Capitolo 3
Materiali e Metodi
3.1 Curve di calibrazione
3.1.1 Curva di calibrazione Fluoresceina isotiocianato destrano (FD-4)
La curva di calibrazione per l’FD-4 è stata costruita leggendo l’intensità di
fluorescenza emessa dal probe (EnSpire 2.300 Multilabel Reader) (Figura 13).
L’FD-4 è stato opportunamente diluito a concentrazioni nel range 10-9M-
3.1.2 Curva di calibrazione Rodamina 123 (Rho 123)
La curva di calibrazione per la Rho123 è stata costruita leggendo l’intensità di
fluorescenza emessa dal probe (dell’EnSpire 2.300 Multilabel Reader). La
Rho123 è stata opportunamente diluita a concentrazioni nel range 10-9M-10-3
3.2 Sperimentazione ex-vivo: Everted Gut Sac (EGS)
3.2.1 Allestimento
Per il protocollo sperimentale sono stati utilizzati ratti albini del ceppo Wistar
Kyoto del peso di 300-450g di sesso maschile (Figura 14).
Gli animali vengono allevati all’interno di uno stabulario secondo norme ben
precise: vivono in gabbie dalle dimensioni adeguate, in cui possono muoversi
liberamente. Cibo e acqua a loro disposizione sono ad libitum. Vengono inoltre
esposti a cicli regolarmente alternati di luce/buio di 12 ore ciascuno.
La sperimentazione è stata portata avanti in conformità con la normativa
comunitaria (Direttiva CEE 63/2010), recepita con il Decreto Legislativo 4
Marzo 2014 n°26 “Attuazione della direttiva 2010/63/UE sulla protezione degli
animali utilizzati a fini scientifici”.
Per il protocollo sperimentale utilizzato, i ratti sono stati messi a digiuno per
24 ore. Il sacrificio dell’animale è stato effettuato con un’overdose di
pentobarbitale sodico, somministrato per via intraperitoneale. L’espianto
dell’organo è stato effettuato praticando un primo taglio circa 5cm al di sotto
del piloro, quindi, estratto delicatamente l’intestino tenue, è stato eseguito il
secondo taglio pochi centimetri prima della valvola ileo-cecale. In tal modo
l’intestino prelevato comprenderà le tre porzioni del tenue: duodeno, digiuno e
ileo. Dopo l’asportazione, l’organo è stato immerso immediatamente in un
becker contenente Krebs, soluzione tampone a pH 7,4, precedentemente
saturata con carbogeno (95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica) e
mantenuta ad una temperatura di 37°C per mezzo del bagnomaria; procedura
effettuata con lo scopo di assicurare la vitalità dell’organo durante la sua
toelettatura.
La soluzione salina di Krebs utilizzata presenta la seguente composizione:
Glucosio 0,012 M NaCl 0,118 M KCl 0,005 M MgSO4 x 2 H2O 0,0012M CaCl2 x 2 H2O 0,0025M KH2PO4 0,0012M
Successivamente si è passati alla fase di toelettatura dell’intestino, per
rimuovere tutto il materiale fecale presente all’interno del lume intestinale e il
tessuto adiposo esterno.
Durante tutte le fasi della toelettatura, l’organo è stato immerso il più
frequentemente possibile in soluzione di Krebs carbogenata e mantenuta a
37°C, così da mantenerlo vitale.
In seguito l’intestino è stato rovesciato facendo uso di un’asta di acciaio in
modo tale da esporre esternamente il lato mucosale, ed internamente il lato
serosale. L’organo è stato quindi riempito con soluzione di Krebs carbogenata
Figura 14. Fase di riempimento dell’intestino con soluzione di Krebs
Successivamente si è provveduto alla preparazione dei sacchettini, ognuno dei
quali lungo 3cm e contenente circa 800 µL di soluzione di Krebs. I sacchettini
sono stati immersi in falcon contenenti 30mL di soluzione di Krebs carbogenata
a 37°C (Figura 15). In tali condizioni i preparati hanno una vitalità di circa 3
ore (Figura 16).
Figura 15. Preparati immersi in una falcon contenente soluzione di Krebs
3.2.2 Time course di Rodamina 123
I preparati sono stati immersi in soluzione di Krebs medicata con Rho123 1µM
o Rho123 10µM, quindi sono stati effettuati i prelievi al tempo 0, a 10 minuti,
a 30 minuti, a 60 minuti e a 90 minuti. Il prelievo è stato eseguito praticando
con delle forbici un taglio a livello di una estremità del sacchetto, e svuotando
il suo contenuto all’interno di una eppendorf. Lavorando sempre al buio, sono
state eseguite le letture spettrofluorimetriche all’Enspire allo scopo di
quantificare l’assorbimento di Rho123 a livello intestinale. La quantità di
Rho123 assorbita, è stata espressa come percentuale rispetto a quella presente
3.2.3 Time course di Rodamina 123 in presenza di Verapamil (Ver)
I preparati intestinali sono stati immersi in falcon contenenti 30mL di soluzione
di Krebs medicata secondo lo schema di seguito riportato:
1) Soluzione di Krebs contenente Rho123 1µM;
2) Soluzione di Krebs contenente Rho123 1µM+Ver 100µM;
3) Soluzione di Krebs contenente Rho123 10µM;
4) Soluzione di Krebs contenente Rho123 10µM+Ver 100µM.
Sono stati effettuati i prelievi a 10 minuti e a 60 minuti e successivamente sono
3.2.4 Curva concentrazione-risposta con Verapamil
I preparati intestinali sono stati immersi in falcon contenenti 30mL di una
soluzione di Krebs medicata con Rho123 10µM in presenza di concentrazioni
crescenti di Ver (1µM, 10µM, 30µM, 100µM e 300µM) o del suo veicolo
(DMSO 1%). Sono stati effettuati i prelievi a 90 minuti e successivamente sono
3.2.5 Curva concentrazione-risposta con Ciclosporina A (CsA)
I preparati intestinali sono stati immersi in falcon contenenti 30 mL di una
soluzione di Krebs medicata con Rho123 10µM in presenza di concentrazioni
crescenti di CsA (5µM, 10µM, 50µM e 100µM) o del suo veicolo (DMSO 1%).
Sono stati effettuati i prelievi a 90 minuti e successivamente sono state eseguite
3.2.6 Curva concentrazione-risposta con MV194
I preparati intestinali sono stati incubati in 8 falcon, ognuna contenente 30mL
di una soluzione 10µM di Rho123. La prima falcon contenente esclusivamente
il veicolo (DMSO 1%), la seconda medicata con Ver300µM (concentrazione
determinata mediante la cumulativa del Verapamil a 90 minuti), le altre 6
medicate con concentrazioni crescenti di MV194 (1nM, 0,01µM, 0.1µM, 1µM,
10µM, 100µM). Sono stati effettuati i prelievi a 90 minuti e successivamente
3.2.7 Curva concentrazione-risposta con MV75
I preparati intestinali sono stati incubati in 8 falcon, ognuna contenente 30mL
di una soluzione 10µM di Rho123. La prima falcon contenente esclusivamente
il veicolo (DMSO 1%), la seconda medicata con Ver300 µM, le altre 6
medicate con concentrazioni crescenti di MV75 (1nM, 0,01µM, 0.1µM,1µM,
10µM, 100µM). Sono stati effettuati i prelievi a 90 minuti e successivamente
3.2.8 Curva concentrazione-risposta con MV400
I preparati intestinali sono stati incubati in 8 falcon, ognuna contenente 30mL
di una soluzione 10µM di Rho123. La prima falcon contenente esclusivamente
il veicolo (DMSO 1%), la seconda medicata con Ver 300µM, le altre 6
medicate con concentrazioni crescenti di MV400 (0,01nM, 0,1nM, 1nM,
0,01µM, 0,1µM, 1µM, 10µM, 100µM). Sono stati effettuati i prelievi a 90
3.3 Sostanze
Rodamina 123 (Rho123): (Sigma-Aldrich), probe fluorescente noto in
letteratura per essere un substrato della PgP, viene rilevato con tecnica
spettrofluorimetrica ad una lunghezza d’onda di eccitazione di 500nM e
una lunghezza d’onda di emissione di 525nM.Lavorando al buio, è stato
solubilizzato in DMSO ad una concentrazione madre di 10-2M e
successivamente sono state effettuate le diluizioni utilizzando acqua
bidistillata. Le aliquote di soluzione madre sono state conservate al buio
a -20°C (Figura 17).
Fluoresceina Isotiocianato Destrano (FD-4): (Sigma-Aldrich), probe
fluorescente, noto in letteratura per essere un substrato della PgP,viene
rilevato con tecnica spettrofluorimetrica ad una lunghezza d’onda di
eccitazione di 492nM e una lunghezza d’onda di emissione di 515nM.
Lavorando al buio, è stato solubilizzato in DMSO ad una concentrazione
madre di 10-2M e successivamente sono state effettuate le opportune
diluizioni. Le aliquote di soluzione madre sono state conservate al buio
a -20°C (Figura 18).
Verapamil idrocloridrato (Ver): (Sigma-Aldrich), oltre ad essere un
calcio-antagonista, specifico per il trattamento dell’ipertensione, è anche
noto in letteratura come inibitore della PgP. E’ stato solubilizzato in
acqua bidistillata alla concentrazione madre di 10-2M e successivamente
diluito in Krebs. Le aliquote di soluzione madre sono state conservate a
-20°C (Figura 19).
Ciclosporina A (CsA): (Sigma-Aldrich), principio attivo con effetto
immunosoppressivo, utilizzato per modulare la risposta immunitaria
dell’organismo, è anche noto in letteratura per le sue proprietà inibitorie
nei confronti della PgP. La CsA è stata solubilizzata in DMSO alla
concentrazione madre di 10-2M e successivamente diluita in Krebs. Le
aliquote di soluzione madre sono state conservate a -20°C.
MV194: (Dipartimento di Farmacia, Università di Pisa, Dottoressa
Simona Rapposelli). E’ stato solubilizzato in DMSO alla concentrazione
madre di 10-2M e successivamente diluito in Krebs. Le aliquote di
soluzione madre sono state conservate a -20°C (Figura21).
O
OMe
MV75: (Dipartimento di Farmacia, Università di Pisa, Dottoressa
Simona Rapposelli) E’ stato solubilizzato in DMSO alla concentrazione
madre di 10-2M e successivamente diluito in Krebs. Le aliquote di
soluzione madre sono state conservate a -20°C (Figura 22).
O
OMe
MV400: (Dipartimento di Farmacia, Università di Pisa, Dottoressa
Simona Rapposelli).E’ stato solubilizzato in DMSO alla concentrazione
madre di 10-2M e successivamente diluito in Krebs. Le aliquote di
soluzione madre sono state conservate a -20°C (Figura 23).
O OMe MeO MeO OMe OMe OMe
3.4 Analisi dei dati
Il processo di assorbimento intestinale di Rho123, alle diverse concentrazioni
testate, è stato misurato spettrofluorimetricamente e la Rho123, contenuta negli
EGS, è stata espressa come percentuale della Rho123 presente all’esterno dei
preparati intestinali. L’indice di potenza dei noti inibitori della PgP: Ver e CsA,
è stato calcolato praticando una regressione non-lineare sigmoidale
(programma GraphPad Prism versione 5) ed espressa come valore di pEC50,
corrispondente all’antilogaritmo della concentrazione di inibitore PgP
necessario per avere metà del massimo effetto inibitorio osservato.
I valori di pEC50 sono stati riportati come media ± errore standard di 4-12
esperimenti.
I dati ottenuti sono stati analizzati applicando il t test di Student o ANOVA
two/way. Un valore di P<0,05 è stato considerato indice di differenza
