5. Discussione e conclusioni
Lo stress ossidativo, inteso come condizione nella quale le difese antiossidanti dei tessuti sono superate dalla reattività di radicali liberi, ha assunto negli ultimi decenni un ruolo crescente nella comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie umane (Sies H., 1997), ed in effetti in numerose patologie, come quelle cardiovascolari e neurodegenerative, è stato dimostrato un ruolo causale o con-causale del danno ossidativo ( Gibson GE and Huang HM., 2005; Madamanchi NR et al., 2004).
Negli ultimi anni però una novità importante è stata rappresentata dall’affiancamento, al concetto tradizionale di stress ossidativo, del nuovo concetto di “redox regulation”. Infatti, da un lato è emerso che le specie reattive dell’ossigeno sono implicate in meccanismi importanti di controllo della trasduzione del segnale, del controllo proliferativo e della morte cellulare, dall’altro è emerso che spostamenti anche modesti dell’equilibrio tra agenti ossidanti ed antiossidanti cellulari hanno notevoli ripercussioni sulla fisiologia della cellula (Grezzi P et al., 2005). In questi meccanismi di controllo e regolazione il GSH svolge un ruolo importante e complesso, sia come antiossidante, sia come vero e proprio trasduttore di segnali
ossidativi, ad esempio attraverso la glutatiolazione di residui di cisteina delle proteine o attraverso la produzione di specie reattive dell’ossigeno generate dall’autoossidazione dei prodotti del suo catabolismo (Paolicchi A. et al., 2002).
Proprio in questo contesto va considerato che le colture cellulari rappresentano uno strumento indispensabile per lo studio della fisiologia e della patologia cellulare, ma è ormai chiaro che nel modello standard di coltura cellulare l’elevata tensione di ossigeno pone le cellule sotto una elevata pressione ossidativa, e quindi pesantemente interferisce con tutti i meccanismi soggiacenti alla regolazione redox delle funzioni cellulari, senza considerare, alla luce del ruolo dei fattori di trascrizione responsivi all’ipossia , il ruolo diretto della tensione di ossigeno (che in coltura è più elevata che nei tessuti) nella regolazione redox dell’espressione genica, recentemente descritto proprio nel differenziamento dei tessuti fetali (Cowden Dahl KD et al., 2005).
Proprio per quanto detto sopra, è verosimile che la redox regulation in vitro assuma un ruolo importante anche nei meccanismi di proliferazione e differenziamento delle cellule staminali, soprattutto di quelle che, provenendo da tessuti embrionali o fetali, sono fisiologicamente sottoposte ad un ambiente più povero di ossigeno.
Per chiarire la portata dell’influenza dei meccanismi redox nella regolazione in vitro del differenziamento cellulare, si rendono necessari strumenti idonei a determinare lo stato redox su singola cellula, in modo da poter conoscere, ad esempio, il contenuto intracellulare di GSH in cellule esprimenti diversi antigeni di differenziamento.
I risultati della presente tesi suggeriscono che, effettivamente, la fluorescenza intracellulare, che si osserva dopo esposizione delle cellula alla CMFDA, sia funzione del contenuto intracellulare di GSH; infatti, dopo incubazione delle cellule con CMFDA, si osserva il calo del contenuto intracellulare di GSH e l’aumento della fluorescenza cellulare. Il paradossale incremento di fluorescenza osservato dopo deplezione del GSH con DEM è verosimilmente frutto della competizione tra i diversi GSH coniugati (del DEM e della CMFDA) per i trasportatori di membrana che ne mediano l’efflusso. Infatti, depletando le cellule di GSH, attraverso la coltura in presenza di basse concentrazioni di cisteina (che inibiscono la sintesi intracellulare di GSH), la fluorescenza dopo esposizione a CMFDA torna ad essere proporzionale al contenuto intracellulare di GSH. L’associazione tra immunofenotipizzazione e determinazione del GSH intracellulare con CMFDA ha permesso di osservare, in via preliminare, un diverso
contenuto di GSH tra cellule CD34+ e cellule CD73+. Anche se, data la ridotta percentule di elementi CD34+ e CD73+, si rende necessario ripetere l’esperimento su popolazioni arricchite di questi tipi cellulari, il risultato conseguito dimostra quantomeno la fattibilità della doppia determinazione immunologica del fenotipo e del contenuto intracellulare di GSH.
Gli studi citochimici hanno dimostrato che la GGT è presente in elementi cellulari del sangue di cordone ombelicale, già prima della messa in coltura. Negli ultimi anni è emerso sempre con maggior chiarezza che la GGT della membrana cellulare svolge un ruolo significativo nella regolazione redox delle funzioni cellulari. Proprio per il fatto che le reazioni da essa innescate richiedono ossigeno (Stark AA et al., 1993), è probabile che la sua presenza sia uno dei fattori determinanti nell’influenzare il ruolo della tensione di ossigeno in vitro sulle funzioni cellulari. Infatti, la GGT (CD224) è espressa sulla superficie cellulare e la sua attività enzimatica, catalizzando l’idrolisi del GSH, porta alla produzione di cisteinilglicina, che può essere ulteriormente idrolizzata, determinando quindi un aumento della disponibilità di cisteina per la sintesi intracellulare di GSH, oppure può andare incontro ad autoossidazione e causare la produzione di specie reattive dell’ossigeno e radicali liberi (Stark AA et al., 2003).
Proprio su meccanismi come questo la tensione di ossigeno nel mezzo di coltura potrebbe avere un ruolo determinante nel far prevalere l’effetto antiossidante (per la sintesi di GSH intracellulare in presenza di basse concentrazioni di ossigeno) o l’effetto proossidante (per la genesi di radicali liberi in presenza di elevate concentrazioni di ossigeno).
A conferma di questa ipotesi, gli studi citochimici condotti sulle cellule coltivate hanno dimostrato che solo alcune cellule grandi e rotondeggianti esprimono elevati livelli di GGT, mentre gli elementi cellulari più piccoli e quelli fusati (simili morfologicamente alle cellule staminali mesenchimali) ne sono privi. Il fatto che negli strisci di sangue gli elementi positivi sembrino appartenere ai polimorfonucleati neutrofili ed ai monociti, e che in vitro alcuni di essi sembrino fagocitare elementi cellulari più piccoli, suggerisce che tali cellule appartengano allo stame cellulare mielomonocitico, come confermato dalla presenza di attività dimostrabile di GGT anche in polimorfonucleati neutrofili e nei monociti in strisci di midollo osseo. Il potenziale ruolo della GGT nella regolazione redox in colture cellulari da sangue di cordone è poi confermato dal ritrovamento di cisteinilglicina nel terreno condizionato da tali colture, e dalla apparente variazione della concentrazione dei tioli intracellulari ed
extracellulari, indotta dalla coltura in presenza di bassa tensione di ossigeno (alla quale le cellule hanno peraltro dimostrato di adattarsi senza apparente danno morfologicamente apprezzabile.
In conclusione,
- le colture cellulari da sangue di cordone ombelicale contengono cellule con diversa attività di GGT, l’enzima in grado di causare la produzione di specie reattive dell’ossigeno e radicali liberi in presenza di GSH
- sia il GSH (substrato) che la cisteinilglicina (prodotto dell’idrolisi del GSH da parte della GGT) sono presenti nel terreno condizionato dalle colture di cellule da sangue di cordone ombelicale, e la loro concentrazione sembra modificarsi secondo la tensione di ossigeno
- la determinazione del GSH su singola cellula attraverso l’uso del reattivo fluorescente CMFDA, associata all’immuno-fenotipizzazione con anticorpi fluorescenti, potrebbe consentire di studiare nel dettaglio i meccanismi di redox regulation nel corso del differenziamento cellulare.
- A causa della produzione di cisteinilglicina, facilmente
autoossidabile, da parte delle cellule GGT-positive, la bassa tensione di ossigeno in vitro potrebbe rappresentare una
condizione più favorevole per la realizzazione di colture di cellule staminali mesenchimali da sangue di cordone ombelicale umano.
