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INDICE
RIASSUNTO pag. 4
1-INTRODUZIONE pag. 11
1.1 L’asse GH – IGF-I pag. 11
1.1.1 L’ormone della crescita pag. 11
1.1.2 Il fattore di crescita insulino-simile pag. 17
1.1.3 Il recettore dell’IGF-I pag. 20
1.2 La bassa statura pag. 22
1.2.1 Definizione pag. 23
1.2.2 Eziologia pag. 23
1.2.3 Iter diagnostico pag. 24
1.2.4 Bassa statura idiopatica (ISS) pag. 29
1.2.4.1 Definizione pag. 29
1.2.4.2 Progressi nell’eziopatogenesi pag. 30
1.2.4.3 Deficit di IGF-I pag. 32
1.3 Deficit primario di IGF-I o Sindrome da insensibilità all’ormone
della crescita pag. 34
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1.3.1 Definizione pag. 34
1.3.2 Caratteristiche cliniche pag.35
1.3.3 Diagnosi pag. 37
1.3.4 Analisi genetica pag.43
1.3.4.1 Difetti genetici che causano GHI pag. 43
1.3.4.2 Caratteristiche fenotipiche e alterazioni biochimiche in base al difetto
genetico pag. 60
1.3.5 Terapia pag. 69
2-SCOPI DELLO STUDIO pag. 71
3-PAZIENTI E PROTOCOLLO DI STUDIO pag. 72
3.1 Pazienti pag. 72
3.2 Protocollo di studio pag. 73
3.2.1 Valutazione clinica pag. 73
3.2.2 Valutazione endocrinologica pag. 73
3.2.3 Valutazione genetico-molecolare pag. 74
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4-METODI pag. 75
4.1 Valutazione clinica pag. 75
4.2 Valutazione endocrinologica pag. 76
4.3 Valutazione genetico-molecolare pag. 78
5-RISULTATI pag. 82
5.1 Valutazione clinica pag. 82
5.2 Valutazione endocrinologica pag. 89
5.3 Valutazione genetico-molecolare pag. 95
6-DISCUSSIONE pag. 97
7-CONCLUSIONI pag. 107
BIBLIOGRAFIA pag. 109
RINGRAZIAMENTI pag. 125
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RIASSUNTO
Premessa. La normale crescita staturale, sia durante la vita fetale che dopo la nascita, è un processo che deriva dalla somma degli effetti di numerosi geni che regolano a vari livelli l’asse GH – IGF-I e che sono coinvolti nella sopravvivenza della specie.
La bassa statura, definita come altezza < -2 DS rispetto alla media per età, sesso e razza e velocità di crescita al di sotto del 25° percentile, è motivo di frequente consultazione del pediatra, che deve quindi porre molta attenzione alla gestione clinica del bambino con questa patologia.
L’iter diagnostico del bambino con bassa statura deve comprendere un’attenta valutazione clinico-auxologica, seguita da indagini endocrinologiche volte all’identificazione di una diagnosi eziologica certa.
Nonostante questo complesso percorso diagnostico, la bassa statura di circa il 70% dei bambini, resta senza una diagnosi eziologica precisa e viene, quindi, definita bassa statura idiopatica (ISS).
All’interno di questo gruppo di pazienti è possibile individuare quelli che, nonostante la normale secrezione di ormone della crescita (GH), presentano un deficit primario di IGF-I e sono, quindi, affetti da Sindrome da insensibilità al GH (GHI).
Negli ultimi anni l’approfondita conoscenza dell’asse GH – IGF-I e il progresso della biologia molecolare hanno permesso di capire che la GHI,
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in realtà, racchiude in sé un gruppo eterogeneo di quadri clinici, che vanno da forme severe e conclamate di resistenza (come la Sindrome di Laron) a forme più attenuate e parziali. Questo è determinato da un continuum di difetti genetici che possono coinvolgere l’asse GH – IGF-I a vari livelli.
Negli ultimi anni, nonostante la rarità di questa patologia, sono stati identificati dei criteri clinico-endocrinologici per la definizione di GHI:
- bassa statura
- picco di GH > 10 ng/ml in almeno due diversi test di stimolo - valori di IGF-I circolante < -2 DS
- valori di IGFBP-3 < -2 DS
- aumento dei livelli di IGF-I < 15 ng/ml, in risposta al test di generazione dell’IGF-I
L’analisi molecolare, inoltre, assume un ruolo fondamentale nella diagnosi eziologica di GHI: recentemente sono state individuate nuove alterazioni genetiche che coinvolgono il recettore del GH (gene GHR), la via di trasduzione del segnale (gene STAT5B), il gene IGF1 o il gene IGFALS.
Per ogni gene sono state individuate varie mutazioni sia in omozigosi che in eterozigosi, a cui corrispondono diverse caratteristiche fenotipiche e alterazioni biochimiche.
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Scopi dello studio. Gli scopi della presente tesi sono stati quelli di confermare la diagnosi in bambini con sospetta GHI e di stabilire se mutazioni genetiche a livello dell’asse GH – IGF-I possano essere considerate come la causa della patologia in esame. La diagnosi eziologica è stata utile per la successiva scelta terapeutica. Scopi secondari sono stati quelli di dimostrare che bambini affetti da ISS possono, in realtà, avere un’alterazione genetica che causa resistenza al GH e di sottolineare la necessità di ulteriori studi per perfezionare l’iter diagnostico della GHI.
Pazienti e metodi. In questo studio sono stati valutati 6 pazienti (5 maschi e una femmina) di età compresa tra 7,5 e 14 anni con sospetta GHI.
Di tutti i pazienti e dei loro parenti di primo e secondo grado è stata raccolta l’anamnesi fisiologica e patologica. Dei 6 soggetti in esame sono stati valutati altezza e sviluppo puberale ed è stata ricostruita la curva di crescita, con calcolo della velocità di crescita e del target genetico. I pazienti, inoltre, sono stati sottoposti a radiografia del polso e della mano non dominanti per valutare l’età ossea.
Per una completa valutazione endocrinologica, di ogni soggetto è stato dosato il GH basale ed è stata valutata la secrezione dell’ormone in seguito alla somministrazione di due diversi stimoli farmacologici, tra Insulina, Dopamina e Arginina. Inoltre sono stati eseguiti dosaggi dell’IGF-I basale.
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5 bambini sono stati sottoposti al test di generazione dell’IGF-I, con dosaggio di IGF-I e IGFBP-3 all’inizio del test e 12 ore dopo l’ultima iniezione di rhGH.
Per completare l’iter diagnostico, su tutti i pazienti è stata eseguita l’analisi molecolare del gene GHR e di 4 soggetti è stato sequenziato anche il gene IGF1.
Risultati. Dalle notizie ricavate dall’anamnesi dei soggetti in esame è stato possibile escludere le più frequenti cause di bassa statura, come patologie tiroidee, celiachia, malnutrizione o malattie croniche epatiche e renali. La gravidanza è risultata normodecorsa in tutti i pazienti. Inoltre tutti sono nati AGA, ma, tra questi, 4 hanno presentato peso e lunghezza alla nascita ai limiti inferiori del range di normalità per l’età gestazionale. Un dato rilevante emerso dall’anamnesi di 3 pazienti è stata la frequente morbilità delle vie respiratorie nei primi anni di vita.
Al momento dell’osservazione la statura di 2 bambini è risultata sul 3°
percentile, mentre 4 bambini avevano una statura inferiore al 3° percentile.
Il calcolo del target genetico ha mostrato che tutti i soggetti crescevano su un canale nettamente inferiore a quello geneticamente previsto.
La velocità di crescita è risultata ≤ al 25° percentile in tutti i bambini e la valutazione dello sviluppo puberale è risultata in accordo con l’età
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cronologica di ogni soggetto. Dall’esame obiettivo la bassa statura dei soggetti in esame è risultata proporzionata e isolata.
In 5 pazienti l’età ossea è risultata inferiore di 2-3 anni rispetto all’età cronologica. In un solo paziente l’età ossea corrispondeva all’età cronologica.
Per quanto riguarda la valutazione endocrinologica, tutti i pazienti hanno risposto ai test di stimolo del GH, con un picco di GH > 10 ng/ml in almeno 2 diversi test. E’ risultato, inoltre, che tutti i soggetti avevano concentrazioni ematiche di IGF-I francamente al di sotto di - 2 DS rispetto all’età e al sesso.
Per proseguire nell’iter diagnostico, 5 bambini sono stati sottoposti al test di generazione dell’IGF-I.
In tutti i pazienti è risultato un aumento assoluto di IGF-I > 15 ng/ml, in risposta alla somministrazione di rhGH. Nello specifico in 2 soggetti l’aumento della concentrazione di IGF-I è stato di circa 1 DS, mentre negli altri 3 soggetti l’aumento è risultato di 1,5 DS. Di questi 5 bambini solo uno ha raggiunto un valore di concentrazione di IGF-I vicino alla norma, compreso tra 0 e -1 DS.
In 3 pazienti che hanno eseguito il test è stata valutata anche la variazione di IGFBP-3: alla fine del test la concentrazione di IGFBP-3 è aumentata in tutti i pazienti. In 2 soggetti è aumentata di 1 DS, mentre in un soggetto è aumentata di 2 DS.
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I risultati ottenuti da questo test escludono, in tutti i bambini, una resistenza totale al GH, ma non consentono di scartare l’ipotesi di una forma parziale di GHI o di un GH quantitativamente normale ma bioinattivo.
In questo studio, a completamento delle indagini diagnostiche per valutare una possibile forma parziale di GHI, è stato possibile sottoporre i pazienti all’analisi molecolare dei geni GHR e IGF1.
In 6 bambini è stata eseguita l’analisi molecolare del gene GHR: in 5 soggetti non è stata evidenziata la presenza di mutazioni, ma sono stati identificati solo dei polimorfismi nell’esone 10, già noti in letteratura e non correlati alla GHI. In un bambino, invece, è stata individuata una mutazione: si tratta di una trasversione T > A alla posizione + 10 dall’esone 4 del gene GHR, presente in eterozigosi.
Successivamente anche i genitori di questo paziente sono stati sottoposti ad analisi genetica per ricercare la stessa mutazione del gene GHR. E’
risultato che entrambi i genitori non hanno la mutazione evidenziata nel figlio: è quindi possibile che questa alterazione genetica determini un quadro di parziale GHI.
In 4 bambini è stato sequenziato anche il gene IGF1, ma non è stata rilevata alcuna mutazione.
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Conclusioni. La GHI racchiude in sé numerosi quadri clinici, determinati dai diversi difetti genetici che possono coinvolgere l’asse GH – IGF-I a vari livelli.
Uno scrupoloso iter diagnostico nel bambino con sospetta GHI deve comprendere un’attenta valutazione clinico-auxologica e indagini endocrinologiche mirate.
E’ inoltre necessario approfondire le indagini diagnostiche con un’analisi molecolare dei geni che regolano l’asse GH – IGF-I, per verificare la presenza di eventuali mutazioni responsabili del quadro clinico.
Dei 6 bambini valutati in questo studio, 5 non presentavano mutazioni nei geni analizzati. In questi soggetti sono quindi necessari ulteriori approfondimenti diagnostici e indagini genetiche per valutare la presenza di un possibile GH bioinattivo o mutazioni a livello di STAT5B e IGFALS.
In un solo bambino è stata identificata una mutazione de novo a livello del gene GHR, che potrebbe essere responsabile della resistenza al GH.
Dai risultati ottenuti in questo studio è evidente che la diagnosi eziologica di GHI è complicata dal fatto che le alterazioni genetiche a livello dell’asse GH – IGF-I possono influenzare il fenotipo in vari modi, determinando anche quadri clinici di parziale resistenza non facilmente identificabili.
Sono quindi necessari ulteriori studi per aiutare i clinici nella diagnosi eziologica del bambino con GHI e nella scelta del trattamento più adeguato (rhGH o rhIGF-I).
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1-INTRODUZIONE
1.1 L’asse GH – IGF-I
1.1.1 L’ormone della crescita
L’ormone della crescita (GH) è prodotto a livello dell’ipofisi anteriore come una singola catena di 191 amminoacidi, con struttura ad α-elica e non glicosilata. La sua forma matura contiene due legami disulfidici intramolecolari.
La struttura del GH è omologa ad altre proteine prodotte dall’ipofisi e dalla placenta, come prolattina e lattogeno placentare, suggerendo una comune origine ancestrale dei geni che codificano per questi ormoni.
I due geni che codificano per il GH (GH1 e GH2) sono situati sul braccio lungo del cromosoma 17; solo il gene GH1 codifica per il GH ipofisario, mentre il gene GH2 codifica per una variante non espressa dall’ipofisi.
Esistono diverse forme molecolari di GH: la principale (circa il 75%) è quella con peso molecolare di 22kDa [1].
La secrezione ipofisaria di questo ormone è pulsatile, con circa 8 picchi (pulse) nelle 24 ore. La massima produzione avviene durante la notte, negli stadi III e IV del sonno.
La secrezione del GH è finemente regolata dall’azione combinata e contrapposta di due neuro-ormoni ipotalamici, il GH-Releasing Hormone
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(GHRH) e la Somatostatina (SS), i quali rispettivamente ne stimolano e ne inibiscono il rilascio [1] (Fig. 1). Nello specifico il GHRH determina l’ampiezza dei pulse, mentre l’intermittente ritiro della Somatostatina dalla circolazione sanguigna regola il momento in cui avviene il picco di secrezione.
L’equilibrio tra Somatostatina e GHRH è a sua volta regolato da numerosi neurotrasmettitori e neuropeptidi, come serotonina, istamina, adrenalina, dopamina, acetilcolina, TRH, calcitonina e VIP.
Un altro stimolo al rilascio di GH dall’ipofisi è dato dall’attivazione del GHS-R (Growth Hormone Secretagogue Receptor) ad opera della grelina, ormone prodotto dallo stomaco (Fig. 1). Recentemente sono stati sintetizzati altri peptidi, denominati GH-Releasing Peptides (GHRPs), che si legano al GHS-R e determinano secrezione di GH [2].
Lo stesso ormone della crescita può inibire la sua secrezione attraverso un meccanismo di feedback corto negativo che agisce a livello ipotalamico [3].
La secrezione di GH è anche influenzata da una varietà di altri ormoni (androgeni, estrogeni, tiroxina, glucocorticoidi) e dal feedback negativo del Fattore di crescita Insulino-simile di tipo I (IGF-I) prodotto dal fegato in risposta allo stesso GH.
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Oltre ai fattori ormonali esistono anche numerose condizioni fisiologiche che influenzano la secrezione di GH, come ad esempio le diverse fasi del sonno, lo stato nutrizionale, il digiuno, l'esercizio fisico e lo stress.
La concentrazione dell’ormone della crescita nel sangue varia a seconda dell’età: nel neonato è elevata a causa di un aumento della frequenza e dell’ampiezza dei picchi secretori. Dopo i primi giorni di vita la produzione di GH si riduce e resta costante fino alla pubertà, momento in cui si ha la massima secrezione. Dalla tarda adolescenza la concentrazione di GH inizia a ridursi progressivamente [4].
Una volta secreto, il 50% del GH circola in forma libera e il rimanente in forma legata alle GH Binding Proteins (GHBPs), che rappresentano il dominio extracellulare del recettore del GH [1] (Fig. 1).
A livello epatico, il GH si lega al suo recettore (GHR) (Fig.1), un membro della famiglia dei recettori delle citochine, codificato da un gene situato sul cromosoma 5p13.1-p12.
Il GHR è formato da tre regioni: una porzione extracellulare che lega il GH, un dominio transmembrana e una porzione intracellulare contenente la regione Box1, la quale lega costitutivamente la tirosin-chinasi Janus 2(JAK2).
Questo recettore presenta numerose omologie con il recettore della prolattina e con altri recettori per le interleuchine (eritropoietina, leptina, GM-CSF e interferon) [1, 5].
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Oggi recenti studi [6] suggeriscono che il recettore del GH sia debolmente ma costitutivamente pre-dimerizzato a formare un omodimero in cui i due recettori sono rialzati e ruotati l’uno rispetto all’altro, in modo da poter legare due differenti superfici della stessa molecola di ligando (GH) [5].
Una molecola di GH viene guidata da interazioni elettrostatiche verso la porzione extracellulare dell’omodimero e vi si lega con specifici legami a idrogeno. In seguito avviene un cambio conformazionale nella regione transmembrana e la rotazione della struttura recettoriale che induce l’attivazione della trasduzione del segnale attraverso la via JAK/STAT (Janus Activate Kinase/Signal Transducers and Activators of Transcription). Viene, infatti, attivata JAK2, una tirosin-chinasi che autofosforila i residui tirosinici della porzione intracellulare dei due recettori, creando siti di legame per le altre proteine coinvolte nella trasduzione: le quattro molecole STAT (STAT-1, STAT-3, STAT-5a e STAT-5b), MAP kinasi/ERK, PI3K/Akt e NFkB.
E’ stato dimostrato che il legame di STAT-5b a una delle numerose tirosine fosforilate da JAK2 è necessario per l’inizio della trasduzione e per la produzione di IGF-I che ne deriva. STAT-5b, infatti, dopo essere stato fosforilato da JAK2, si stacca dal recettore e forma un omodimero che trasloca nel nucleo e si lega agli elementi cromosomici responsivi al GH. In questo modo viene regolata la trascrizione di geni che codificano per IGF-I, IGFBP3 e ALS [7, 8].
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L’ormone della crescita stimola la crescita staturale sia direttamente, legandosi ai suoi recettori sulle cartilagini di accrescimento epifisarie, sia indirettamente mediante una combinazione di componenti (IGF-I, IGFBP- 3, IGF-IR) [7, 9]. Inoltre il GH ha numerose altre funzioni metaboliche, tra cui aumentare la densità minerale ossea e la massa muscolare, promuovere la produzione di insulina, aumentare la lipolisi, diminuire il trasporto del glucosio a livello del tessuto adiposo e la lipogenesi [8].
E’ ben noto che il GH e il suo mediatore periferico IGF-I (o somatomedina C) possono aumentare la velocità di crescita e accelerare la maturazione ossea mediante il loro legame ai rispettivi recettori espressi dai condrociti della piastra epifisaria, un sottile strato di cartilagine tra epifisi e metafisi all’estremità delle ossa lunghe [10].
Oltre alla sua azione diretta, il GH esplica il suo effetto sulla crescita principalmente attraverso la produzione di IGF-I a livello epatico (circa il 75% dell’IGF-I totale) e, in misura minore, a livello di altri tessuti.
A livello non-epatico, oltre al GH, anche altri fattori di crescita e citochine hanno effetti di crescita locale, sia con meccanismi indipendenti dalla secrezione di IGF-I, sia stimolando la produzione della somatomedina [7].
Nel corso degli anni molti studiosi hanno cercato di approfondire la conoscenza degli esatti meccanismi di azione del GH e del suo mediatore periferico. Inizialmente l’ “Ipotesi delle somatomedine” (Daughaday et al.) proponeva che il legame del GH al suo recettore a livello epatico
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stimolasse la produzione di somatomedina C, la quale, poi, promuoveva la crescita longitudinale ossea in modo indipendente. Tuttavia fu successivamente scoperto che le somatomedine sono espresse in molti tessuti e quindi, nel 1985, fu elaborata la “Dual effector hypothesis”.
Questa teoria affermava la necessità sia del GH che dell’IGF-I a livello delle cartilagini di accrescimento: il GH ha effetti locali sulla cartilagine di accrescimento, cioè stimola la differenziazione dei precondrociti, mentre l’IGF-I stimola la loro espansione clonale e maturazione [2, 7, 9]. Questa ipotesi è basata sulla capacità dell’IGF-I di funzionare sia come fattore endocrino, sia come fattore autocrino/paracrino.
E’ stato stimato che circa il 20% della normale crescita è il risultato sia dell’effetto diretto del GH sulla maturazione ossea sia della produzione e azione locale dell’IGF-I su questo tessuto (effetto indipendente dal GH) [2].
Nel 2007 Kaplan e Cohen proposero l’ipotesi “agonista/antagonista”:
l’IGF-I amplifica le azioni anaboliche del GH, mentre antagonizza i potenziali effetti indesiderabili del GH sulla gluconeogenesi e lipolisi (iperglicemia e deplezione delle riserve lipidiche) [11].
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1.1.2 Il fattore di crescita insulino-simile
L’IGF-I, mediatore periferico dell’ormone della crescita, è un piccolo ormone peptidico di 70 amminoacidi che appartiene alla famiglia degli Insulin-Like Growth Factors, insieme all’IGF-II e all’insulina.
Sia l’IGF-I che l’IGF-II hanno un alto grado di omologia con la proinsulina (circa il 40% degli amminoacidi): questo spiega la capacità dell’IGF-I e dell’IGF-II di legarsi al recettore per l’insulina e la capacità dell’insulina di legarsi al recettore dell’IGF-I di tipo 1 [12].
L’IGF-I è formato da una catena A e da una catena B, connesse da un legame disulfidico, e da una regione C-peptidica, non omologa a quella dell’insulina [1].
Il gene che codifica per l’IGF-I (noto come IGF1) si trova sul cromosoma 12 e contiene almeno sei esoni, mentre quello che codifica per l’IGF-II si trova sul cromosoma 11p15, adiacente al gene per l’insulina.
L’IGF-I, oltre ad essere prodotto dal fegato in risposta all’ormone della crescita, è sintetizzato anche dai condrociti e da altre cellule del microambiente osseo, come gli osteoblasti e gli osteoclasti [3].
Da recenti studi genetici è risultato che sia l’IGF-I prodotto dal fegato (IGF-I endocrino) che l’IGF-I prodotto de novo a livello locale hanno la capacità di stimolare la crescita longitudinale delle ossa. Ciò nonostante l’IGF-I epatico non è indispensabile: infatti l’IGF-I endocrino e l’IGF-I
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locale presentano una sovrapposizione degli effetti e possono avere parzialmente la capacità di sostituirsi l’un l’altro nel mantenere la normale crescita ossea [3]. L’IGF-I endocrino non può, però, essere sostituito in altre importanti funzioni, come regolare la pressione sanguigna, la crescita di vari organi e lo sviluppo cerebrale (stimolare la neurogenesi e la mielinizzazione, promuovere la sopravvivenza di neuroni e oligodendrociti).
Sia l’IGF-I che l’ IGF-II hanno inoltre un ruolo fondamentale per la crescita e per lo sviluppo cerebrale durante la vita intrauterina e, in epoca prenatale, la loro secrezione è indipendente dal GH [5].
La concentrazione sierica di IGF-I è dipendente dall’età: nel feto è relativamente bassa; durante l’infanzia si verifica un lento e graduale aumento e nella pubertà la concentrazione è circa due o tre volte quella dell’adulto. Dopo l’adolescenza la concentrazione sierica di IGF-I mostra un progressivo declino.
Circa l’80% dell’IGF-I circola nel siero in un complesso ternario insieme a ALS (Acid-Labile Subunit) e IGFBP-3 (Insulin-like Growth Factor Binding Protein), anche questi prodotti a livello epatico come diretto effetto del GH (Fig. 1).
L’integrità del complesso ternario e i livelli sierici di ALS e IGFBP-3 sono essenziali per mantenere l’IGF-I circolante [3], per prolungarne l’emivita fino a 12 ore e per rilasciarlo a livello periferico dove può esercitare la sua
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azione (effetto insulino-simile e stimolo per la proliferazione e differenziazione cellulare) [13].
Le ALS appartengono alla famiglia delle proteine ricche in leucine [14] e sono necessarie per stabilizzare il complesso ternario, riducendo il passaggio di IGF-I nel compartimento extravascolare [2]. Le IGFBPs sono una famiglia di sei proteine che si legano con alta affinità all’IGF-I e all’IGF-II. Esse, in particolare le IGFBP-3, modulano l’azione dell’IGF-I:
regolano il suo accumulo e rilascio in circolo, inibiscono il suo legame allo specifico recettore, lo trasportano dallo spazio intravascolare a quello extravascolare e ne riducono il legame al recettore dell’insulina, diminuendo così il rischio di ipoglicemia [1]. Inoltre le IGFBPs sono in grado di svolgere altre funzioni indipendenti dall’IGF-I, come interagire con le proteine della matrice extracellulare influenzando la migrazione cellulare [15].
I livelli sierici di IGFBP-3 sono costanti per tutto il giorno e sono strettamente dipendenti dal GH [16].
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1.1.3 Il recettore dell’IGF-I
L’IGF-I esplica le sue azioni mitogeniche a livello delle cellule e dei tessuti che esprimono lo specifico recettore (IGF-IR di tipo 1) (Fig. 1). Questo è un recettore tirosin-kinasico, omologo al recettore dell’insulina e codificato dal gene IGF1R che si trova sul cromosoma 15q26.3.
Nello specifico il recettore dell’IGF-I è un tetramero, formato da due subunità α (porzione extracellulare coinvolta nel legame con l’IGF-I) e due subunità β (con attività tirosin-kinasica intrinseca).
Il legame dell’IGF-I con il suo recettore provoca un’autofosforilazione che recluta componenti citoplasmatiche necessarie per la trasduzione del segnale (PI3K/Akt e MAP/Erk) [1, 7]. Questo porta alla crescita cellulare attraverso l’attivazione del ciclo cellulare, la protezione dall’apoptosi e l’induzione della differenziazione cellulare [10].
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Figura 1. L’asse GH – IGF-I (immagine riadattata da Trends Endocrinol Metab, 2002)
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1.2 La bassa statura
La crescita è un fenomeno complesso influenzato dall’interazione di diversi fattori psico-sociali, ambientali (nutrizione e attività fisica), ormonali e genetici. L’altezza è, infatti, un tratto poligenico che conta l’influenza di più di 180 loci genici. [17, 18].
L’importanza dell’influenza dei geni è dimostrata da numerosi studi di Genome-Wide Association, che hanno identificato centinaia di polimorfismi di singoli nucleotidi associati alla bassa statura, nonostante il ruolo di queste alterazioni sia ancora largamente sconosciuto [19, 20].
La bassa statura è oggi motivo di frequente consultazione del pediatra [21].
Il problema dell’altezza è, infatti, diventato molto importante negli ultimi anni a causa di diversi fattori. Primo tra tutti il fenomeno del “secular trend” della statura nel XX secolo, che ha determinato una maggiore altezza dei bambini e degli adolescenti rispetto al passato. Inoltre la bassa statura ha un importante effetto psico-sociale sul bambino e sulla famiglia, a causa anche dell’impatto dei “media” che associano ad una maggiore statura maggiori benefici sociali [4].
E’ quindi fondamentale porre molta attenzione alla gestione del paziente di bassa statura, valutando la reale necessità di una terapia e considerando il rapporto rischio/beneficio caso per caso [22]. Il pediatra deve anche
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considerare l’eventuale utilità di un sostegno psicologico per il bambino e per la sua famiglia [23].
1.2.1 Definizione
La bassa statura è definita come un’altezza, correlata all’età, < -2 DS rispetto alla media per sesso e razza. Utilizzando le curve di crescita standard (tavole dei percentili di Tanner) la bassa statura è rappresentata al di sotto del 3° percentile [24].
Inoltre nella bassa statura la velocità di crescita è ridotta al di sotto del 25°
percentile e la previsione staturale del bambino è inferiore al target genetico [4].
1.2.2 Eziologia
Le cause di bassa statura sono molteplici e i bambini con questo fenotipo rappresentano un gruppo molto eterogeneo di pazienti [25].
Una prima classificazione comprende:
varianti normali: bassa statura familiare, ritardo costituzionale di crescita e forme miste
condizioni patologiche:
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- di tipo endocrinologico (deficit di ormone della crescita, ipotiroidismo, morbo di Cushing, rachitismo ipofosfatemico familiare)
- di tipo non-endocrinologico, come le malattie genetiche malformative, le osteocondrodisplasie, i disturbi gastrointestinali da malassorbimento (celiachia), la sindrome da deprivazione affettiva e altre malattie croniche (cardiopatie, neuropatie, emopatie).
In una posizione intermedia tra queste condizioni si classificano il bambino SGA (Small for Gestional Age) e la bassa statura idiopatica (Idiopatic Short Stature, ISS).
1.2.3 Iter diagnostico
L’approccio alla diagnosi nel bambino di bassa statura deve essere graduale e il pediatra endocrinologo ha il compito di integrare tutti i dati disponibili al fine di differenziare le varie forme di bassa statura. Infatti ogni bambino con altezza inferiore al 3° percentile e velocità di crescita inferiore al 25°
percentile deve ricevere una completa valutazione clinica e di laboratorio, utile per una corretta diagnosi differenziale.
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Inizialmente la raccolta di un’esauriente anamnesi e la valutazione clinica del paziente sono fondamentali per orientare la ricerca della causa della bassa statura.
Il pediatra deve raccogliere informazioni sul decorso della gravidanza (particolari patologie, potenziale esposizione a sostanze teratogene, funzionalità placentare) e sulla nascita del bambino (tipo di parto, settimane di gestazione, peso e lunghezza del neonato, eventuali complicanze) [24].
Inoltre è necessario raccogliere un’accurata anamnesi fisiologica del bambino e indagare la presenza di disordini metabolici o endocrini (patologie tiroidee), malassorbimenti (celiachia), malattie croniche, alterazioni nell’alimentazione e utilizzo di farmaci.
Successivamente il pediatra deve raccogliere informazioni sulla storia familiare, nello specifico sullo sviluppo puberale dei genitori (età del menarca della madre), sulla loro statura e sul pattern di crescita familiare [26].
Con l’esame obiettivo si misurano l’altezza e il peso del bambino. Per confrontare i dati auxologici ottenuti con quelli medi per età, sesso e razza, si utilizzano le tavole dei percentili di Tanner, in cui si identificano diverse linee, ai cui estremi si trovano le linee del 3° e del 97° percentile (corrispondenti rispettivamente ad altezza e peso minimi e massimi ritenuti normali).
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Il pediatra deve inoltre valutare la velocità di crescita del paziente, con tavole percentiliche specifiche per sesso, e il target genetico, calcolato in base alla statura dei genitori [26].
Può essere utile anche il calcolo del BMI (Kg/m²), da valutare in base all’età del bambino, e la misura della circonferenza cranica, che correla strettamente con l’altezza e il peso del paziente [27].
Per differenziare le forme di bassa statura proporzionata da quelle di bassa statura non proporzionata è necessario eseguire la misurazione della statura da seduto e il rapporto tra segmento superiore e segmento inferiore. Inoltre è utile ricercare la presenza di caratteri dismorfici tipici ed eventualmente procedere con un’indagine scheletrica e con l’analisi molecolare del gene SHOX [24].
Dopo l’anamnesi e l’esame obiettivo è necessario approfondire l’iter diagnostico con una radiografia del polso e della mano non dominante per risalire all’età ossea (che rappresenta la maturità scheletrica) e confrontarla con l’età cronologica del bambino. Ciò consente di stimare il potenziale di crescita residuo e di calcolare il Predicted Adult Height (PAH), che rappresenta l’altezza prevista da adulto stimata in base all’età ossea [28].
L’età ossea è solitamente ritardata nei bambini nati SGA e nei bambini affetti da deficit di GH. Nell’ISS di solito il ritardo è approssimativamente di 1,5-2 anni, mentre può essere maggiore nel ritardo costituzionale di crescita e pubertà [29].
27
Inoltre sono necessarie analisi di laboratorio generiche (esame emocromocitometrico completo, VES, fosfatasi alcalina, elettroliti, ferritina, indici di funzionalità renale ed epatica) e più specifiche per escludere patologie tiroidee o malassorbimenti [26].
Se si sospetta un deficit di GH secondario ad ipopituitarismo o una lesione intracranica può essere utile una risonanza magnetica della regione ipotalamo-ipofisaria [30].
Un’analisi del cariotipo dovrebbe essere fatta nel sospetto di Sindrome di Turner. Negli ultimi anni lo sviluppo di tecniche ad alta risoluzione che sequenziano l’intero genoma ha permesso di determinare numerose nuove aberrazioni cromosomiche e di facilitare la diagnosi di sindromi causate da micro-delezioni o duplicazioni [31].
A questo punto dell’iter diagnostico è fondamentale una valutazione ormonale del bambino di bassa statura, con bassa velocità di crescita o con bassi livelli di IGF-I [32]. Per indagare la produzione dell’ormone della crescita si utilizzano i test di stimolo, che consistono nel somministrare al paziente uno stimolo per la secrezione dell’ormone della crescita. Gli stimoli più comunemente utilizzati sono l’Arginina, l’Insulina o la Dopamina. Le principali limitazioni di questi test sono: scarsa riproducibilità a causa della secrezione pulsatile del GH e dipendenza dall’età e dagli ormoni sessuali [33].
28
In un bambino che soddisfa i criteri clinici di deficit di ormone della crescita (GHD), un picco di GH < 10 ng/ml in due diversi test di stimolo conferma la diagnosi [26].
Per un’analisi più completa della funzionalità dell’asse GH – IGF-I è necessario dosare l’IGF-I sierico [34]. Questa misurazione, però, non è priva di errori, soprattutto a causa del legame della somatomedina con le proteine trasportatrici e a causa della dipendenza dell’IGF-I dall’età e da altre condizioni (ad esempio la malnutrizione e la malattia celiaca) [35].
Negli ultimi trent’anni sono state utilizzate tecniche di immunodosaggio, ma oggi si sono sviluppate nuove prospettive per dosare più precisamente l’IGF-I circolante mediante test biologici [36, 37]. Resta ancora controverso l’utilizzo del dosaggio dell’IGF-I libero, cioè non legato, in alcuni pazienti con disordini della crescita [38].
Nonostante questo complesso percorso diagnostico, la bassa statura di molti bambini resta senza una diagnosi eziologica precisa e viene, quindi, definita bassa statura idiopatica (ISS).
29
1.2.4 Bassa statura idiopatica (ISS)
1.2.4.1 Definizione
Il termine ISS (Idiopatic Short Stature) è utilizzato per descrivere un gruppo eterogeneo di bambini affetti da bassa statura, la cui causa non è stata identificata.
La bassa statura idiopatica è definita come una condizione in cui l’altezza di un individuo è più di 2 DS al di sotto della media corretta per età, sesso e razza, senza evidenza di anormalità sistemiche, endocrine, nutrizionali, psichiatriche o cromosomiche. Nello specifico, i bambini con ISS hanno normale peso e lunghezza alla nascita (assenza di ritardo intrauterino di crescita) e normali proporzioni corporee. Inoltre producono l’ormone della crescita in quantità sufficienti, ovvero, in risposta a un qualsiasi test di stimolo farmacologico, si ottiene un picco di GH > 10 ng/ml [39].
E’ stato stimato che approssimativamente il 70% dei bambini di bassa statura rientra in questa categoria.
Secondo alcuni autori la bassa statura familiare e il ritardo costituzionale di crescita possono essere considerate sotto-categorie di ISS, ma tutt’oggi questo è ancora dibattuto [40, 41].
30
1.2.4.2 Progressi nell’eziopatogenesi
Negli ultimi anni, grazie al progresso della biologia molecolare e della genetica, sono emerse nuove ipotesi sulla fisiopatologia dell’ISS. Molti autori ipotizzano che l’ISS sia il risultato di alterazioni genetiche di vario tipo:
- mutazione di un singolo gene (rara);
- polimorfismo di multipli geni con effetto cumulativo sulla statura;
- mutazione di geni associati al ritardo di maturazione delle cartilagini di accrescimento [42]
Nello specifico sono stati riconosciuti numerosi difetti genetici a livello dell’asse GH – IGF-I in bambini inizialmente etichettati come bassa statura idiopatica [43, 44]; ciò sottolinea l’importanza dell’analisi genetica per porre una diagnosi eziologica certa [45, 46].
Ultimamente, in seguito a queste nuove acquisizioni, è emerso il concetto di una continuità dei difetti genetici all’interno dell’asse GH – IGF-I, la cui integrità è necessaria per la normale crescita fetale e post-natale. Un singolo difetto nell’asse causa un’alterazione di tutte le proteine a valle, determinando un quadro clinico caratterizzato da bassa statura [9]. In realtà il range di mutazioni genetiche può coinvolgere l’Asse a qualsiasi livello e
31
può così determinare un continuum di caratteri fenotipici e alterazioni biochimiche che vanno dal deficit di GH alla resistenza al GH [9].
Oltre ai difetti genetici già noti da tempo (mutazioni dei geni codificanti per il GH, che determinano il quadro clinico noto come deficit di GH o GHD), negli ultimi anni l’analisi molecolare ha permesso di individuare nuove alterazioni genetiche in bambini di bassa statura che non presentano un deficit di GH (ISS) [46].
I possibili difetti genetici a livello dell’asse GH – IGF-I in pazienti già diagnosticati come ISS sono così classificabili [7]:
Difetti del gene GHR
Mutazione a livello della porzione extracellulare del recettore
Mutazione a livello della porzione transmembrana del
recettore
Mutazione a livello della porzione intracellulare del recettore
Difetti della trasduzione del segnale (gene STAT5B)
Mutazioni di SHP-2 (codificato dal gene PTPN11), di K-RAS, di H- RAS
Mutazioni o delezioni del gene IGF1
Difetti che causano deficienza di IGF-I
IGF-I bioinattivo
Difetti del gene IGFALS
32
Mutazioni del gene IGF1R
E’ possibile suddividere ulteriormente questo gruppo eterogeneo di pazienti in base ai livelli di IGF-I circolante [21]:
bambini con un parziale o totale deficit di IGF-I: presentano
alterazioni del gene del recettore del GH o della trasduzione del segnale o dei geni IGF1 e ALS.
bambini con alti livelli sierici di IGF-I (Sindrome da resistenza
all’IGF-I): presentano alterazioni del gene del recettore dell’IGF-I (IGF1R).
1.2.4.3 Deficit di IGF-I
La condizione di deficit parziale o totale di IGF-I, considerate le numerose azioni di questo ormone, produce una serie di effetti che culminano in sindromi riconosciute con caratteristiche cliniche peculiari, tra cui bassa statura, ritardo di crescita intrauterina, sindrome metabolica, patologie cardiovascolari e neurologiche [47].
Numerose sono le cause che possono determinare ridotti livelli di IGF-I circolante, tra cui disfunzioni ipotalamiche, deficit di GH per alterazioni ipofisarie e resistenza primaria o secondaria al GH. E’ quindi necessario
33
stabilire una classificazione eziologica accurata, tenendo conto delle nuove alterazioni genetiche individuate nell’asse GH – IGF-I [48].
Oggi si distinguono due forme di deficit di IGF-I [49]:
Deficit primario di IGF-I: dovuto a cause genetiche, come
mutazioni di GHR o della trasduzione del segnale o del gene IGF1 o IGFALS (Sindrome da insensibilità al GH)
Deficit secondario di IGF-I: dovuto a tutte quelle condizioni
genetiche e non che riducono la secrezione del GH oppure dovuto alle alterazioni genetiche che determinano la produzione di un GH bioinattivo o la mancata espressione del recettore del GH (difetto gene GHSR) con normale secrezione dell’ormone della crescita. In questo gruppo rientrano anche le cause acquisite (non genetiche) che impediscono un’appropriata produzione di IGF-I, come grave malnutrizione, diabete mellito di tipo 1, cirrosi, disordini infiammatori cronici e stati catabolici.
34
1.3 DEFICIT PRIMARIO DI IGF-I O SINDROME DA INSENSIBILITA’ ALL’ORMONE DELLA CRESCITA
1.3.1 Definizione
Il Deficit primario di IGF-I, conosciuto come Sindrome di Laron, fu descritto per la prima volta da Laron et al. nel 1966 [7].
Questa rara patologia è una condizione autosomica recessiva caratterizzata da bassa statura e dall’incapacità di sintetizzare l’IGF-I nonostante elevati o normali livelli di ormone della crescita (resistenza all’azione del GH).
Nel corso degli anni sono state individuate più di 60 differenti mutazioni che possono spiegare questa condizione, la maggior parte delle quali coinvolge il dominio extracellulare del recettore del GH [1].
Recentemente, grazie ai progressi della genetica, è emerso che questa malattia, in realtà, rappresenta solo una forma estrema di un gruppo eterogeneo di patologie che vengono incluse nel termine Sindrome da insensibilità all’ormone della crescita (Growth Hormone Insensitivity, GHI). Questo termine, infatti, comprende molte alterazioni fenotipiche e biochimiche dovute a vari difetti molecolari all’interno dell’asse GH – IGF-I [7]. Queste alterazioni possono coinvolgere geni che codificano per il recettore del GH, per proteine coinvolte nella trasduzione del segnale o nella sintesi e nel trasporto dell’IGF-I [50].
35
Studi retrospettivi su pazienti con ISS hanno evidenziato che circa il 25- 50% di questi soggetti ha una concentrazione di IGF-I notevolmente ridotta in presenza di una normale secrezione di GH; sono quindi affetti da GHI [46, 51].
1.3.2 Caratteristiche cliniche
Le caratteristiche cliniche variano dalla forma più severa, conosciuta come Sindrome di Laron, a forme meno gravi, in cui è presente una parziale resistenza al GH.
I bambini affetti dalla Sindrome di Laron sono di bassa statura (altezza < 3 DS) e possono presentare altri caratteri tipici: ipoplasia delle ossa nasali, protuberanze frontali, capelli radi, cute e annessi fragili, voce acuta e sclere blu per il ridotto spessore del tessuto connettivo. Generalmente hanno una riduzione del volume dei visceri, un’ipoplasia laringea e un iposviluppo della muscolatura che provoca un ritardo nella deambulazione; inoltre presentano osteopenia con aumento dell’incidenza della necrosi avascolare della testa del femore e un ritardo nella dentizione.
Nonostante normali livelli di ormoni sessuali, i bambini con Sindrome di Laron presentano spesso una pubertà ritardata con funzionalità riproduttiva conservata [47].
36
Dal punto di vista ormonale questi pazienti hanno appropriati livelli sierici di GH e bassi livelli di GHBP, IGF-I, IGFBP-3 e ALS.
Come già detto in precedenza, oltre a questo tipo di pazienti, diversi studi [52] hanno dimostrato la variabilità di caratteri fenotipici e bio-ormonali dei bambini affetti da GHI e l’esistenza di numerose varianti atipiche.
Esiste, infatti, un sottogruppo di pazienti con un fenotipo più attenuato, senza alterazioni della facies o scheletriche e con normali dimensioni alla nascita. Questi soggetti presentano bassa statura moderata (o comunque un deficit di altezza minore rispetto alla forma classica) e alterazioni ormonali ai limiti bassi della norma [53]. Possono anche rispondere in modo parziale alla somministrazione di GH esogeno. Questo è la conferma che la Sindrome da insensibilità al GH può essere totale o parziale e ciò è influenzato dal tipo di difetto genetico che ne è alla base. La severità del fenotipo del paziente è, infatti, correlata agli effetti che la mutazione esercita sulla struttura e sulla funzione della proteina codificata [54].
37
1.3.3 Diagnosi
Per la diagnosi di Sindrome da insensibilità al GH è necessaria la combinazione di appropriati dosaggi ormonali con un’attenta valutazione auxologica, che comprende la valutazione dell’altezza e della velocità di crescita nel tempo.
L’iter diagnostico da seguire è quello utilizzato per qualsiasi bambino di bassa statura (anamnesi, esame obiettivo, età ossea, esami di laboratorio, valutazione ormonale), al fine di indagare le più comuni cause del deficit staturale (ad esempio: deficit di GH, celiachia, malnutrizione, patologie tiroidee). Escluse tutte le cause precedentemente menzionate è possibile porre il sospetto di GHI se il paziente ha una normale produzione di GH associata a bassi livelli circolanti di IGF-I e IGFBP-3.
Nel corso degli anni molti autori hanno proposto vari metodi per approfondire la valutazione del bambino con sospetta GHI e porre la diagnosi di certezza, prendendo in considerazione diversi parametri e assegnando un punteggio (score) per ognuno di questi. Ad esempio, Savage e Rosenfeld nel 1999 idearono un metodo basato su 5 parametri:
1. altezza < 3 DS;
2. GH basale > 5 ng/ml;
3. IGF-I sierico < 50 ng/ml;
4. GHBP < 10%;
38
5. incremento di IGF-I in risposta alla somministrazione di GH esogeno
< 10%.
Successivamente, Blum e i suoi colleghi proposero diverse correzioni a questi criteri, supportati dal progresso delle tecniche di dosaggio ormonale e delle nuove conoscenze nell’ambito dell’Asse GH – IGF-I. I cambiamenti più importanti furono:
- la valutazione del profilo di secrezione del GH piuttosto che una sola misurazione, data la pulsatilità di questo ormone;
- l’utilizzo di immunodosaggi ad alta sensibilità per il dosaggio dell’IGF-I e la definizione dei range di normalità in base all’età del bambino, utilizzando come cut-off il 3° percentile;
- la definizione di fallita risposta al GH esogeno se l’aumento di IGF-I è minore di 15 ng/ml;
- l’introduzione del dosaggio dell’IGFBP-3 dopo somministrazione di GH.
Recentemente, sulla base dei dati ottenuti in uno studio condotto su larga scala per individuare i pazienti con GHI che potessero beneficiare del trattamento con rhIGF-I, è stato proposto un nuovo sistema che valuta i seguenti parametri, assegnando ad ognuno un punto [55]:
- Altezza < -3 DS per sesso ed età - Livelli di GH > 4mU/l
39
- Livelli di IGF-I basale < 3° percentile - Livelli di IGFBP-3 basale < 3° percentile - GH legato alle GHBPs < 10%
- Aumento di IGF-I in risposta all’IGF-I generation test < 15 ng/ml - Aumento di IGFBP-3 in risposta all’IGF-I generation test < 0,4 mg/l
Un punteggio ≥ 5 è suggestivo di GHI.
Le attuali conoscenze nel campo della bassa statura idiopatica e del deficit di IGF-I hanno portato molti autori ad affermare l’utilità di questi scoring systems, ma solo per le forme severe e tipiche di GHI. E’, infatti, necessario
utilizzarli con cautela e con criterio, in quanto potrebbero escludere pazienti con particolari difetti genetici o pazienti con un fenotipo più attenuato [55].
Oggi i valori ormonali di riferimento per la diagnosi di GHI sono [56]:
- picco di GH > 10 ng/ml in almeno due diversi test di stimolo - valori di IGF-I circolante < -2 DS
- valori di IGFBP-3 < -2 DS
- aumento dei livelli di IGF-I < 15 ng/ml in risposta al test di generazione dell’IGF-I
La determinazione dell’IGFBP-3, ottenuta con immunodosaggi tecnicamente semplici e molto sensibili, offre più vantaggi rispetto alla
40
determinazione dell’IGF-I, come ad esempio una minore variabilità in base all’età e una minore dipendenza da fattori nutrizionali.
I valori di sensibilità, specificità ed efficienza diagnostica sono riportati nella seguente Tabella [57].
Sensibilità Specificità
Efficienza diagnostica
IGF-1 66,7% 79,1% 77,3%
IGFBP-3 70,8% 83,7% 80,9%
ALS 66,7% 91,9% 86,4%
Il test di generazione dell’IGF-I (IGF-I generation test) misura i livelli di IGF-I circolanti in risposta all’iniezione sottocutanea di GH ricombinante (rhGH). Inoltre è possibile anche dosare la concentrazione delle IGFBP-3, essendo la loro produzione influenzata dal GH [58].
Questo test è utilizzato nell’iter diagnostico dei bambini di bassa statura, in particolare quelli con ISS e con deficit primario di IGF-I, per verificare se è presente una resistenza all’ormone della crescita o se l’ormone prodotto è qualitativamente alterato (GH bioinattivo) [59]. Questo test, inoltre, è utile per supportare la scelta terapeutica, in particolare per prevedere la risposta del paziente alla somministrazione di rhGH [60].
41
I criteri di selezione dei pazienti da sottoporre al test sono:
- bassa statura
- normali o elevati livelli di GH - bassi livelli di IGF-I (< - 2 DS)
Esistono diversi protocolli per l’esecuzione del test di generazione dell’IGF-I. Il più utilizzato consiste nell’iniezione sottocutanea di rhGH alla dose di 0,033 mg/Kg/die per quattro giorni. Il quinto giorno si esegue il dosaggio di IGF-I e IGFBP-3 e si confrontano i risultati con quelli ottenuti prima di iniziare le iniezioni [58].
Si considera come suggestivo di severa sindrome da insensibilità al GH un aumento assoluto di IGF-I minore di 15 ng/ml e un aumento di IGFBP-3 minore di 0,4 mg/l [61].
Il test di generazione dell’IGF-I ha, però, dei limiti in quanto non riesce ad individuare le forme di resistenza parziale dovute a difetti genetici in eterozigosi, ma permette di diagnosticare solo le forme severe e conclamate di GHI. La sensibilità del test è, infatti, del 77%, mentre la specificità è del 97% [59]. In un recente studio [58] è stato dimostrato che circa l’80% di bambini con ISS ha avuto un aumento dell’IGF-I > 15 ng/ml. Questo conferma la scarsa sensibilità del test.
A causa della mancanza di normative circa il protocollo ottimale, l’interpretazione diagnostica e la standardizzazione del test sono necessari ulteriori studi in questo settore [60].
42
Dopo la valutazione clinica ed endocrinologica del paziente, il pediatra deve procedere all’analisi molecolare per indagare i possibili difetti genetici alla base della Sindrome da insensibilità al GH [62]. Le informazioni raccolte durante l’iter diagnostico sono necessarie per decidere quale gene deve essere analizzato [63].
Nella Figura 2 è riportato l’algoritmo diagnostico del bambino con possibili difetti genetici a livello dell’asse GH – IGF-I.
Figura 2. Algoritmo diagnostico per indagare i difetti genetici dell’asse GH – IGF-I (David et al., 2011)
43
1.3.4 Analisi genetica
Frequentemente la causa della bassa statura è da attribuire a polimorfismi e alterazioni in numerosi geni, ma con le moderne tecniche è possibile indagare solo i difetti monogenici. I geni che possono causare la Sindrome da insensibilità all’ormone della crescita sono quelli che codificano per proteine coinvolte nel legame del GH al suo recettore, nella trasduzione del segnale, nella sintesi o nel trasporto dell’IGF-I [21, 64].
Nonostante il numero di pazienti con ognuna delle mutazioni fino ad oggi conosciute sia molto ristretto, la conoscenza dell’alterazione genetica è di fondamentale importanza per la gestione clinica del paziente e per la scelta del trattamento [65].
1.3.4.1 Difetti genetici che causano GHI
GHR
Il recettore del GH media gli effetti di questo ormone sulla crescita longitudinale delle ossa e sul metabolismo. E’ presente ubiquitariamente (in oltre 40 diversi tessuti), ma è maggiormente espresso nel fegato [50].
44
Il gene che codifica per il recettore del GH, noto come GHR, si trova sul cromosoma 5p13.1-p12. La struttura del gene è rappresentata in Figura 3.
Figura 3. Gene GHR (Fima Lifshitz, 2007)
La regione 5’-UTR esiste in otto varianti ed è seguita da nove esoni (esoni 2 - 10) [2]:
- esone 2: codifica per i primi cinque aminoacidi del dominio extracellulare del recettore;
- esoni dal 3 al 7: codificano per il restante dominio extracellulare eccetto che per gli ultimi tre aminoacidi;
- esone 8: codifica per gli ultimi tre aminoacidi della regione extracellulare, per 24 aminoacidi del dominio transmembrana e per i primi quattro aminoacidi del dominio intracellulare;
45
- esone 9: codifica per gran parte del dominio intracellulare del recettore;
- esone 10: codifica per parte del dominio intracellulare e per la regione 3’-UTR.
Nella popolazione generale sono stati trovati polimorfismi negli esoni 3, 6 e 10 del GHR. Mentre i polimorfismi negli esoni 6 e 10 sono sostituzioni di singoli nucleotidi, il polimorfismo nell’esone 3 consiste nella delezione o conservazione dell’intero esone. Questo porta all’espressione di due isoforme di GHR: full-lenght GHR (fl-GHR) ed exon 3-deleted GHR (d3- GHR), che rispettivamente contengono e non contengono l’esone 3 [66].
Questo polimorfismo non sembra causare un cambiamento nella funzionalità della proteina codificata. Inoltre la presenza di almeno un allele d3-GHR in omozigosi o in eterozigosi è stata messa in relazione con una migliore risposta a breve termine alla terapia con alte dosi di GH in bambini nati SGA e in quelli diagnosticati come ISS [67].
Dal 1966 ad oggi sono stati identificati in tutto il mondo più di 300 pazienti con Sindrome da insensibilità al GH causata da difetti genetici del gene GHR. La maggior parte di questi casi è rappresentata da difetti autosomici recessivi e da mutazioni presenti sia in omozigosi che in eterozigosi composita.
46
E’ stato stimato che circa il 5% dei pazienti con ISS ha mutazioni del gene GHR [46]. Fino ad oggi sono state identificate più di 70 mutazioni di questo gene, che includono delezioni, mutazioni puntiformi, missenso, non- senso e splicing alternativo (circa il 20% di tutte le alterazioni) [7].
La correlazione fenotipo – genotipo è molto varia: pazienti con lo stesso fenotipo possono avere diversi difetti genetici, così come pazienti con la stessa mutazione possono avere diverse espressioni cliniche. La variabilità nel fenotipo può essere spiegata dalla presenza di vari polimorfismi, dalla presentazione delle mutazioni in omozigosi o in eterozigosi composita e dal coinvolgimento di altre componenti, come i fattori ambientali [68].
Le varie alterazioni genetiche possono determinare diversi effetti, tra cui mancata espressione o attivazione del recettore e mancato segnale di inizio trasduzione (difetti nella dimerizzazione del recettore).
Tra le mutazioni che determinano una mancata espressione del recettore del GH la prima ad essere descritta fu una mutazione puntiforme all’interno di un introne (c.618 + 792A>G). Questa alterazione conduce all’attivazione di uno pseudoesone (denominato 6Ψ), con successiva inserzione di 108 nucleotidi tra l’esone 6 e l’esone 7 nei trascritti di mRNA. La traduzione di questi trascritti mutati porta all’inclusione di 36 nuovi aminoacidi nella porzione extracellulare del recettore coinvolta nella dimerizzazione. Grazie a studi funzionali è stato dimostrato che il recettore così allungato resta intrappolato intorno al nucleo e non viene espresso sulla superficie
47
cellulare [67]. Questo difetto genetico è associato ad un largo spettro di fenotipi ed è possibile che una parte dei casi diagnosticati come ISS sia riconducibile a questa mutazione. L’esatta comprensione del meccanismo che porta alla costituzione del recettore mutato ha permesso di proporre lo studio di una nuova strategia terapeutica per correggere questo difetto genetico. Questa mutazione è, infatti, la candidata per lo studio degli exon- skipping ASO (AntiSense Oligonucleotides), molecole di sintesi che correggono lo splicing dell’mRNA, evitando la traduzione dello pseudoesone 6Ψ e ripristinando così la funzionalità del recettore [69].
In due pazienti con bassa statura ed elevate GHBPs è stata identificata una nuova mutazione: la sostituzione di un nucleotide in posizione c.785-3 nel sito accettore dell’introne 7, con conseguente frameshift che interferisce con il normale splicing dell’esone 8. Questa mutazione porta alla formazione di un recettore alterato, che conserva la regione di legame al GH, ma non riesce ad ancorarsi alla membrana cellulare per l’alterazione della regione transmembrana [70, 71].
Tra le mutazioni che determinano una mancata attivazione del recettore è stata descritta una mutazione missenso (c.508G>C) che porta alla sostituzione di un Aspartato con Istidina. Questa mutazione provoca la formazione di un recettore che non è in grado di effettuare la mutazione conformazionale necessaria per l’attivazione [67].
48
Tra le mutazioni che determinano un mancato segnale di inizio trasduzione sono state descritte due delezioni al sito accettore dell’esone 3, risultanti in un frameshift e nella formazione di un codone di stop. Il recettore così codificato è troncato rispettivamente dopo l’aminoacido 449 e 581. Questo recettore si accumula nella membrana cellulare ed è privo di ogni funzione [67].
Sono state descritte anche numerose mutazioni con effetto dominante negativo se presenti in eterozigosi. Queste mutazioni di splicing (c.876 – 1G>C e c.945 + 1G>A) portano alla formazione di un recettore anomalo nel dominio intracellulare [7]. L’effetto dominante negativo è spiegato da vari studi: il recettore mutato, avendo perso la porzione intracellulare necessaria per la sua internalizzazione, si accumula sulla membrana cellulare e forma eterodimeri con i recettori normali, alterandone la funzione [72].
Altre mutazioni identificate in eterozigosi composita sono state descritte in numerosi studi:
duplicazione di un nucleotide nell’esone 9 (c.899dupC) che causa frameshift e la formazione di un codone di stop prematuro nella porzione che codifica per il dominio intracellulare del recettore. Questa mutazione implica, così, la perdita del Box 1 del recettore, una regione fondamentale della porzione intracellulare [73]. L’identificazione di
49
questa alterazione in eterozigosi composita in soggetti con un fenotipo attenuato di GHI suggerisce un possibile effetto dominante negativo della mutazione e la presenza di una porzione di recettori ancora funzionanti
sostituzione di un singolo nucleotide nell’esone 5 (c.335G>C) o
nell’esone 6 (c.504T>G) che determina una mutazione missenso con successiva alterazione del recettore [74]
sostituzione di un nucleotide (c.703C>T) che causa la formazione di un
codone di stop prematuro nell’esone 7 (codifica per il dominio extracellulare del recettore). L’RNA messaggero che si forma viene degradato da un sistema di sorveglianza specifico [68].
Una nuova mutazione in omozigosi è stata individuata in un paziente con GHI: si tratta della sostituzione dell’ultimo nucleotide dell’esone 7 (c.784G>C) con frameshift, che provoca una precoce terminazione della proteina e la perdita della sua funzione. Questa mutazione dimostra l’importanza dei nucleotidi esonici che si trovano nelle zone adiacenti agli introni per un corretto processo di splicing [75].
Recentemente è stato notato che le mutazioni con effetto dominante negativo non coinvolgono mai il dominio extracellulare del recettore, ma solo quello intracellulare. Questo può essere spiegato grazie al legame asimmetrico del GH alla regione extracellulare dell’omodimero
50
recettoriale. Infatti, ogni recettore, prima della dimerizzazione, contiene tutti i siti necessari per il legame con il GH e per l’attivazione della trasduzione del segnale. Quando si forma un dimero che contiene un recettore alterato nel dominio extracellulare, sono ancora presenti siti di legame sufficienti per attivare la trasduzione [72].
STAT5B
Le mutazioni a livello del gene che codifica per la proteina STAT5b, noto come STAT5B, determinano un fenotipo specifico caratterizzato da GHI e immunodeficienza. Questi difetti sono molto rari; tuttavia la loro identificazione in pazienti con bassa statura e deficit di IGF-I, dimostra che STAT5b è essenziale per la produzione di IGF-I in risposta all’ormone della crescita [76]. Infatti la produzione di IGF-I e IGFBP-3 stimolata dal GH è mediata per la maggior parte dalla via di trasduzione JAK-STAT, con un minimo coinvolgimento delle altre vie, come ad esempio MAPK/ERK o PI3K.
Tutte le mutazioni di STAT5B determinano un deficit della proteina STAT5b con conseguente blocco della trasduzione del segnale dopo il legame del GH al suo recettore [77]. Questo provoca una riduzione dei livelli di IGF-I, IGFBP-3 e ALS.
51
Inoltre in numerosi pazienti sono state riscontrate anche disfunzioni immunitarie che si manifestano con frequenti infezioni polmonari, episodi di polmonite interstiziale linfoide, diarrea cronica, cheratite erpetica e severo eczema. Le alterazioni immunitarie sono da attribuire al deficit di STAT5b, che causa riduzione dell’espressione di cellule T CD25+ indotta dall’IL-2 [7]. Numerosi studi hanno, infatti, confermato che STAT5b è coinvolto nel sistema immunitario e che una sua alterazione può creare numerosi difetti nell’azione di varie interleuchine (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21), dell’eritropoietina e della prolattina, causando forme di immunodeficienza primaria [78].
Il gene che codifica per STAT5b è formato da 18 esoni (2 – 19).
Nel 2003 Kofoed et al. identificò la prima mutazione missenso di STAT5B (p.A630P) a livello dell’esone 15. Questa mutazione in omozigosi provoca la sostituzione di un aminoacido, con conseguente perdita della stabilità termodinamica e della solubilità, alterato ripiegamento e aggregazione della proteina mutata, con formazione di corpi di inclusione citoplasmatica. La proteina aberrante STAT5b non può così essere reclutata per la trasduzione del segnale indotta dal legame del GH al suo recettore. E’ stato dimostrato che questa mutazione si trova all’interno del dominio SH2, una regione fondamentale in ogni proteina citoplasmatica coinvolta nella trasduzione del segnale. Questa regione, infatti, ancora STAT5b ai residui tirosinici fosforilati del recettore del GH e ne premette la fosforilazione da parte di
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JAK2. Inoltre il dominio SH2 è necessario per la dimerizzazione di STAT5b e la conseguente traslocazione nel nucleo, dove può agire come fattore che regola la trascrizione. Le mutazioni in questa regione sono associate a vari stati di immunodeficienza [50].
Dal 2003 sono state identificate altre sei mutazioni: una mutazione missenso (p.F646S) nell’esone 16; una mutazione nonsenso (p.R152X) nell’esone 5; due inserzioni di singolo nucleotide (c.1103insC e c.1191insG) rispettivamente nell’esone 9 e 10; due delezioni di un nucleotide (c.424_427del e c.1680delG) rispettivamente nell’esone 5 e 13 [7].
La mutazione missenso p.F646S è stata descritta in un paziente con deficit di IGF-I e numerose disfunzioni immunitarie (eczema cutaneo e tiroidite autoimmune). E’ localizzata all’interno del dominio SH2 e determina un arresto della trascrizione [79].
La mutazione nonsenso nell’esone 5 (p.R152X) è dovuta alla sostituzione di un singolo nucleotide, che provoca la formazione di un codone di stop con conseguente traduzione di una proteina severamente troncata che conserva solo l’estremità N-terminale. La proteina così mutata è priva di ogni attività biologica e non è immuno-rilevabile a causa della sua rapida degradazione [80].
L’inserzione di un singolo nucleotide nell’esone 10 del gene STAT5B (c.1191insG) porta alla sostituzione di un singolo aminoacido con
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generazione di frameshift e conseguente formazione di un codone di stop a valle della mutazione. La proteina così tradotta è priva del dominio C- terminale contenente la regione SH2 ed è completamente priva di attività e precocemente degradata [81].
Le inserzioni e le delezioni di nucleotidi determinano frameshift con conseguente traduzione di una proteina troncata e non funzionante.
In generale, tutte le mutazioni di STAT5B finora individuate sono presenti in omozigosi e vengono trasmesse in modo autosomico recessivo.
In uno studio recente è stato descritto un nuovo difetto genetico in un paziente con bassa statura, resistenza al GH e immunodeficienza. Questo paziente è un mosaico per una duplicazione de novo del cromosoma 17q21- 25. Studi funzionali hanno dimostrato che la via di trasduzione mediata dal CD28 è alterata e che è soppressa l’attivazione di NF-kB, di PI3K e di STAT5b in risposta al GH. Quindi questa duplicazione determina un’alterazione di gran parte delle proteine coinvolte nella trasduzione del segnale del recettore del GH, tra cui STAT5b [82].
SHP-2 (codificato da PTPN11)
La Sindrome di Noonan è una sindrome a trasmissione autosomica dominante che nel 70% dei casi è causata da mutazioni in eterozigosi di
