RIASSUNTO 8 ABSTRACT 10 INTRODUZIONE 12
Il ciclo cellulare 13
Regolazione fisiologica del ciclo cellulare:
i fattori E2F 14
Le pocket proteins 15
Il passaggio G1-S 15
Il passaggio S-G2 16
La senescenza cellulare 17
La senescenza replicativa telomero-dipendente 18
La senescenza precoce p53 dipendente 18
Azione della proteina p53 18
Azione del fattore pro-senescenza ARF 19
Azione di p21 21
La senescenza precoce p53-indipendente 22
Azione di p16 22
Senescenza indotta da stress ossidativi 22
Modulazione dell’espressione delle proteine
p16 e p19ARF 24
Modulazione dell’espressione di p16 24
Modulazione dell’espressione di p19ARF 25
Struttura della proteina LRF 26
Ruolo di LRF nel controllo dell’espressione
Controllo traduzionale: ruolo dei microRNA 29
Biogenesi degli RNA interferenti 29
Modalità d’azione dell’interferenza da RNA 31
MicroRNA (miRNA) e
small interference RNA (siRNA): reali differenze 31
Azione del complesso RISC 32
Ruoli biologici dei miRNA 33
Ruolo dei miRNA nelle piante 33
Ruolo dei miRNA nei metazoi 34
I miRNA nel controllo del ciclo cellulare
e dell’oncogenesi 35
Localizzazione nel genoma delle sequenze codificanti
per i miRNA e suscettibilità al cancro 35
Il cluster 17: un oncogene derivato da miRNA 36
Let-7 e derivati: microRNA ad azione oncosoppressoria 37
I miR-100 e miR-125b: funzioni biologiche
ed implicazioni in varie forme tumorali 39
Scopo della tesi 40
MATERIALI E METODI 41
Tipi di cellule usate e modalità di coltura 42
Linea immortalizzata umana HEK 293T 42
Linea primaria murina MEF 6T3 42
Scelta dei microRNA 43
Plasmidi utilizzati nelle trasfezioni delle HEK 293T
Protocolli di trasfezione transienti 45
Protocollo di trasfezione delle HEK 293T 45
Protocollo di trasfezione delle MEF 46
Estrazione dell’RNA totale e PCR quantitativa 47
Estrazione dell’RNA totale da pellets di cellule 47
Retrotrascrizione dell’RNA 47
PCR Quantitativa 48
Western blot e Immunostaining 49
Estrazione delle proteine totali da pellets cellulari 49
Protocollo di estrazione delle proteine 49
Protocollo di quantificazione della 49
concentrazione totale delle proteine estratte
Corsa elettroforetica dei campioni su gel 50
di poliacrilammide e trasferimento su membrana Protocollo per l’immunostaining
delle proteine di interesse 50
Saggi di senescenza e di proliferazione 52
Saggio dell’attività della β-galattosidasi a pH 6 52
Visualizzazione e conteggio delle cellule binucleate 53
Valutazione della proliferazione cellulare 53
RISULTATI 55
Verifica dell’interazione fra il 3’ UTR
Over-espressione dei miR-100 e miR-125b
maturi in cellule MEF 57
Variazioni dei livelli proteici dei marcatori di
senescenza 59
Effetti fisiologici dell’over-espressione
dei miR-100 e miR-125b in MEF
62
Saggi di SA β-GAL e frequenza di cellule
binucleate 62
Saggi biologici di proliferazione cellulare 64
Studio dei targets dei miR-100 e miR-125b
ad azione proliferativa 65
DISCUSSIONE 67
I miR-100 e miR-125b controllano l’espressione
di LRF 68
I miR-100 e miR-125b attivano l’asse p19ARF/p21
e riducono i livelli di E2F1, ma non hanno nessun
effetto su p16 69
I miR-100 e miR-125b riducono l’insorgenza
di senescenza e promuovono proliferazione 70 Cooperatività necessaria fra p16 e p19ARF
per l’induzione della senescenza? 71
Conclusioni 71
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 73
