77 Studio capacità dialitica
In questo lavoro abbiamo valutato con metodiche di proteomica l’efficacia depurativa di membrane dialitiche ad alto-flusso (HF) in confronto con quelle a basso-flusso con metodiche tradizionali e di proteomica. La 2DE e la SDS-PAGE ci hanno consentito di analizzare i patterns proteici di sieri (inizio e fine dialisi), ultrafiltrati ed eluati, provenienti da trattamenti dialitici eseguiti con cinque diverse membrane: una a basso e flusso quattro ad alto flusso. L’iter sperimentale è partito da un’analisi mediante SDS-PAGE dei tre campioni. Dall’elettroforesi dell’ultrafiltrato e dell’eluato abbiamo ottenuto i risultati più interessanti. Dalla loro analisi è emersa la differenza nella capacità depurativa delle membrane ed in particolare, in pieno accordo con le metodiche biochimiche, è risultato che sia membrane a basso flusso (F8) sia quelle alto flusso ( FX80-FX1000-N190 HF-Poly 210H ) sono in grado di fornire un buon livello di depurazione per quanto riguarda le molecole a peso molecolare basso (<1 kDa). Mentre le membrane HF presentano un’efficienza depurativa maggiore della LF per quanto riguarda le proteine a medio-alto peso molecolare. La maggiore capacità risolutiva dell’ 2DE SDS-PAGE ci ha permesso non solo di confermare i risultati precedenti ma di completare il quadro sull’efficienza delle membrane. In particolare ci siamo concentrati sulla determinazione del pattern proteico di adsorbimento delle membrane.
L’adsorbimento è il maggiore meccanismo di depurazione delle proteine ad alto peso molecolare ma anche un importante fattore coinvolto nella biocompatibilità e tollerabilità clinica delle membrane. Abbiamo quindi messo a punto un protocollo per l’eluizione delle proteine adsorbite e poi le abbiamo separate con la 2DE SDS-PAGE. Grazie alla spettrometria di massa (MALDI TOF-TOF) abbiamo potuto individuare 26 proteine di queste 5 sono state individuate in tutte le
membrane e 13 solo nelle membrane ad alto flusso, andando quindi a costituire un tipico proteoma adsorbito alle membrane di emodialisi. Inoltre l’analisi mediante spettrometria di massa degli spots ha evidenziato la presenza di modifiche post-traduzionali, il cui ruolo sarà interessante chiarire.
78 MPT (2-(a-mannopyranosyl)-L-tryptophan
La clearance una sostanza endogena liberamente filtrata attraverso i glomeruli ma non riassorbita né secreta dai tubuli renali dovrebbe misurare la velocità di filtrazione glomerulare. A tutt’oggi non è nota una sostanza con queste caratteristiche. La clearance della creatinina è il metodo generalmente usato per valutare la velocità di filtrazione glomerulare, anche, a causa della sua secrezione
tubulare, ne sovrastima il valore. Un’ alternativa potrebbe essere offerta dall’ MPT
(2-(a-mannopyranosyl)-L-tryptophan) una molecola endogena ideale per la determinazione della velocità di filtrazione glomerulare. Mediante utilizzo dell’HPLC abbiamo ottenuto dei dati preliminari che mostrano che si può evidenziare l’MPT nei campioni di siero ed urine. Proseguiremo lo studio integrandolo con spettrometria di massa tandem.
