5. MATERIALI E METODI
5.1 Condizioni di crescita e fumigazione delle piante
Le talee dei due cloni di pioppo diversamente sensibili all’ozono (Populus deltoides x
maximowiczii, clone Eridano O3-sensibile; Populus deltoides x euramericana, clone I-214 O3-resistente) sono state allevate per 5 settimane in vasi contenenti un terreno sabbioso a cui è stato aggiunto 0, 50 e 500 mg di cadmio/Kg di peso secco, sottoforma di cloruro di cadmio (Cl2Cd). Trascorso tale periodo di crescita, di ogni diverso trattamento con cadmio (Cd) sono state scelte casualmente sei piante, di cui tre sono state sottoposte a fumigazione nell’apposita camera, mentre le altre tre sono state poste nella camera di crescita priva di O3. Sulle rimanenti piante sono state subito effettuate le misure per la valutazione della fotosintesi e, quindi, sono state campionate per poter effettuare successive analisi.
La fumigazione delle piante è stata effettuata in una cella climatica (di volume pari a 0,48 m3) in cui i parametri ambientali (luce, temperatura ed umidità relativa) vengono continuamente controllati mediante sistemi automatici. La temperatura era mantenuta a 20±1°C e l’umidità relativa all’85±5%. Tramite una lampada ad incandescenza all’altezza delle piante veniva rilasciato un flusso di fotoni pari a 530 μmol fotoni m-2
s-1 (si tratta di radiazione PAR, cioè radiazione fotosinteticamente attiva, con λ compresa tra 400 e 700 nm). In tale camera, l’O3 era prodotto da un generatore Fischer 500, alimentato ad ossigeno e raffreddato ad aria (Fisher Labor und Verfahrenstechnik, Meckenheim, Germania). La sua concentrazione all’interno della camera di fumigazione era continuamente monitorata da un analizzatore automatico (modello 8810, Monitor Laboratories, San Diego, CA, USA), che basa il proprio funzionamento sul principio dell’assorbimento nella radiazione dell’ultravioletto (UV) ed è connesso ad un personal computer dotato di specifico software (Diara et al.,2005).
Le piante sono state sottoposte ad una fumigazione cronica con concentrazioni realistiche di O3, pari a 60 nl l-1 per 5 ore al giorno, per 15 giorni consecutivi. Il materiale di controllo, e quindi non sottoposto alla fumigazione, è stato posto in una cella climatica caratterizzata dalle medesime condizioni operative, ad esclusione della presenza di ozono, sostituito con aria filtrata.
Al termine della fumigazione sono state effettuate le analisi di tipo fisiologico, quali la misura degli scambi gassosi, mentre una parte del materiale vegetale fresco è stata utilizzata per la determinazione dei pesi freschi e secchi e poi per analizzare il contenuto in
cationi e in anioni. Il materiale vegetale necessario per le altre analisi svolte è stato invece congelato in azoto liquido e mantenuto ad una temperatura di -80°C.
5.2 Determinazione della concentrazione di cationi
Sia nelle piante trattate solamente con il Cd, che in quelle sottoposte anche alla fumigazione con ozono è stata misurata la concentrazione dei cationi cadmio (Cd2+), ferro (Fe2+), zinco (Zn2+), magnesio (Mg2+), potassio (K+) e calcio (Ca2+) in foglie, radici e germogli. La loro determinazione è stata eseguita tramite spettrofotometria ad assorbimento atomico, utilizzando uno spettrofotometro Perkin Elmer 373 equipaggiato con lampade a catodo cavo multielemento (Photron).
I campioni di foglie, radici e germogli sono stati essiccati in stufa a circa 100°C, pesati con la bilancia analitica (circa 0,2g sia di foglie che di germogli e 0,1g di radici) e omogeneizzati in mortaio con l’aiuto di azoto liquido per polverizzarli. I campioni sono stati mineralizzati tramite 5 ml di acido nitrico (HNO3) e sono stati portati al volume di 25ml con acqua milliQ. Quando l’estratto è risultato completamente chiarificato, si è potuto procedere alla lettura spettrofotometrica dei cationi (Jones & Wallace, 1992).
La quantificazione della concentrazione dei vari cationi nei campioni è stata eseguita utilizzando soluzioni standard a concentrazione nota. La concentrazione è stata espressa come µg/g di peso secco.
5.3 Determinazione della concentrazione di anioni
La determinazione della concentrazione di cloruri (Cl-), nitrati (NO3-), fosfati (HPO42-) e solfati (SO42-) è stata eseguita su foglie di piante sottoposte sia allo stress da Cd, sia al trattamento con Cd e O3. L’estrazione è stata effettuata su 0,5 g di campione polverizzato con azoto liquido, risospeso in 2,5 ml di acqua milliQ (5 ml/grammo di tessuto fresco) e posto in agitazione vigorosa per un’ora. I campioni così omogeneizzati sono stati lasciati decantare per circa 20 minuti, dopo di che si è prelevato il surnatante per sottoporlo ad una centrifugazione di 10 minuti. Si è di nuovo prelevato il surnatante e lo si è diluito 1:5 e 1:20, per farlo passare attraverso le colonne C18 e attraverso filtri da 0,45 μm in modo da eliminare i pigmenti, i composti fenolici e le altre impurità presenti. Gli estratti ottenuti
venivano poi analizzati mediante cromatografia a scambio ionico (Dionex) e le concentrazioni degli anioni inorganici determinate sulla base di standard a concentrazione nota. Lo standard conteneva 3 ppm di Cl-, 10 ppm di NO3-, 15 ppm di HPO42- e 15 ppm di SO42-.
5.4 Determinazione dei parametri di crescita
Dopo le 5 settimane di crescita su terreno contaminato, le piante sottoposte esclusivamente allo stress da Cd sono state tolte dal terreno, sono stati separate le foglie, i germogli e le radici, per poter così determinare i pesi freschi dei tre organi vegetali tramite una bilancia analitica. Il materiale è stato poi trasferito in stufa a circa 100°C fino a completa perdita di acqua e al raggiungimento del peso costante veniva determinato il peso secco.
Il materiale seccato è stato conservato in un deumidificatore, mentre il rimanente tessuto fresco è stato congelato in azoto liquido e conservato a –80°C per effettuare altri tipi di analisi.
Lo stesso procedimento è stato effettuato anche per le piante sottoposte a 15 giorni di fumigazione cronica con O3 ma cresciute in terreno privo di Cd e per quelle cresciute in presenza del metallo e sottoposte a fumigazione con O3.
5.5 Misura degli scambi gassosi fogliari
Gli scambi gassosi a livello fogliare sono stati misurati tramite un analizzatore portatile all’infrarosso (IRGA), LI-6400 (Li-Cor, USA), sulla terza foglia completamente espansa, partendo dall’alto.
Le misure sono state compiute mantenendo delle condizioni di PAR (radiazione fotosinteticamente attiva, LED rosso-blu) e di temperatura all’interno della cuvette dell’IRGA simili a quelle ambientali, pari cioè a 800 μmol m-2
s-1 di PAR e a 25°C di temperatura. L’umidità relativa all’interno della cuvette è stata regolata e mantenuta al 50-60%, mentre la concentrazione di CO2 è stata fatta oscillare attorno al valore ambiente (370-380 μmol mol-1). Gli scambi di CO2 tra foglia ed atmosfera sono stati valutati
misurando la differenza tra il flusso di CO2 all’interno della cuvette e quello in uscita, secondo la seguente relazione: Pn = ue(xe – xo)/A, dove u è il tasso di flusso molare (in entrata ed in uscita, mol s-1), x è la concentrazione di CO2 dell’aria che entra ed esce dalla
cuvette (frazione molare), ed A è l’area fogliare di riferimento nella cuvetta (in genere
espressa in m2). Per ottenere misure precise è utile che la differenza tra flusso in ingresso ed in uscita, che risulta dall’evaporazione del vapore acqueo della foglia, sia minima.
Sono stati determinati i seguenti parametri: attività fotosintetica (Amax), conduttanza stomatica (gs), concentrazione interna di CO2 (Ci) e traspirazione (Tr).
5.6 Estrazione e determinazione della concentrazione di pigmenti fotosintetici ed accessori
L’estrazione dei pigmenti è stata effettuata su dischetti fogliari prelevati dalla terza foglia completamente espansa di ogni pianta, e sulla quale erano state precedentemente effettuate le misure degli scambi gassosi. Per ogni pianta sono stati prelevati tre dischetti e sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e, quindi, conservati ad una T = -80°C fino al momento dell’analisi. I dischetti fogliari, dopo essere stati pesati con una bilancia analitica (circa 0,01 g), sono stati omogeneizzati in mortaio con acetone puro (grado HPLC) ed una minima quantità di acido ascorbico, necessaria per evitare l’ossidazione dei pigmenti. L’estratto è stato poi filtrato mediante un filtro satellite da 0,2 μm in PVDF, portato al volume di 2 ml con acetone ed immediatamente analizzato. Il procedimento di estrazione è stato eseguito al buio per evitare la fotodegradazione dei pigmenti (Ciompi et al., 1997).
Il contenuto di clorofilla a, clorofilla b e di carotenoidi è stato determinato mediante HPLC (high performance liquid cromatography), registrando i picchi in uscita ad una lunghezza d’onda λ = 445 nm. La separazione è stata condotta utilizzando una colonna Zorbax ODS nonendcapped (Chrompack SA, Raritan, NJ, USA), la cui fase mobile è costituita da due diverse soluzioni: acetonitrile/metanolo 75/25 v/v (soluzione A) e metanolo/etilacetato 68/32 v/v (soluzione B). Il programma di eluizione prevedeva 12 minuti in 100% di soluzione A, 3 minuti in gradiente per passare dal 100% di soluzione A al 100% di soluzione B, 15 minuti in 100% di soluzione B e infine 2 minuti in gradiente da 100%di soluzione B al 100% di soluzione A, per una durata totale di ogni corsa cromatografica di 32 minuti. Durante tutta la fase di separazione il flusso delle soluzioni è stato mantenuto a
1 ml/min (Thayer & Björkman, 1990, modificato). La quantificazione di clorofilla a e b, luteina e β-carotene è stata effettuata mediante rette di taratura con standard commerciali a concentrazione nota. Le diverse xantofille sono state quantificate utilizzando la retta di taratura per la luteina.
5.7 Determinazione della concentrazione di H2O2 e NO
La concentrazione fogliare di H2O2 è stata determinata mediante la sonda fluorimetrica 10-acetil-3,7-diidrossifenoxazina (Amplex Red, Molecular Probes), particolarmente sensibile a basse concentrazioni di H2O2 (Mohanty et al., 1997) con cui reagisce in rapporto stechiometrico 1:1 formando resofurina, un prodotto di ossidazione fluorescente.
Dischetti fogliari del diametro di 5 mm, prelevati da foglie giovani completamente espanse, escludendo la nervatura centrale, sono stati immediatamente immersi in azoto liquido e qui conservati fino al momento dell’analisi. I campioni sono stati incubati e mantenuti in continua agitazione per 30 minuti ad una temperatura di 25°C e in assenza di luce. L’emissione della resofurina è stata determinata ad una lunghezza d’onda di 590 nm dopo aver subito eccitazione a 530 nm mediante un fluorimetro a piastre. La concentrazione di H2O2 è stata determinata in riferimento ad una curva standard (0-3,5 μM).
La concentrazione fogliare di NO è stata determinata tramite l’utilizzo del reagente 4-amino-5-metilamino-2’,7’-diflorofluoresceina diacetato (DAF-FM diacetato), un composto che in presenza di basse concentrazioni di NO (<= 3 nM) si trasforma nel derivato fluorescente benzotriazolo (Kojima et al., 1998).
I campioni sono stati preparati con la stessa procedura utilizzata per la determinazione dell’H2O2 e sono stati incubati al buio a 25°C per 60 minuti in continua agitazione, in presenza di DAF-FM diacetato 10 μM e rilevati per via spettrofluorimetrica (Ex/Em:495/515 nm).
5.8 Analisi statistica
Per la valutazione degli effetti del trattamento con Cd e/o con O3 in entrambi i cloni di pioppo, l’analisi statistica dei dati ottenuti è stata effettuata mediante ANOVA a due, per piante trattate sono con il metallo o solo con O , e sia a due che a tre vie, per le piante
sottoposte allo stress combinato. Le differenze statistiche tra le medie sono state determinate tramite il test della differenza minima significativa (LSD), al livello di significatività P<= 0,05.
I dati riportati rappresentano la media ± SE (errore standard) di n repliche (n = 3 per la determinazione dei cationi e degli anioni, per il dosaggio di H2O2 e di NO, per i parametri relativi alla fotosintesi, per i parametri di crescita e per la determinazione dei pigmenti in piante esposte solamente all’O3; n = 4 per la determinazione dei pigmenti in piante trattate con Cd e O3; n = 6 per i pigmenti di piante trattate solo con Cd).
