SCOPO DELLA TESI
Lo scopo del presente studio è quello di verificare il grado di funzionalità renale sulla base dei valori di Velocità di Filtrazione Glomerulare (VFG) ottenuti attraverso la misurazione della clearance plasmatica dello ioexolo negli stadi IRIS nel cane, basati sulla misurazione della creatinina, inoltre verificare se tra i due parametri esiste una correlazione.
MATERIALI E METODI
Popolazione di studio
Questo lavoro costituisce uno studio retrospettivo, realizzato in cani condotti per visita e/o controllo tra Gennaio 2010 e Luglio 2014 presso il Dipartimento di Scienze Veterinarie di San Piero a Grado (PI).
I soggetti presi in considerazione sono quelli che in seguito a visita clinica, profilo ematobiochimico ed esame delle urine completo di sedimento e UP/UC, mostravano segni di insufficienza renale cronica (IRC) o il sospetto di tale patologia ed erano stati sottoposti alla valutazione della velocita di filtrazione glomerulare (VFG) mediante test dello ioexolo (Meucci et al 2013). La popolazione in studio che è risultata essere composta di 130 cani, è stata suddivisa nei diversi stadi di gravità secondo la classificazione IRIS (International Renal Interest Society) come riportato di seguito: Stadio 0: sono soggetti considerati sani, ma a rischio di IRC con creatinina plasmatica <1,4 mg/dl;
Stadio 1: sono soggetti con IRC non azotemica (creatinina <1,4mg/dl); in questo caso sono presenti altre anomalie renali come l’incapacità a concentrare le urine senza apparenti cause extrarenali, anormale palpazione renale o alterazioni ecografiche e/o radiologiche, persistente proteinuria renale;
Stadio 2: sono soggetti con iperazotemia renale lieve (creatinina 1,4<2 mg/dl); generalmente i segni clinici sono ridotti o addirittura assenti;
Stadio 3: sono soggetti con iperazotemia renale moderata (creatinina 2,1<5 mg/dl); i segni clinici sistemici possono essere presenti;
Stadio 4: sono soggetti con iperazotemia renale grave (creatinina >5mg/dl); risulta essere frequente il riscontro di numerosi segni clinici sistemici (http://iris-kidney.com).
A tutti i soggetti, differenti per razza, età, sesso e peso corporeo, è stato effettuata la misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (VFG) mediante test dello ioexolo. Per ciascun paziente erano state compilate cartella clinica, scheda di accompagnamento ed eseguiti esami ematobiochimici e delle urine.
I 130 soggetti, in base alla valutazione della creatinina plasmatica, sono stati suddivisi in:
Stadio 0 e 1 n° 97 cani (tabella 11)
Stadio 2 n° 10 cani (tabella 12)
Stadio 3 n° 21 cani (tabella 13)
SOGGETTI Stadi 0 e 1 Creatinina ≤ 1,4 mg/dl 1 1,4 2 1,4 3 1,1 4 0,8 5 0,9 6 0,8 7 1,0 8 0,9 9 0,8 10 0,7 11 1,0 12 0,8 13 1,3 14 1,3 15 0,9 16 1,4 17 1,2 18 0,7 19 0,7 20 1,4 21 1,0 22 1,4 23 1,0 24 0,9 25 1,4 26 1,0 27 1,1 28 1,2 29 1,2 30 1,3 31 0,5 32 0,7 33 1,2 34 1,0 35 1,3 36 1,2 37 0,5
SOGGETTI Stadi 0 e 1 Creatinina ≤ 1,4 mg/dl 38 0,8 39 1,1 40 1,2 41 0,9 42 1,0 43 0,9 44 1,2 45 0,9 46 1,0 47 1,3 48 1,1 49 0,8 50 0,9 51 1,3 52 1,3 53 0,7 54 0,8 55 0,9 56 1,1 57 1,0 58 0,7 59 1,2 60 0,7 61 0,8 62 1,1 63 0,9 64 0,7 65 1,3 66 1,1 67 0,9 68 1,4 69 1,1 70 1,2 71 0,9 72 1,0 73 1,0 74 1,3 75 1,4 76 1,1
SOGGETTI Stadi 0 e 1 Creatinina ≤ 1,4 mg/dl 77 1,3 78 1,1 79 1,2 80 1,2 81 1,0 82 1,2 83 1,1 84 1,4 85 1,1 86 1,3 87 1 88 1,4 89 0,9 90 1,4 91 1 92 1,2 93 0,9 94 1,2 95 1,2 96 1,4 97 1,2
Tabella 11: cani in Stadi 0 ed 1 secondo la classificazione IRIS sulla base della creatinina plasmatica.
SOGGETTI Stadio 2 1,4 mg/dl < Creatinina ≤ 2 mg/dl
98 1,7 99 1,6 100 1,5 101 1,5 102 1,8 103 1,5 104 1,5 105 1,7 106 1,5 107 2,0
Tabella 12: cani in Stadio 2 secondo la classificazione IRIS sulla base della creatinina plasmatica.
SOGGETTI Stadio 3 2 mg/dl < Creatinina ≤ 5 mg/dl 108 4,2 109 2,1 110 4,3 111 2,4 112 2,5 113 3,6 114 3,4 115 2,2 116 2,2 117 2,3 118 2,7 119 2,4 120 2,8 121 3,8 122 3,0 123 2,4 124 4,0 125 2,6 126 3,0 127 4,7 128 2,4
Tabella 13: cani in Stadio 3 secondo la classificazione IRIS secondo i valori della creatinina plasmatica.
SOGGETTI Stadio 4 Creatinina > 5 mg/dl
129 6,5
130 6,0
Tabella 14: cani in Stadio 4 secondo la classificazione IRIS secondo i valori della creatinina plasmatica.
I soggetti sono stati anche sottoposti alla misurazione della VFG mediante la clearance plasmatica dello ioexolo, utilizzando la metodica di Meucci et al. 2013, prendendo come valori di riferimento 75±15 ml/min m2.
Successivamente, sulla base del valore ottenuto di VFG, la popolazione in studio è stata suddivisa in altri 3 gruppi:
- Gruppo A: cani con VFG < 20 ml/min m2
- Gruppo B: cani con VFG compresa tra 21 e 40 ml/min m2
Test di valutazione della filtrazione glomerulare
Prima dell’inizio dell’esame ogni paziente è stato pesato e per ognuno è stata raccolta l’urina per minzione spontanea o per cistocentesi.
In ogni paziente la dose di ioexolo somministrata è stata di 64,7 mg/kg. Al fine di sapere con esattezza la dose di ioexolo effettivamente somministrata è stata pesata la siringa, tramite un’apposita bilancia, prima della preparazione dello ioexolo (vuota), dopo la preparazione del mezzo di contrasto (peso della siringa nella fase di pre-inoculazione) e dopo la somministrazione dello stesso (peso della siringa nella fase di post-inoculazione). La dose esatta di ioexolo somministrata è stata determinata dalla differenza tra il peso della siringa prima e dopo l’iniezione ; più precisamente, dalla differenza di peso della siringa prima e dopo l’iniezione sono stati individuati i grammi di ioexolo iniettato; dividendo i grammi di ioexolo iniettati per la densità (1,3g/ml) sono stati ricavati i ml di ioexolo effettivamente iniettati; moltiplicando i ml effettivamente iniettati per la concentrazione (647 mg/ml) sono stati ricavati esattamente i mg esatti di ioexolo inoculati.
Lo ioexolo così preparato è stato conservato al riparo dalla luce (avvolgendo la siringa con la carta stagnola) fino al momento dell’iniezione.
A scopo precauzionale è stata calcolata la dose eventualmente necessaria di desametasone sodio fosfato (Desashock®) in caso di segni di shock ipovolemico del
paziente, ma in nessun caso si è manifestata tale evenienza. La posologia prevista per tale farmaco è di 2mg/kg in un’unica somministrazione per via endovenosa.
Dal punto di vista operativo è stata condotta la seguente procedura: nei pazienti svegli è stata posizionata un’agocannula a livello della vena cefalica destra e sinistra. L’agocannula deputata al prelievo ematico al tempo 0 ed all’iniezione di ioexolo è stata dotata di un tappino perforabile, la controlaterale, deputata ai prelievi ematici secondo i tempi stabiliti dal protocollo è stata dotata di un tappino a vite.
Da una di queste è stato prelevato, mediante una siringa da 2,5 ml, un campione di sangue (di volume non inferiore a 1 ml) che è servito da campione basale (t0). Il sangue prelevato, una volta tolto l’ago dalla siringa, è stato posto in una provetta eparinizzata la quale è stata agitata per consentire un’omogenea distribuzione della sostanza anticoagulante all’interno del campione, evitando così la formazione di coaguli. La stessa procedura è stata ripetuta per tutti i casi clinici valutati.
La siringa contenente lo ioexolo è stata posizionata a livello del tappino perforabile dell’agocannula ed è stato iniettato lentamente nell’arco di 60”.
Considerando il momento del termine dell’inoculo di ioexolo come tempo 0, sono stati effettuati i prelievi di sangue dalla vena cefalica controlaterale o, in caso di cani di piccole dimensioni o quando non è stato possibile reperirla, dalla giugulare.
I prelievi sono stati eseguiti nei tempi stabiliti dal protocollo utilizzato (5’, 15’, 60’, 90’, 180’) rispetto al t0. I prelievi sono stati eseguiti aspirando il sangue con una siringa situata al posto del tappino a vite dell’agocannula. Nei casi in cui è stato ritenuto necessario, nei tempi di attesa dei prelievi e comunque non a ridosso di questi, è stato effettuato un flushin con circa 1-2 ml di soluzione fisiologica. Durante gli intervalli tra i campionamenti, il cane ha potuto bere e mangiare.
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA Dipartimento di Scienze Veterinarie Sezione di Farmacologia e Tossicologia
Via Livornese, Lato Monte, San Piero a Grado, Pisa 56122 PISA tel. 050 2210100
Filtrato glomerulare, VFG (clearance plasmatica dello ioexolo)
DATA____________________
PROPRIETARIO_________________________ INDIRIZZO_____________________________
CANE_________________________ RAZZA_________________________ PESO (kg)______________________ N. cartella_______________________ SUPERFICIE CORPOREA (m2) =[(4x (peso in kg) + 7)/((peso in kg)+90)
CREATININA (mg/dl)___________________________________
Dose iniettata ioexolo
SIRINGA VUOTA (gr)___________________________________________ SIRINGA PIENA (gr)____________________________________________ SIRINGA DOPO INIEZIONE (gr)__________________________________ INIETTATO (gr)________________________________________________
Tempi dei prelievi ematici (min) 0’____________________________ Iniettato ora__________________________ 5’__________________________________ 15’_________________________________ 60’_________________________________ 90’_________________________________ 180’________________________________ Scheda di accompagnamento Eventuale terapia in corso
I campioni ematici raccolti sono stati posti in provette eparinizzate e centrifugati a 3000 rpm per 10 minuti in modo da permettere la separazione del plasma. Il plasma ottenuto è stato inserito in apposite provette per mezzo di pipette usa e getta (ognuna delle quali è stata utilizzata per un singolo campione). Ogni provetta è stata contrassegnata da un’etichetta riportante il tempo del prelievo corrispondente ed è stata conservata nel congelatore alla temperatura di –20°C fino al momento dell’analisi.
I campioni plasmatici ottenuti per centrifugazione sono stati poi sottoposti ad estrazione. L’analisi quantitativa di ioexolo è stata effettuata con la metodica descritta da Meucci et al., 2013.
Analisi farmacocinetica
I campioni, dopo essere stati sottoposti al procedimento di estrazione, sono stati iniettati in HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) e i risultati ottenuti sono stati elaborati al computer mediante il programma Easy Fit® per Macintosh (Istituto Mario Negri, Milano, Italia).
Analisi statistica
Per l’analisi statistica è stato utilizzato il programma GraphPad Prism 6® per Windows,
con il quale sono stati elaborati grafici e test:
Test Statistico della Varianza (Test Analysis of Variance, A.N.O.V.A.): per verificare se esisteva una differenza statisticamente significativa tra i valori medi della VFG nei vari stadi IRIS e tra i valori medi della creatinina nei gruppi A, B e C;
Test di Pearson: per verificare se esisteva una correlazione tra i valori di creatinina plasmatica e i valori delle VFG corrispondenti in tutti i soggetti suddivisi in stadi IRIS e per valori di VFG (gruppi A,B e C).
I diagrammi a torta e gli istogrammi sono stati elaborati utilizzando il programma Word del pacchetto Office.
