BORDETELLA BRUCELLA

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BORDETELLA BRUCELLA

LEISHMANIA

Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2014-2015 Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica

Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa J. L. McDermott

Università degli Studi di Genova

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GENERE BORDETELLA

Bordetella pertussis : tosse convulsa o pertosse

B. Parapertussis : forme minore di pertosse

B. bronchiseptica: infezioni respiratorie nell’uomo

B. holmesii : setticemie in soggetti splenectomizzati

 Coccobacilli gram neg

 Diametro di 0,2-0,5 micron

 Aerobi stretti

 Immobili

 Asporigeni

 Capsulato e caratterizzato dalla presenza di fimbrie e granuli metacromatici.

 Esigenze nutrizionali particolari;

non utilizza gli zuccheri e sono estremamente sensibili agli acidi grassi

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Crescita su terreni comuni

(MacConkey) Produzione

di nitrati Ureasi Ossidasi Motilità SPECIE

B. pertussis - - - + -

B. parapertussis +/- - + - -

B. bronchiseptica + + + + +

BORDETELLA – Differenziazione

Caratteristiche Biochimiche e Colturali

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B. pertussis – Fattori di Virulenza

Adesine

1. Emoagglutinina filamentosa (FHA) 2. Pertactina (o 69K)

3. Fimbrie (FIM)

4. Tossina della Pertosse (PT) Esotossine

1. Tossina dell’adenilato ciclasi/emolisina 2. Citotossina tracheale

3. Tossina dermonecrotica 4. Tossina della Pertosse Endotossina

1. Lipooligosaccaride (LOS)

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L’adesione alle cellule ciliate dei bronchi è mediata da:

Emoagglutinina filamentosa (FHA)

 Lega ai glicolipidi solfarati presente sulle membrane degli epiteli ciliati e anche CR3.

Pertactina (o 69K)

 Lega al CR3 presente sulla superficie dei PMN e macrofagi, favorendo la fagocitosi.

Fimbrie (FIM)

 due tipi predominanti - Fim2 e Fim3;

 hanno attività emoagglutinante.

Tossine della pertosse

 S2: si lega al lattosilceramide, un glicolipide, delle cellule ciliate

 S3. si lega ai recettori gangliosidi dei fagociti promuovendo l’espressione di CR3 che facilita l'aggancio da parte di FHA e 69K.

B.pertussis – Adesine

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B. pertussis – Esotossine

Adenilato ciclasi/emolisina

 una estossina bi-funzionale, attivata dalla calmodulina intracellulare, catalizza la conversione dell’ATP in cAMP nelle cellule eucariotiche.

 È in grado di inibire l’attività fagocitica dei macrofagi. Citotossina tracheale

 una porzione di peptidoglicano che uccide le cellule ciliate respiratorie

 inteferisce con la sintesi del DNA, impedendo la rigenerazione delle cellule danneggiate.

Tossina dermonecrotica

 Esotossina letale, è la causa della necrosi nei tessuti colonizzati dal batterio (danno tissutale localizzato).

Tossina della Pertosse

 un oligopeptide

 sintetizzata solo da ceppi virulenti

 Inibisce molte funzioni leucocitarie: chemiotassi, fagocitosi, cellule NK

 causa principale della tosse convulsa

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B. pertussis – Tossine della Pertosse

 Struttura di tipo A-B costituita di 5 diversi poli- peptidi, denominati da S1 a S5.

 Una subunità A tossica (S1) che possiede attività enzimatica.

 5 subunità che formano la subunità B (S2, S3 S4, S4 e S5) responsabile

 del legame con il recettore sulla superficie delle cellule eucariotiche

 della traslocazione di S1 all’interno della cellula.

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Meccanismo patogenetico

 L'adenilato ciclasi, che catalizza la formazione di AMP-ciclico (cAMP), è regolata da due proteine:

 una proteina G stimolatrice (Gs) e

 una proteina G inibitrice (Gi)

 A (S1) ha un’ ADP-ribosilante sulla proteina G_i.

 A ADP-ribosila la proteina G_i, ostacola la

deattivazione dell’adenilato ciclasi.

 La conversione di ATP in cAMP non è più inibita e si aumenta la quantità intracellulare di cAMP.

B. pertussis – Tossine della Pertosse

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L’aumento intracellulare di cAMP causa:

 nell’epitelio respiratorio, l’aumento delle secrezioni respiratorie e della produzione di muco, caratteristiche dello stato parossistico della pertosse (tosse, broncospasmo, dispnea);

 nei fagociti, riduzione della fagocitosi (chemotassi, engulfment, killing);

 nel sangue, un’aumentata sensibilita all’istamina e conseguente aumento della permeabilita capillare, ipotensione e shock;

B. pertussis – Tossine della Pertosse

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Chiamato LOS per l’assenza di lunghe catene polisaccaridiche O

La frazione oligosaccaridica è mitogenica per i linfociti e induce il rilascio di IL-1 dai monociti, per cui si pensa che la febbre osservata durante la malattia sia dovuta all’azione pirogena dell’LOS.

B. pertussis – Endotossina

LIPOOLIGOSACCARIDE

LOSEsiste due tipi che differiscono tra loro nel contenuto di fosfati nella molecola lipidica:

 lipide A: simile a quello di Escherichia coli

 lipide X: ha una diversa porzione lipidica.

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Il locus centrale regolatore di bordatella è bvg (gene di virulenza della Bordetella)

 Per poter modulare la virulenza in risposta agli stimoli dell’ambiente, la BP ha un meccanismo per la di trasduzione del segnale (bvgA-bvgS)

 Richiede 2 attività effettuate da due proteine:

 BvgS: proteina sensore transmembranosa influenzata dai cambiamenti dell’ambiente,.si trasforma in una proteinachinasi attiva in

grado di fosforilare il secondo componente;

 BvgA: proteina regolatrice della risposta in grado di regolare l’espressione di geni specifici associati alla virulenza.

 Anche mutazioni a bassa frequenza possono abolire l’espressione di alcuni fattori di virulenza (organismi in fase II, III e IV in ordine di

virulenza).

Il locus bvg

• Controlla l’espressione dei fattori di virulenza

• Codifica BvgA, BvgS e BvgR

– BvgA-BvgS sistemi di trasduzione del segnale

Babu et al., 2001

B. pertussis – Il Locus bvg

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 Uno stesso ceppo di B. pertussis produce tossine a seconda della fase vegetativa:

fase S (virulento) – fimbrie, capsula, tossine

fase R (avirulento) – bloccato l’espressione di alcuni fattori di virulenza

 Il batterio si alterna in questi due fasi a seconda delle condizioni ambientali (disponibilità di nutrimento; presenza di ossigeno; temperatura).

 Questo fenomeno è variabile e reversibile (modulazione fenotipica).

 Quando cresce a 25°C (temp. delle narici) vengono inattivati più di 20 geni. In coltura si osservano colonie piatte (fase R)

i batteri persistono più facilmente nelle narici perché non provocano una forte risposta dell'ospite, favorendo la presenza prolungata (cronica) e la

diffusione del germe ad un'altra persona suscettibile.

 Quando cresce a 37°C, ritorna rapidamente virulenta (produce tossine. In coltura si osservano colonie lisce (fase S).

B. pertussis – Variazione di Fase

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La sua patogenicità è dovuta a diversi fattori:



azione fagocitaria della capsula,



tossicità del lipooligosaccaride di superficie (endotossina),



effetto vasocostrittore della tossina dermonecrotica,



azione lesiva sugli epiteli ciliati della citotossina tracheale,



funzione emoagglutinante ed emolitica, ma soprattutto



all’azione della tossina della pertosse che agisce facendo

aumentare la conversione di ATP in AMPc nelle cellule bersaglio.



la tossina della pertosse, è responsabile di vasodilatazione e quindi ipotensione, di stimolazione della secrezione insulinica e quindi ipoglicemia e di linfocitosi.

B. pertussis – Patogenesi

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Campioni biologici:

 L’indagine batteriologica viene eseguita su tampone nasofaringeo

 Isolamento in terreni contenenti:

 carbone come Regan-Lowe Agar

 amido, sangue o albumina come Bordet-Gengou (sottile ß-emolisi)

 Circa 7 giorni di incubazione

 Si ottiene la crescita del batterio in colonie piccole, convesse e lisce (fase S), utilizzabili per l’identificazione del batterio tramite agglutinazione con siero specifico.

B. pertussis ^{– Diagnosi}

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Esame microscopico

 Identificazione: caratteristiche

biochimiche e colturali, CIE diretta.

 IF diretta sugli strisci fissati e colorati, uso di anticorpi monoclonali

 Test ELISA per rilevare le IgG e le IgA

B. pertussis – Diagnosi

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 Negli anni 50 - vaccino composto da una sospensione di bordetelle uccise (cellule intere) in associazione con tetano e difterite (DPT) ha ridotto marcatamente l’incidenza. Numerosi effetti collaterali.

 Negli anni 70, il vaccino acellulare (ACPV) anziché l’intero

microrganismo, proteine immunogene selezionate, purificate (FHA, 69K, Fim2 e Fim3).

 Efficacia maggiore (85%)

 No effetti collaterali

 Esiste anche vaccini acellulari costituiti dalla Tossina della Pertosse

inattivata chimicamente e geneticamente con inattivazione del sito catalitico rendendo atossica la molecola, insieme all'emoagglutinina filamentosa

(FHA) e la pertactina (69K).

B. pertussis – Vaccini

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BRUCELLA

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I batteri del genere Brucella sono causa di malattie indicate con nomi diversi:



Brucellosi e Malattia di Bang (descritte in veterinaria)



Febbre ondulante (manifestazione clinica)



Febbre maltese o melitense,



febbre ricorrente mediterranea, (area geografica)



febbre di Creta.

La patologia determinata nell’uomo, è una zoonosi in quanto è trasmessa all’uomo da animali infetti.

BRUCELLA

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BRUCELLA – Eziologia

 Coccobacilli gram neg immobili, acapsulati.

 Aerobi obbligati ma spesso richiedono CO₂ (5-10%) al primo isolamento;

 Producono catalasi, ossidasi, idrogeno solforato e riducono i nitrati.

 Moderatamente sensibili al calore, uccise a 60°C per 10’

 Sopravvivono a lungo (mesi) in latte e alimenti conservati a 4-6°C, oltre che in polvere, terreno, acqua

 Non producono esotossine

 Presenza di endotossine (LPS) nella parete cellulare

 2 antigeni principali: A (B. abortus), ed M (B. melitensis)

 1 antigene superficiale: L

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BRUCELLA – Classificazione

Negli animali infetta gli organi riproduttori ricchi di eritritolo, uno zucchero metabolizzato da molti ceppi di brucella al posto del glucosio.

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

rappresentato dagli animali (bovini, ovini, caprini e suini) malati o portatori



L’uomo si infetta per:



contatto diretto con gli animali (mungitori, pastori, veterinari)



ingestione di alimenti contaminati (latte e derivati)



Nella specie umana i liquidi embrionali non contengono eritriolo, quindi la localizzazione nel feto non si verifica.



Possono sviluppare ascessi suppurativi in tutti gli organi.

BRUCELLA – Trasmissione

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 Terreni arricchiti favoriscono una più rapida crescita con produzione di piccole colonie lisce (S), trasparenti, rotonde e convesse (B.

melitensis, B. suis e B. abortus).

 La perdita della catena laterale O del LPS origina varianti con colonie dall’aspetto mucoide (M) o rugose (R) e perdita di virulenza (B. canis)

 Sono necessari 5-10 giorni per il primo isolamento.

BRUCELLA – Morfologia e Classificazione

B. melitensis: colonie lisce

B. melitensis: colonie mucose

 1 sola specie (B.melitensis) con varie biovarianti

 4 biovarianti patogene per l’uomo:

 B.melitensis

 B.abortus

 B.suis

 B.canis (minore importanza)

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PARASSITISMO INTRACELLULARE

 Le brucelle devono essere considerate microrganismi intracellulari facoltativamente extracellulari in quanto loro persistenza in natura, dipende dalla capacità di:

 moltiplicarsi in cellule eucariotiche

 sopravvivere all’esterno in particolari condizioni.

 Se vengono fagocitate dai macrofagi, sono al pericolo dalla fusione del fagosoma con i lisosomi.

Per evitare ciò, utilizzano

 l’inibizione del sistema mieloperossidasico

l’endocitosi mediata da caveole

 via zattere lipidiche

 Questa strategia viene utilizzato da brucelle di fenotipo S.

BRUCELLA – Meccanismi Patogenetici

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

Le brucelle possono essere fagocitate dai polimorfonucleati.



Nella vescicola fagocitaria, perossidasi + H

₂

O

₂

ossidano l’alogenuro (Ioduri) ad alogeno (Iodio)  denaturazione delle proteine.



B. pertussis produce il catalasi, sostanza che inibisce il

sistema mieloperossidasico perché riduce il H

₂

O

₂

in acqua e ossigeno.

BRUCELLA – Meccanismi Patogenetici

INIBIZIONE DEL SISTEMA MIELOPEROSSIDASICO

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 Dalle strutture rivestite di caveoline presenti a livello della membrana

plasmatica, si staccano della vesicole tramite l’azione della dinamina.

 Il batterio internalizzato arriva ad un organello chiamato caveosoma e da qui si raggiunge o il reticolo endoplasmatico (ER) o l’apparato di Golgi.

L’endocitosi mediata da caveole

BRUCELLA – Meccanismi Patogenetici

brucella

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 I ceppi lisci (S-LPS) entrano nella

cellula attraverso l'interazione con le zattere lipidiche e sono quindi racchiuse in una zona della membrana chiamata vacuolo contenente Brucella (BCV).

BVC:

 conserva alcuni marcatori delle zattere lipidiche, che indirizzano il BCV al reticolo endoplasmatico (ER).

 si fonde con l'ER, acquisendo così i marcatori di ER per evitare la

fusione con i lisosomi prima di iniziare a replicarsi.

 I mutanti rugosi (R-LPS), che non entrano nel macrofago attraverso zattere lipidiche, si fondono con i lisosomi e vengono uccisi.

BRUCELLA – Meccanismi Patogenetici

Interazione con zattere lipidiche

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 La replicazione inizia molte ore dopo la localizzazione intracellulare, avviene l’attivazione di VirB, un sistema di geni (viruloma intramacrofagico), considerato il principale determinante di virulenza delle brucelle.

 VirB è necessario per la moltiplicazione e la creazione del particolare comparto intracellulare, il brucellosoma, dove il patogeno risiede.

 Le brucelle sono in grado di inibire sia l’apoptosi del fagocita che la produzione di IL-12, TNF- α e quindi l’avvio della risposta immunitaria di tipo Type 1 T helper (Th-1), mediata da IFN- γ.

 I mutanti rugosi sono incapaci di modulare la risposta immunitaria

umorale dell’ospite: diretta principalmente contro la struttura antigenica di maggiore importanza (LPS).

BRUCELLA – Replicazione Batterica

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Patogenesi ed immunita:



Antigene A ed M



LPS



Parassita intracellulare delle cellule del SRE



Evade la risposta umorale



Blocca la degranulazione dei PMN



Resiste agli effetti battericidi del siero



Resiste alla fagocitosi



I macrofagi attivati inibiscono la crescita

BRUCELLA MELITENSIS

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Coltura batterica

Isolamento della brucella tramite emocoltura e mielocoltura (esame del tessuto midollare) che ha maggiori probabilità di successo nelle infezioni recenti)

Isolamento della brucella da frammenti bioptici (biopsia epatica) o dal liquor cefalorachidiano (esame colturale)

Poichè Brucella è un germe difficilmente isolabile e coltivabile si preferisce effettuare esami sierologici quali:

 sieroagglutinazione di Wright

 fissazione del complemento

 reazioni immunoenzimatiche e radioimmunologiche

BRUCELLA – Diagnosi

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BRUCELLA – Reazione di Wright

 Le emocolture richiedono 6-8 settimane d’incubazione e ha una scarsa sensibilità (60-70%)

 Dato il lungo incubazione, gli anticorpi sono presenti a titolo elevato e possono persistere per mesi o anni.

 Si utilizza una sospensione di B. abortus in fase S

 La siero agglutinazione di Wright misura anticorpi diretti contro l’antigene O.

 In presenza di siero contenente anticorpi specifici, si formano aggregati di complessi che risultano visibili.

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 ………

 E’ necessario dimostrare un aumento del titolo di almeno 4 volte in due prelievi a distanza di due settimane

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Esistono tre tipi di vaccini contro la brucellosi:

Vaccini preparati con batteri morti, uccisi con calore o con sostanze battericide (indicato per il solo uso veterinario) gravi reazioni allergiche nell’uomo

Vaccini da batteri vivi e attenuati (B. abortus)

 protezione maggiore

 responsabili di fenomeni di ipersensibilità ritardata dovuta al contatto, anche breve col microorganismo dopo la vaccinazione

Vaccini preparati con frazioni antigeniche di B. abortus con

 un alto potere immunizzante (IgM dopo pochi giorni, IgG entro 15-20 giorni)

 una minima capacità allergizzante.

 ciò li rende i più adatti per la vaccinazione nell'essere umano.

BRUCELLA – Vaccini

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LEISHMANIA

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

Protozoi emoflagellati appartenenti alla:



Classe Zoom astigophora



Ordine Kinetoplastida



Famiglia Trypanosomatidai



Genere Leishmania



parassiti intracellulari obbligati dei macrofagi e delle

cellule dendritiche (cellule del sistema reticoloistiocitario-SRE)



polimorfi



ciclo di vita indiretto (dixeno) che si svolge tra vertebrati (gli ospiti) e insetti (i vettori)



riproduzione asessuata, mitotica, con scissione longitudinale

LEISHMANIA

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Il corpo cellulare è generalmente allungato con :

 un grande nucleo diploide,

 un singolo flagello,

 DNA extranucleare (kinetoplasto) che costituisce il genoma del singolo, grande mitocondrio

Durante il ciclo vitale possono presentare i seguenti due morfotipi Forma amastigote

Nel citoplasma delle cellule del SRE dei mammiferi.

Priva di flagello libero, arrotondata o ovalare, nucleo sferico eccentrico e kinetoplasto bastoncellare adiacente al nucleo.

Forma promastigote

 Negli insetti vettori, ancorata ai microvilli del tubo digerente.

 Flagellata, allungata, moltiplicazione per scissione binaria.

LEISHMANIA - Morfologia

flagellum

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LEISHMANIA- Ciclo biologico

La durata del ciclo biologico del parassita nell’ospite invertebrato varia da un minimo di 4 giorni ad un massimo di 20, in relazione alle condizioni climatiche esterne.

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 Il genere comprende due sottogenere indistinguibili tra loro morfologicamente :

 Leishmania (Leishmania) parassiti del Vecchio e Nuovo Mondo,

 Leishmania (Viannia), parassiti del Nuovo Mondo

 Sono state differenziate sulla base:

 della loro distribuzione geografica

 della patogenicità

 dell’insetto vettore

 dell’identificazione genomica (analisi del DNA mitocondriale)

 dell’identificazione fenotipica (analisi dei zimodemi)

 La principale suddivisione è tra Leishmanie che danno forme viscerali e quelle che portano invece a forme cutanee

LEISHMANIA - Classificazione

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Complesso Specie

L. donovani L. donovani, L. infantum, L. chagasi

L. tropica L. tropica L. major L. major

L. aethiopica L. Aethiopica

L. Mexicana L. mexicana, L. amazonensis, L. venezuelensis

L. Braziliensis L. brazilienseis, L. peruviana L. guyanensis L. guyanensis, L. panamensis Nel 1990 le diverse specie di

Leishmania sono state classificate nei raggruppamenti (complessi fenetici) sulla base della identica mobilità elettroforetica per diversi iso-enzimi (zimodemi).

Ci sono 7 complessi di interesse umano, comprendente 13 diverse specie.

LEISHMANIA- Classificazione

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 Gli Zimodemi:

 sono classificati tramite una sigla MON ed un numero possono essere VISCEROTROPI o DERMOTROPI

 L. infantum:

 vari zimodemi

 zimodema viscerotropo MON-1 il più diffuso (rappresenta il 94% dei casi riscontrati)

LEISHMANIA - Classificazione

I PRINCIPALI ZIMODEMI IN ITALIA

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 Il flebotomi trasmettono un basso numero di promastigoti (100-1000), la maggior parte dei quali è uccisa dai fattori del complemento.

 Quelli che sopravvivono aderiscono alle cellule del S.R.E. grazie a due molecole che si trovano sulla superficie del promastigote:

 lipofosfoglicano (LPG) e

 glicoproteina 63 (GP63)

 Si legano ad alcune molecole di superficie dei macrofagi come i recettori:

 del complemento CR1 e CR3,

 del mannosio-fucosio (MFR)

 per la fibronectina (FR)

 Il legame di promastigoti è un meccanismo relativamente silenzioso che non induce la risposta infiammatoria che sarebbe previsto, cioè che promuove la loro sopravvivenza.

LEISHMANIA - Patogenesi

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 Fagocitosi: il fagosoma si fonde con i lisosomi secondari e si forma il vacuolo parasitoforo, all’interno del quale i promastigoti si trasformano nuovamente nell’amastigoti.

 Questa trasformazione comporta la perdita del LPG, che, migrando sulla superficie dei macrofagi infetti, inibisce l’attivita idrolitica degli enzimi lisosomiali mediante:

 la chelazione del calcio

 l’inibizione della protein chinasi C prodotta dalle cellule infette

 Gli amastigoti:

 moltiplicano per mitosi producendo 50-100 amastigoti figli.

 sono dotati di superossido dismutasi e catalasi che neutralizzano gli enzimi ossidativi (inibisce il sistema mieloperossidasico).

 Quando il flebotomo preleva il sangue, ingerisce macrofagi infetti da amastigoti.

LEISHMANIA - Patogenesi

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 Dimostrazione del parassita nei tessuti

 – con puntato midollare

 con puntura splenica

 Isolamento parassita su terreno NNN (Novy-Mac Neal-Nicolle), a 22-26° C entro 4 settimane

 Ricerca antigeni urinari

 Test sierologici : Elisa, IFA

LEISHMANIA - Diagnosi

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