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4. RISULTATI
Nella mia tesi sperimentale ho applicato tecniche di proteomica per verificare la variazione della sintesi proteica in seguito ad apprendimento e memoria indotti da contextual fear conditioning.
CONTEXTUAL FEAR CONDITIONING
4.1. Risultati dello Screening primario di geni candidati a
essere differenzialmente espressi in seguito a CFC
Precedentemente al mio internato di tesi, sono state costruite due librerie sottrattive di cDNA utilizzando la tecnica della SSH: la libreria forward, contenente i trascritti dei geni modulati positivamente dal CFC, e la libreria reverse, costituita, invece, dai trascritti dei geni modulati negativamente da questo tipo di condizionamento. Una volta ottenute queste librerie di geni candidati a essere differenzialmente espressi, il nostro gruppo di ricerca è andato a valutare l’effettiva variazione dell’espressione genica tramite la tecnica della RT-PCR real time. Dall’analisi è stato identificato un gruppo di geni, diviso successivamente in classi funzionali (tabella 2).
GENE CORRELATED TO THE SYNAPTIC MODULATION
CLONES GENE TRANSLATED TO PROTEIN E Value
(1)
MODULATION 1VH5 complexin 1 0.0 positive
2VB10 actin-related protein 3 homolog 1e-151 positive
5ND3 Amphiphysin I 0.0 negative
2VC7 N-ethylmaleimide sensitive fusion protein attachment protein alpha 0.0 positive
5VD5 Profilin 2 0.0 positive
7NB6 Stathmin I 0.0 positive
GENES IMPLICATED IN THE PROTEIN TURN-OVER
1VA11 tripartite motif protein 32 0.0 positive
1VB12 proteasome maturation protein 3e-178 positive
GENES IMPLICATED IN APOPTOSIS
5VD6 caspase 3 2e-134 positive
5VF8 p53 and DNA damage regulated 1 0.0 positive
GENES IMPLICATED IN THE MITHOCONDRIAL ACTIVITY
1VA6 ATP synthase 6 mitochondrial 0.0 positive
4VC12 dynamin 1-like 0.0 positive
4VF8 translocase of outer mitochondrial membrane 20 0.0 positive
GENES IMPLICATED IN THE SIGNAL TRANSDUCTION
1VB9 phosphoprotein enriched in astrocytes 15 1e-170 positive
1VC10 PKA regulatory, type I, alpha 1e-68 positive
2VG1 14-3-3 zeta polypeptide 3e-154 positive
4VC4 TIPRL 0.0 Positive GENES IMPLICATED IN VARIOUS CELLULAR PROCESS
1VG5 nardilysin 0.0 positive
5VE10 2,3 bisphosphoglycerate mutase 0.0 positive
5VH4 RAN, member RAS oncogene family 4e-82 positive
Tabella 2: geni modulati nelle porzioni medio-temporali del cervello di ratto a 48 h di
distanza dal CFC. Il gruppo di geni è stato suddiviso nelle classi funzionali riportate in tabella.
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4.2. Risultati dell’analisi proteomica tramite la tecnica del
Western Blot
In questa tesi sperimentale sono andato a valutare la variazione della sintesi proteica tramite la tecnica del Western Blot. Questa tecnica permette di effettuare una quantizzazione relativa della sintesi di proteine di interesse rispetto alla sintesi di una proteina di riferimento, che non viene modificata dal trattamento in esame. Nei nostri esperimenti come proteina di riferimento è stata utilizzata la G3PDH (vedi paragrafo 3.18). In seguito a queste analisi ho riscontrato che, a 48 ore dal condizionamento, si ha un aumento della sintesi di Stathmina 1 e Profilina 2, e una diminuzione della sintesi di Amfifisina 1.
4.2.1. Stathmina 1
Nel sistema nervoso di ratto, la Stathmina 1 è una proteina coinvolta nel controllo della dinamicità dei microtubuli, promuovendo la loro depolimerizzazione. In seguito agli esperimenti condotti è stato riscontrato un aumento della sintesi di Stathmina 1 nelle sezioni medio temporali del cervello di ratto a 48 ore dal contextual fear conditioning (Fig. 12).
Fi W si St a di de (* ig. 12: Ana Western Blo gnificativa tathmina I, condiziona ividendo la ella G3PDH *) L’analisi
alisi dei liv
t. A) I blo differenza f invece, mo amento. B) densità otti H, proteina u statistica è Naϊve velli di sint ots corrispo fra i campio ostrano un a I livelli d ica dei blots usata come stata ottenu tesi della S ondenti alla oni naϊve e aumento dei di espressio s della Stat controllo in uta tramite l CFC Stathmina 1 a proteina G quelli CFC i livelli dell one delle pr thmina I pe nterno. ’Unpaired t * (Stath1) e G3PDH no C. I blots co la sintesi pr roteine son er la densità test. G3DPH Stath1 effettuata tr on mostrano orrispondent roteica in se no stati cal à ottica dei H A B amite o una ti alla eguito colati blots
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4.2.2. Amfifisina 1
La proteina Amfifisina 1 è coinvolta nella regolazione dell’endocitosi delle vescicole sinaptiche, e quindi nel reuptake del neurotrasmettitore eccitatorio glutammato, a livello del terminale presinaptico. Gli esperimenti condotti hanno evidenziato una diminuzione della sintesi di Amfifisina 1 nelle sezioni medio temporali del cervello di ratto a 48 ore dal contextual fear conditioning (Fig. 13).
Fi W si al in st ot (* ig. 13: An Western Blo gnificativa lla Amfifisi n seguito a c ati calcolati ttica dei blo *) L’analisi
Na
nalisi dei liv
t. A) I blo differenza na I, invece condizionam i dividendo ots della G3P statistica è aϊve velli di sinte ots corrispo fra i campio e, mostrano mento con C o la densità PDH, prote stata ottenu esi della Am ondenti alla oni di naϊve o una dimin CFC. B)I li ottica dei b ina usata co uta tramite l CFC mfifisina 1 a proteina G e e quelli nuzione dei velli di espr blots della A ome control ’Unpaired t * (Amph1) e G3PDH no CFC. I blot livelli della ressione de Amfifisina llo interno. test. G3DPH Amph1 effettuata tr on mostrano ts corrispon a sintesi pro lle proteine I per la de A B amite o una ndenti oteica e sono ensità
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4.2.3. Profilina 2
La proteina Profilina 2 svolge un ruolo importante nella regolazione delle dinamiche citoscheletriche. Tramite il suo legame con la G-actina, questa proteina promuove infatti la polimerizzazione dei filamenti di actina. Inoltre questa proteina compete con la Amfifisina 1 per lo stesso sito di legame della Dinamina, inibendo così l’endocitosi delle vescicole sinaptiche e aumentando l’eccitabilità dei neuroni ippocampali, fenomeno alla base dell’LTP. Gli esperimenti condotti hanno evidenziato un aumento della sintesi di Profilina 2 nelle sezioni medio temporali del cervello di ratto a 48 ore dal contextual fear conditioning (Fig. 14).
Fi A di in co ca de (* ig. 14: Ana A) I blots c ifferenza fra nvece, most ondizionam alcolati divi ei blots dell *) L’analisi N
alisi dei live corrisponde a i campion trano una ento con C idendo la d a G3PDH, p statistica è Naϊve Naϊve elli di sintes enti alla pr i di naϊve e diminuzion CFC. B) I densità ottic proteina usa stata ottenu si della Prof roteina G3P quelli CFC ne dei livel livelli di a dei blots ata come co uta tramite l CFC filina 2 effe PDH non m C. I blots cor
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