controllo, e ai giorni 3, 7, 14.
4.10 Colorazione citochimica con Oil Red
Gli adipociti che si formano in seguito all’induzione adipogenica mostrano un fenotipo facilmente riconoscibile, grazie alla presenza delle gocce lipidiche nel citoplasma. Il colorante
Oil Red (Sigma-Aldrich) mette in evidenza la presenza dei vacuoli lipidici. Per effettuare la
colorazione è necessario fare una Working Solution, costituita da tre parti di Stock Solution (Oil Red 0,4%) e due di PBS 1X. Una volta filtrata attraverso un filtro 45 μm, le cellule vengono lavate dal mezzo di coltura con il PBS1X e incubate per 40 minuti con formalina al 10%. Dopo aver fissato le cellule e eliminato la formalina viene fatto un lavaggio in PBS 1X e messo l’Oil Red. Questo colorante va lasciato agire al buio per 15 minuti a RT. Seguono dei lavaggi in acqua e poi in PBS1X per eliminare i residui del colorante. Le piastre sono così pronte per essere osservate al microscopio e fotografate.
4.11 Raccolta delle cellule per l’estrazione delle proteine
Le cellule possono essere conservate come pellet da cui estrarre DNA, RNA o proteine. Le cellule vengono staccate tramite l’uso di Tripsina 0.025% EDTA in PBS, come descritto precedentemente. In seguito a centrifugazione, il pellet viene lavato 3 volte in PBS 1X. I primi due lavaggi vengono effettuati con 5 ml di PBS 1X e la sospensione viene centrifugata7 per 7 minuti a 1000 RPM a 25°C; l’ultimo viene effettuato con 1 ml di PBS 1X e centrifugata per 10 minuti a 4500 RPM a 4°C. Dopo l’ultima centrifuga il sovranatante viene eliminato per poter conservare il pellet a -80°C. Nel corso dei miei esperimenti ho raccolto sia pellet di cellule allo stato indifferenziato che a vari time points durante la differenziazione adipogenica.
4.12 Estrazione proteica da mMSC
Dopo aver fatto i pellets ai diversi tempi della differenziazione si passa all’estrazione proteica. Ad ogni pellet vengono aggiunti 20 µl del Buffer di lisi. Il pellet viene distrutto spipettando energicamente e, se necessario, anche vortexando. Quindi viene lasciato incubare per 10’ in ghiaccio e poi a rotazione per 1 h a 4°C. A questo punto si centrifuga a 14000 RPM per 10’ a 4°C. Viene raccolto il sovranatante dove sono contenute le proteine di mio interesse, mentre il pellet, che contiene i detriti cellulari, viene eliminato. Quindi si passa alla determinazione della concentrazione proteica tramite il metodo Bradford (Sigma– Aldrich) , utilizzando un’opportuna diluizione delle mie proteine.
Buffer di lisi:
Tris-HCl pH 8.0 50mM
NaCl 150 mM
Nonidet P40 1%
Inibitore delle proteasi
H2O mq
4.13 Corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide
(SDS-PAGE)
L’SDS-PAGE permette la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare (PM). Ogni campione caricato sarà diluito con una soluzione Loading Buffer 2X e fatto bollire alla temperatura di 100°C per 10’ per favorire la denaturazione proteica.
La corsa è fatta su gel di poliacrilammide discontinuo in quanto troviamo un primo gel di impaccamento (stacking gel) che serve a compattare le proteine in un’unica banda in modo da favorire l’entrata in maniera contemporanea nel secondo gel (resolving gel) che, grazie alla
8 presenza di una maggiore quantità di acrilammide, e quindi a maglie più fitte, permette la separazione in base al PM. La corsa è realizzata con un opportuno tampone (running buffer) e con un voltaggio iniziale di 80 volts. Il voltaggio viene aumentato gradualmente fino ad arrivare a 160 volts. Loading Buffer Tris-HCl pH 6.8 1M β-mercaptoetanolo SDS 10% Glicerolo Blu di bromofenolo H2O mq Stacking gel 5% Tris-HCl pH 6.8 1.0 M Acrilammide/bis 30% SDS 10% APS 10% TEMED H2O mq Resolving gel 12% Tris-HCl pH 8.8 1.5 M SDS 10% Acrilammide 30% APS 10% TEMED H2O mq
Running buffer 5X (VTOT = 1 L) Tris base 25 mM
Glicina 250 mM
SDS 10%
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4.14 Western blot
Dopo esser state separate tramite SDS-PAGE, le proteine vengono trasferite su una membrana di polivinildifluoro (PVDF) (Sigma-Aldrich), tramite Western Blot. Questo trasferimento è possibile grazie al passaggio di corrente elettrica attraverso un “panino” montato secondo un ordine preciso: polo negativo spugna carta 3MM gel membrana di PVDF carta 3MM spugna polo positivo. La membrana deve essere prima attivata in metanolo ed equilibrata nel tampone di trasferimento. Il gel deve essere equilibrato nel tampone di trasferimento, così come la carta e la spugna. Quindi viene effettuato il blotting a 100 volts per 1h a 4°C, in quanto il passaggio di corrente determina il surriscaldamento del supporto e potrebbe causare il danneggiamento delle proteine. Dopo il blotting, per verificare l’avvenuto trasferimento, la membrana viene prelevata e colorata con il colorante di Ponceau per 5’ in agitazione, mentre il gel viene prima fissato con un’opportuna soluzione e dopo colorato over night in agitazione con il colorante di Coomassie. Dopo la colorazione, la membrana viene lavata con acqua corrente fino alla totale decolorazione. L’ultimo lavaggio viene effettuato con TBST 1% per 10’ in agitazione. A questo punto viene incubata con la blocking solution per 1 h a RT in agitazione. Seguono 3 lavaggi con 50 ml di TBST 1%, per 5’ a RT in agitazione. Viene quindi incubato l’Ab I over night a 4°C in agitazione. Il giorno seguente si effettuano 3 lavaggi con 50 ml di TBST 1%, per 10’ a RT in agitazione. Quindi si incuba la membrana per 1 h a RT in agitazione con Ab II. Seguono 3 lavaggi con 50 ml di TBST 1% a RT in agitazione, un ultimo lavaggio verrà effettuato in TBS. Il rilevamento delle bande di nostro interesse è possibile grazie all’azione della perossidasi con la quale è coniugato l’Ab II. Il substrato della perossidasi è il luminolo che è contenuto nell’ECL. L’ECL viene preparato al momento, viene posto sulla membrana e viene lasciato agire per 5’ a RT al buio. A questo punto è possibile impressionare la lastra fotografica posta in un’opportuna camera con la membrana. L’energia liberata dalla reazione catalizzata dalla perossidasi determina la precipitazione dell’argento metallico della lastra con conseguente annerimento della stessa dove l’Ab II si è legato. La lastra viene quindi sviluppata e fissata con opportune soluzioni (Kodak) .
Buffer di trasferimento (VTOT= 1 L) Tris base 25mM
Glicina 190 mM
Metanolo 20%
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Tris base 50 mM
NaCl 200 mM
TBST
TBS+ 1% Tween 20
Blocking solution (VTOT= 10 mL)
TBST + 1% BSA+ 5% milk
Soluzione Ab I α-Otx1 (AF 1356, R&D, 200µg/ml)
TBST+ 2.5% BSA+ Ab I (diluizione 1:500)
Soluzione Ab II rabbit α-goat HRP (A5420-1ML, Sigma-Aldrich)
TBST+ 1% BSA + Ab II (diluizione 1:3000)
Blocking solution per β-tubulina (VTOT= 10 mL)
TBST+5% milk+1% BSA
Soluzione Ab I α- β-tubulina (T5201, Sigma- Aldrich, 2.0 mg/ml)
TBS+2.5% BSA+ Ab I (diluizione 1:800)
Soluzione Ab II goat α-mouse HRP (A4416, Sigma)
TBS+ 0.1% Tween20+1%milk+ Ab II (diluizione 1:4000)
ECL(SuperSignal ®West Pico Trial Kit, Thermo Scientific)
1ml H2O2 + 1 ml luminolo
4.15 Immunocitochimica
Per effettuare i saggi di immunocitochimica, vengono piastrate 30000 cellule per vetrino sterile (22x22) posto all’interno di un disco Petri 35 mm X 10 mm. Vengono analizzati diversi time points della differenziazione osteogenica, indifferenziate, 7g, 14g, 2g, 28g giorni. Una volta raggiunto lo stato di nostro interesse, le cellule vengono private del mezzo di coltura e vengono lavate con 1.5 ml di PBS 1X per un paio di volte. Quindi le cellule vengono fissate con la fixing solution per 40’, a RT al buio. Si procede con 3 lavaggi con 1.5 ml di PBS 1X da 10’ a RT in agitazione. Quindi vengono incubate con la blocking solution per 40’ a RT in agitazione. La blocking solution serva a bloccare i siti aspecifici e allo stesso tempo a
11 permeabilizzare la membrana in modo da favorire l’ingresso dell’Ab e del DAPI. Dopo la soluzione di bloccaggio viene incubato l’Ab I, con un’opportuna diluizione, O/N a 4°C in una camera umida. Il giorno seguente vengono effettuati 3 lavaggi con 1.5 ml di PBS 1X a RT in agitazione. Viene quindi incubato l’Ab II, con un’opportuna diluizione, per 1h a RT in agitazione al buio. Seguono 3 lavaggi da 1.5 ml di PBS 1X per 10’ a RT in agitazione al buio. Si aggiunge quindi il DAPI working solution (600 nM) per colorare il nucleo, per 15’ a RT in agitazione al buio. Si lava 2 volte con 1.5 ml di PBS 1X per 10’ a RT in agitazione al buio. A questo punto viene montato il vetrino contenente le cellule su un vetrino da microscopio tramite DPX Mountant for histology (Fluxa), si analizza e fotografa al microscopio a fluorescenza (Zeiss OBSERVER.Z1, AxioCam MRc5,Software AxioVision 4.6).
Fixing solution
PBS 1X+ 4% formaldeide
Blocking solution
PBS 1X+ 0.3% Triton X-100+ 2.5% BSA
Soluzione AbI goat anti-Otx1 (AF 1356, R&D, 200µg/ml)
PBS 1X+ Ab I (diluizione 1:20)
Soluzione AbI goat anti-Runx2 (AF 2006, R&D, 200µg/ml)
PBS 1X + AbI (diluizione 1:20)
Soluzione AbI mouse anti-Alkaline Phosphatase (MAB 1448, R&D, 250µg/ml)
PBS 1X + AbI (diluizione 1:25)
Soluzione AbI mouse anti-Osteocalcin (MAB 1419, R&D, 200µg/ml)
PBS 1X + AbI (diluizione 1:20)
Soluzione AbII donkey anti-goat IgG-FITC (sc-2024, Santa Cruz Biotechnology, 200µg/ 0.5 ml)
BS 1X+ Ab II (diluizione 1:100)
Soluzione AbII goat anti-mouse IgG-Rho (R6392, Invitrogen, 200µg/ml)
