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CAPITOLO 5
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
5. DISCUSSIONE
Il progetto MES-STAR si pone l'obiettivo di sviluppare protesi tecnologicamente innovative capaci di incrementare il tasso di rigenerazione tissutale e, al tempo stesso, di ridurre gli effetti secondari come lo sviluppo della reazione da corpo estraneo e la formazione di adesioni con i visceri. Il lavoro di tesi mira alla caratterizzazione biologica di matrici per la realizzazione di nuove protesi erniarie. I campioni analizzati in questo lavoro sono sia di origine industriale (DIPROMED) che sperimentale (DIMEAS-POLITO).
Una prima fase del lavoro ha previsto la caratterizzazione meccanica dei materiali forniti dalle due strutture, grazie alla collaborazione del gruppo di Biofabbricazione del Centro Interdipartimentale doi Ricerca “E. Piaggio” (Responsabile Ing. Giovanni Vozzi). Come è possibile osservare dalla Figura 13 , sia i campioni di gelatina in forma di film che le spugne presentano valori di modulo elastico maggiori di 3-5 ordini di grandezza rispetto al tessuto sano (42,5 KPa). Le spugne oltretutto presentano un modulo elastico inferiore di 5 volte rispetto al film proprio a causa della loro struttura alveolare e meno. L'aggiunta del GPTMS come cross-linkante nei film di gelatina non modifica i parametri meccanici (Figura 14), presentando questo già di suo una struttura più compatta, mentre nelle spugne si riscontra un aumento del modulo elastico (i valori si discostano sempre più da quelli riscontrati in tessuto sano) e della forza massima di carico grazie alla struttura più reticolata che si genera.
Per le strutture a base di PCL il modulo elastico incrementa con l'aumento del contenuto di PCL sia nei campioni compatti che in quelli porosi (Figura 15). In generale, i campioni compatti (modulo elastico compreso tra 70 a 350 MPa) hanno valori di modulo elastico maggiori rispetto a quelli porosi (valore massimo raggiunto = 100 MPa). I campioni dove il porogeno è PEG2 hanno un modulo elastico dalle 3 alle 5 volte maggiore rispetto ai campioni con PEG1.
76 Queste analisi preliminari hanno fatto focalizzare la nostra attenzione, in particolare, su quei campioni che prersentavano parametri biomeccanici più simili al tessuto sano ovvero PCL/PEG 60/40, PCL1-6i, PCL1-7i, PCL2-6i e PCL2-7i.
Tutti i campioni, sia di origine industriale che sperimentale, sono stati successivamente valutati sotto il profilo di citotossicità su colture cellulari seguendo le direttive ISO 10993 standard. Considerando i risultati ottenuti dal test di citotossicità sui campioni DIPROMED (Figura 16), ad esclusione dei materiali CMCPCL154 e CMCPUP100, tutti materiali risultano essere biocompatibili hanno infatti valori di VC superiori al 70%. Per i due materiali risultati citotossici, l’ipotesi è che, anche se sono di base prodotti biocompatibili, il loro processo produttivo porti probabilmente ad un maggiore entrapping del solvente (acetone per CMCPCL154, dimetilformammide per CMCPUP100) in cui vengono disciolti i polimeri: in contatto con il terreno di coltura, questo tende a liberarlo ed, entrando in contatto con le cellule, porta a morte cellulare.
Le strutture in gelatina hanno presentato dissoluzione dopo poche ore dall'aggiunta di terreno, per questo non sono state utilizzate nelle fasi successive della sperimentazione. Tutte le strutture a base di PCL (Figura 17) hanno mostrato un'ottima biocompatibilità. Dopo la valutazione della citotossicità, i campioni sono stati sottoposti a valutazione di adesione/proliferazione cellulare tramite test della curva di crescita. Il campione di CMCPCL, preso come riferimento per gli altri esperimenti, ha mostrato un buona colonizzazione per entrambi i lati (Figura 18 UP e DOWN). Dato che una faccia va a contatto con il difetto erniale mentre l'altra con i visceri, è ipotizzabile che questa protesi, inserita con metodica underlay, porti allo sviluppo di adesioni, effetto collaterale ricorrente con le protesi attualmente in commercio.
Per i campioni industriali (Figura 19 ) quelli che hanno mostrato un migliore trend di crescita cellulare sono stati 2P1824EV e 120MLPUP50, mentre per gli altri campioni la colonizzazione non è stata efficace.
Molti dei campioni a base di PCL (Figura 20 ) non hanno portato ad una colonizzazione cellulare. Pur non risultando citotossici, ipotizziamo che i ridotti valori di crescita cellulare siano dovuti ad una scarsa adesione da parte delle cellule alle strutture. Al contrario, il campione di PCL7-2i, ha mostrato un trend di crescita cellulare similare a quello di 2P1824EV.
77 Dalla comparazione dei risultati dei trend di crescita cellulare CMCPCL, PCL, 2P1824EV, 120MLPUP50 e PCL7-2i sono stati selezionati per lo studio del profilo della risposta anti- e pro-infiammatoria quantificando, rispettivamente, la produzione di IL-10 e IL-6. L'entità della risposta infiammatoria è un parametro collegato alla reazione da corpo estraneo e quindi allo sviluppo di granulomi e di adesioni tra i visceri e le protesi, nonché è implicata nei processi locali neurodegenerativi che portano allo sviluppo di dolore cronico
I valori di IL-10, normalizzati per numero di cellule, tendono ad aumentare nei giorni di coltura (Figura 21) per il controllo mentre, per tutti i campioni testati, si ha un'espressione massima nei primi giorni di coltura ed una contrazione dei valori nei tempi successivi. In particolare i valori di 2P1824EV e 120MLPUP50 sono minori rispetto al controllo in tutti i giorni analizzati. In CMCPCL, PCL e PCL7-2i il picco iniziale è da 2 volte (per CMCPCL) fino a 6 volte (per PCL7-2i) maggiore rispetto al controllo per poi diminuire e divenire circa la metà (per CMCPCL) rispetto al controllo l'ultimo giorno di coltura. Questi dati ci suggeriscono nel tempo mentre i materiali portano, anche se in modo diverso, ad una graduale diminuzione della risposta antiinfiammatoria. I composti a base di PCL mostrano una produzione maggiore di IL-10 rispetto agli altri campioni testati.
L'analisi dell'IL-6, invece, ha evidenziato il basso profilo infiammatorio indotto nel controllo: i valori nel mezzo di coltura, nei vari tempi di prelievo, non superano mai i 4,5 ng/mL (Figura 22 ). In maniera diametralmente opposta, i vari campioni inducono una grande espressione di questa citochina pro-infiammatoria con un trend crescente con il progredire dei giorni di coltura. Al giorno 21, infatti, i valori di IL-6 per i campioni sono da 10 volte maggiori rispetto al controllo per 2P1824EV (59,9 ng/mL) per arrivare anche a circa 27 volte per PCL (137,9 ng/mL). Solo PCL7-2i ha mostrato un profilo pro-infiammatorio paragonabile a quello del controllo mantenendo dei livelli di IL-6 compresi tra 0,2 e 16,4 ng/mL.
Il calcolo del rapporto tra IL-6/IL-10 ci offre una visione più completa sul profilo che prevale nel mezzo di coltura delle cellule messe in contatto con i diversi materiali. Dal grafico in Figura 23 appare evidente quanto i campioni inducano una maggiore espressione dell'Il-6 rispetto al controllo. I rapporti dei campioni sono molto bassi i primi giorni coltura (dove si ha il picco di produzione di 10), con il passare del tempo la produzione di IL-10 tende a diminuire mentre quella di IL-6 aumenta; questo porta ad un aumento dei valori di 100 volte tra il giorno 7 ed il 21 di coltura in quella che sembra essere una risposta
78 infiammatoria esponenziale auto-alimentata. I valori del controllo e di PCL7-2i, al contrario, rimangono costanti in tutti i giorni analizzati e sono estremamente minori (di circa 2-3 ordini di grandezza) rispetto a quelli degli altri campioni.
L'ulteriore confronto dei trend di espressione dell'IL-6 e dell'IL-10 al 7, 14, 21 giorno ci permette di osservare come la produzione dei due markers sia paragonabile nel controllo e nel campioni di PCL7-2i (Figura 26 ) e al contempo di come l'espressone dell'IL-6 sia fortemente indotta nei campioni di CMCPCL (Figura 24 ).
Nelle cellule di controllo, il trend di produzione delle due citochine è inverso: mentre l'IL-10 cresce lentamente con il passare del tempo, l'IL-6 sembra presentare una tendenza alla diminuizione. Dai grafici dei due campioni possiamo notare che i trend sono invertiti rispetto al controllo ma, anche in questo caso, PCL7-2i ha valori sia di IL-6 che di IL-10 molto più paragonabili rispetto al controllo, mentre CMCPCL porta ad un induzione di IL-6 maggiore da 2 a 100 volte rispetto al controllo.
In definitiva, PCL7-2i ha mostrato un ottimo profilo tenendo bassi i valori pro-infiammatori e garantendo, in maniera costante, un certo livello di quelli anti-infiammatori. Il trend infiammatorio di CMCPCL trova un riscontro nella pratica clinica dove si verifica lo sviluppo di una forte risposta infiammatoria utile allo sviluppo della proliferazione dei fibroblasti e favorendo così il processo di rivestimento della rete. I risultati ottenuti invece per PCL7-2i ci permettono di ipotizzare che questo materiale sia un buon candidato per lo sviluppo di protesi essendo capace di essere colonizzato dalla componente fibroblastica senza però necessitare di una forte risposta infiammatoria, potenzialmente riducendo tutte le complicazioni legate ad alti livelli di infiammazione postoperatoria.
I test di immunoistochimica che sono stati effettuati successivamente hanno investigato sulla presenza delle diverse isoforme del collagene, in particolare di tipo I e di tipo III, in quanto costituente primario della matrice extracellulare. L'ECM è in continuo rimodellamento e la presenza di una protesi può causare delle modifiche nella sua composizione che possono comportare perdita di funzionalità o di resistenza. Squilibri nei normali rapporti tra il collagene di tipo I e quello di tipo III sono, come già detto, associati ad alte percentuali di ricadute ed erniazioni secondarie.
79 I risultati mostrano una secrezione fisiologica di collagene III rispetto a quella del collagene I da parte dei fibroblasti utilizzati. Nel controllo, il collagene III è 5 volte maggiore rispetto al collagene I. L'impiego dei campioni nelle colture ha portato, in generale ad una diminuzione del collagene neoformato (tipo III). Con alcuni campioni, come 2P1824EV, 120MLPUP50 e PCL, è diminuita anche la secrezione di collagene maturo (tipo I) mentre per CMCPCL e PCL7-2i si osserva un aumento dei valori del collagene di tipo III.
Come ulteriore analisi abbiamo calcolato il rapporto tra i valori di intensità massima registrati per il collagene di tipo I e quello di tipo III. Analisi di questo tipo condotte in vivo [ ] hanno mostrato che un abbassamento del rapporto del collagene I/III del tessuto è direttamente collegato allo sviluppo di erniazioni secondarie. Appare evidente in Figura 29 come per il controllo, 2P1824EV, 120MLPUP50 e PCL il rapporto sia sbilanciato verso la produzione di collagene di tipo III, infatti, tutti mostrano valori nettamente inferiori all'unità. I valori del rapporto per PCL7-2i e CMCPCL si avvicinano all'unità (entrambi p<0,05 rispetto agli altri materiali e al controllo) dato la maggiore espressione del collagene di tipo I. Questo risultato ci permette di ipotizzare che tali materiali portino ad un rafforzamento della ECM nel tempo e, soprattutto per il caso di PCL7-2i, questo possa essere potenzialmente un buon candidato per la produzione delle mesh utili alla riparazione di ernie intestinali.
A questa serie di analisi finora descritte, sono state associate due ulteriori elementi che ci potessero dare uno sguardo più ampio su quello che era il comportamento delle cellule in risposta ai diversi materiali. In particolare, sono state condotte analisi sul secretoma cellulare e la matrice extracellulare tramite spettroscopia di massa e sulle metallo-proteinasi coinvolte nel processo degenerativo.
Le analisi del secretoma, come quelle della matrice extracellulare, sono ad uno stadio preliminare e sono state condotte per ora su cellule di controllo. Per il secretoma, nonostante l’”inquinamento” prodotto da una non perfetta purificazione del campione (presenza di residui cellulari come organelli intracellulari, proteine del citoplasma), possiamo notare che componenti importanti della matrice cellulare come la fibronectina, il collagene di tipo I e quello di tipo III siano state rilevate in grande quantità nei campioni analizzati. Queste analisi, in futuro, ci permetteranno di quantificare le differenze nella produzione di matrice proteica dovute all'utilizzo di un certo materiale rispetto ad un altro e
80 permetteranno di approfondire lo studio della composizione della matrice extracellulare. Per quanto riguarda più specificamente le analisi sulla ECM, al momento di chiusura di questo lavoro di tesi, per problemi tecnici legati alla processazione ed analisi dei campioni non abbiamo ancora dati sulla precisa composizione proteica.
Per ciò che concerne le metallo-proteinasi, questi enzimi sono convolti nel processo di degradazione del collagene nei tessuti. In particolare, due isoforme, la MMP-2 e la 9, sono state analizzate allo scopo di valutare gli effetti dei materiali sulla loro produzione ed attività. I risultati preliminari mostrano la loro presenza nei campioni di terreno. La forma ondulata assunta dalla banda nel campione di controllo ed in quello del materiale di riferimento fa supporre una parziale complessazione delle metalloproteinasi con il loro attivatore EMPRIN: i picchi verso il basso assunti dalla banda potrebbero indicare la forma libera delle MMP (Figura 36). I campioni saranno ulteriormente processati allo scopo di rimuovere tale attivatore e poter distinguere le due isoforme.
Infine, sono state condotte analisi preliminari per il potenziale impiego di farmaci, nello specifico del Pirfenidone, come coadiuvanti contro l'insorgenza delle adesioni tra i visceri e le protesi. Il Pirfenidone è un farmaco utilizzato in pratica clinica per il trattamento della fibrosi polmonare, per la sua azione anti-infiammatoria e anti-fibrotica. I risultati mostrati sono quelli relativi allo studio di citotossicità su colture cellulari. A bassissime concentrazioni (0,01 mg/mL), il Pirfenidone stimola la vitalità cellulare per poi indurre un danno sempre più elevato a concentrazioni crescenti (da 0,03 a 01 mg/mL, Figura 30). Questo test sarà utile per selezionare il range di concentrazione da utilizzare per lo sviluppo di protesi con tecnologia drug delivery sul lato a contatto con i visceri allo scopo di diminuire sia lo sviluppo di infiammazione che di eccessiva proliferazione cellulare che hanno come conseguenza la formazione di adesioni tra i visceri e la protesi.
CONCLUSIONI
In questo lavoro di tesi sono stati caratterizzati dal punto di vista della risposta biologica materiali di origine industriale e sperimentale per lo sviluppo di protesi per la riparazione di difetti erniari.
81 Le varie fasi di sperimentazione hanno messo in evidenza le diverse caratteristiche biomeccaniche e biologiche dei diversi materiali dandoci una serie di informazioni sulla loro citocompatibilità, sull’induzione di una risposta anti- o pro-infiammatoria e sulla produzione di un certo tipo di matrice extracellulare.
L'analisi dei parametri biomeccanici ha messo in evidenza che tutti i campioni hanno valori di modulo di Young che si discostano di almeno 2 ordini di grandezza rispetto ai valori di tessuto sano.
Il successivo screening di biocompatibilità ha messo in evidenza come anche il processo sintetico debba essere migliorato per rendere i materiali non citotossici e ci ha permesso di discriminare tra i campioni quelli idonei per l'analisi del trend di crescita cellulare.
Da questa prima analisi sono stati selezionati 5 materiali (CMCPCL, 2P1824EV, 120MLPUP50, PCL e PCL7-2i), su cui siamo andati a studiare il profilo infiammatorio, la composizione della matrice extracellulare e del secretoma. Queste analisi sono molto importanti per cercare di comprendere i meccanismi cellulari e le caratteristiche dei materiali utili a minimizzare l'insorgenza di effetti collaterali molto comuni dovuti all'impiego di protesi, come lo sviluppo di aderenze e la reazione da corpo estraneo. Dalle analisi finora condotte, il campione PCL7-2i è quello che ha mostrato il miglior profilo infiammatorio nonché un buon rapporto nella produzione di collagene di tipo I e tipo III. Per completare lo studio di questo materiale, sono previsti test in-vivo a breve e lungo termine per valutare la reale capacità di PCL7-2i di minimizzare la risposta infiammatoria dell'organismo, di indurre un veloce rafforzamento della matrice extracellulare nonché l'entità di un possibile sviluppo di adesioni e il grado di colonizzazione cellulare. Inoltre, a ulteriore supporto, verrà valutato il potenziale impiego di in-vivo di matrici con rilascio controllato di farmaci, come ad esempio il Pirfenidone, allo scopo di valutarne l'effettivo beneficio sull'instaurarsi di possibili adesioni.
