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Titolo:
DETERMINAZIONE DELLA PUREZZA CHIMICA E RADIOCHIMICA DI SOLUZIONI INIETTABILI DI FLUODESOSSIGLUCOSIO (18F) CURIUM
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Elaborato da: CQ
Verificato da: CQ
Approvato da: QP
Approvato da: AQ
Storia del documento Codice
documento Azione Entrata in vigore Scadenza* Modifica
AM-002-02 Revisione 25.02.2013 25.02.2016 Aggiornamento dei tempi di ritenzione degli analiti. Preparazione fase mobile:
possibile utilizzo dell’eluente commerciale AM-002-03 Revisione 02.12.2013 02.12.2016 Aggiornamento volume iniezione
AM-002-04 Revisione 03.09.2018 03.09.2020 Adeguamento Dossier IBA
AM-002-05 Revisione Preparazione giornaliera della soluzione
eluente di NaOH.
* tre anni dall’entrata in vigore
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1. OBIETTIVO
Determinazione della purezza chimica del prodotto finito:
Determinazione del 2-fluoro-2-desossi-D-glucosio (FDG) e 2-cloro-2-desossi-D-glucosio (ClDG) presenti in soluzioni iniettabili di prodotto finito tramite cromatografia liquida HPLC con rivelatore elettrochimico (Amperometrico Pulsato, PAD).
Determinazione della purezza radiochimica del prodotto finito:
Determinazione del 2-[18F]fluoro-2-desossi-D-glucosio ([18F]FDG), 2-[18F]fluoro-2- desossi-D-mannosio ([18F]FDM) in soluzioni iniettabili di prodotto finito tramite cromatografia liquida HPLC con rivelatore radiochimico.
2. ANALITI
Rivelatore elettrochimico: 2-fluoro-2-desossi-D-glucosio, FDG 2-cloro-2-desossi-D-glucosio, ClDG
Rivelatore radiochimico: 2-[18F]fluoro-2-desossi-D-glucosio, [18F]FDG 2-[18F]fluoro-2-desossi-D-mannosio, [18F]FDM
3. STRUMENTO/APPARECCHIO
HPLC con rivelatore elettrochimico e radiochimico posti in serie (codice strumento SCQ- 020).
4. PROCEDURA
4.1. Preparazione dello strumento e condizioni operative
Per la preparazione dello strumento all'esecuzione dell'analisi osservare quanto descritto nella procedura “Uso, controllo e manutenzione del RADIO-HPLC” QCU-008)
Colonna: - Pre-colonna Dionex CarboPac PA10 Guard od equivalente - CarboPac PA10 (Dionex)od equivalente, l = 25 cm, ID= 4 mm, diametro particelle 10 µm, fase stazionaria resina a scambio anionico forte.
Fase mobile: NaOH 0.1 M Flusso eluente: 1ml/min Volume di iniezione: 20 µl Durata della corsa: 20 minuti
Temperatura colonna: 20-35°C (tipica 25°C)
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4.2. Campione da analizzare
L'analisi è eseguita direttamente sul prodotto finito.
4.3. Esecuzione dell'analisi
Riepilogo dei materiali da usare nell'analisi:
• Soluzione di NaOH O,1 N (vedi § 4.3.1)
• Pipette automatiche e/o microsiringhe
• Cilindri graduati, Classe A
• Matracci tarati, Classe A
• Bottiglia per eluenti da 1000 o 2000 ml munita di tappo a vite
• Elio 4.3.1. Fase mobile
Utilizzare una soluzione commerciale di NaOH 0.1 N per cromatografia avendo cura di conservare la soluzione in una bottiglia per eluenti con tappo a vite. Degassare la fase eluente mediante gorgogliamento di elio prima dell’impiego e mantenere la stessa sotto battente di elio per evitarne la carbonatazione dalla CO2 atmosferica.
In alternativa all'utilizzo del prodotto commerciale preparare la soluzione NaOH 0,1 N (NaOH 4 g/l) come segue:
Sonicare l'acqua in una bottiglia da 2000 ml utilizzando un bagno ad ultrasuoni e degassarla mediante gorgogliamento di elio per un tempo non inferiore a 20 minuti in modo da garantire la rimozione della CO2 disciolta prima della aggiunta di NaOH 50-52% w/w). Prelevare 10.4 ml di NaOH 50-52% (w/w) e portare a 2000 ml con acqua ultrapura. Trasferire la soluzione in una bottiglia con atmosfera inerte sotto battente di He. La soluzione eluente viene preparata giornalmente.
Identificare le soluzioni eluenti con il numero di lotto in base alla SOP QCU-031 e registrare le eventuali operazioni di preparazione nel Quaderno di laboratorio (SOP QCU-032).
4.3.2. Soluzioni standard
Preparazione delle soluzioni standard:
• Soluzione di riferimento di 2-fluoro-2-desossi-D-glucosio: Soluzione (a), FDG
Pesare 1,0 mg di FDG in un matraccio da 2 ml. Sciogliere e portare a volume con acqua ultrapura mQ o acqua ultrapura per HPLC: soluzione FDG 0,5 mg/ml (Soluzione madre, FDG_SM). Prelevare 1 ml e porli in un matraccio da 10 ml, portando a volume con acqua ultrapura mQ o acqua ultrapura per HPLC: diluizione 1:10 (Soluzione secondaria FDG-SS).
Concentrazione della soluzione (a): FDG = 0.050 mg/ml
• Soluzione di riferimento di 2-cloro-2-desossi-D-glucosio: Soluzione (b), CDG.
Pesare 1,0 mg di CDG e porli in un matraccio da 2 ml. Sciogliere e portare a volume con acqua ultrapura mQ o acqua ultrapura per HPLC: soluzione 0,5 mg/ml (Soluzione madre, CDG-SM). Prelevare 1 ml e porli in un matraccio da 10 ml, portando a volume
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CDG-SS).
Concentrazione della soluzione (b): ClDG = 0,050 mg/ml
• Soluzione di riferimento di 2-fluoro-2-desossi-D-mannosio e 2-fluoro-2-desossi-D- glucosio: Soluzione (c), FDG+FDM
Pesare 1,0 mg di FDM e porli in un matraccio da 20 ml. Sciogliere e portare a volume con acqua ultrapura mQ o acqua ultrapura per HPLC: soluzione FDM 0,05 mg/ml (Soluzione madre FDM-SM). Prelevare volumi uguali dalla soluzione FDM 0,05 mg/ml e dalla soluzione di riferimento (a) e miscelarli in un contenitore idoneo per ottenere una miscela con lo stesso contenuto di FDG e FDM in mg/ml (Miscela1-002).
Concentrazione della Soluzione (c): FDG 0,025 mg/ml + FDM 0,025 mg/ml Conservare le soluzioni di riferimento in idonei contenitori chiusi (ad esempio vials o matracci).
Identificare le soluzioni con il numero di lotto in base alla SOP QCU-003 e registrare le operazioni di preparazione nel Quaderno di laboratorio (SOP QCU-032).
4.3.3. System suitability
Per ogni giornata di attività, prima di procedere all’analisi del primo lotto di radiofarmaco [18F] fluorodesossiglucosio ([18F]FDG), è necessario effettuare un system suitability mediante l’iniezione delle seguenti soluzioni standard (vedi § 4.3.2) nell'ordine indicato di seguito:
- reference solution (c), FDG 0,025 mg/ml+FDM 0,025 mg/ml.
- reference solution (a), FDG 0,050 mg/ml - reference solution (b), CDG 0,050 mg/ml.
Vedi § 4.5 per l'interpretazione dei risultati.
4.3.4. Preparazione del campione
Prelevare almeno 30 µl di soluzione iniettabile di prodotto finito [18F]FDG mediante una microsiringa graduata da 50 µl o una pipetta automatica.
Trasferire il campione prelevato in un flaconcino da autocampionatore.
Posizionare il flaconcino nella sede di campionamento dell'autocampionatore.
4.4. Analisi del campione e degli standard
Effettuare una corsa cromatografica non inferiore a 20 minuti.
La sequenza di iniezione delle soluzioni di riferimento è:
1 - Bianco (= acqua ultrapura) 2 - Soluzione di riferimento (c) 3 - Soluzione di riferimento (b) 4 - Soluzione di riferimento (a) 5 - Bianco
6 - Soluzione campione.
7 - Bianco
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4.5. Interpretazione dei risultati
Determinazione dei tempi di ritenzione (detector elettrochimico):
• Osservare il tempo di ritenzione di FDG (RTFDG) nel cromatogramma ottenuto con il detector elettrochimico e la soluzione di riferimento (a);
• Osservare il tempo di ritenzione di FDM (RTFDM) nel cromatogramma ottenuto con la soluzione di riferimento (c);
• Osservare il tempo di ritenzione del CDG (RTCDG) nel cromatogramma ottenuto con la soluzione di riferimento (b).
• tempo di ritenzione relativo (RRT) calcolare applicando la formula:
RRTFDM = (RTFDM -DT)/( RTFDG -DT) RRTClDG = (RTCDG -DT)/( RTFDG -DT) DT = dwell time
• Risoluzione FDG/FDM: calcolare applicando la formula : r =1.18*(RTFDG - RTFDM)/(FWHMFDG + FWHMFDM) Risultati attesi:
• Il tempo di ritenzione relativo di FDM rispetto a FDG è circa 0,9 (intervallo ± 5%);
• Il tempo di ritenzione relativo di CDG rispetto a FDG e circa 1,1 (intervallo ± 5%);.
• Il fattore di risoluzione tra i picchi di FDM e di FDG deve essere ≥ di 1,5 nel cromatogramma relativo all’analisi della soluzione di riferimento (c) (verifica del system suitability);
• Il rapporto tra il segnale del picco di FDG e il rumore di fondo (signal to noise, S/N) deve essere S/N ≥ di 10 nel cromatogramma relativo all’analisi della soluzione di riferimento (c) (verifica del system suitability).
Identificazione dei picchi radioattivi (detector radiochimico):
• Localizzare i picchi di [18F] FDG e di [18F] FDM (se rilevato) nel cromatogramma ottenuto con il detector radiochimico relativo all’analisi del campione di [18F]FDG, in base ai tempi di ritenzione dei cromatogrammi ottenuti con la soluzione di riferimento (a) e la soluzione di riferimento (c);
• Verificare che il tempo di ritenzione di [18F] FDG e di [18F] FDM (se rilevato) siano simili ai tempi di ritenzione rispettivamente di FDG nel cromatogramma ottenuto con l’analisi della soluzione di riferimento (a) e di FDM nel cromatogramma ottenuto con l’analisi della soluzione di riferimento (c). Tenere presente che il tempo di ritardo dovuto al tratto di linea che unisce il rivelatore elettrochimico e il rivelatore radiochimico (posto in serie a valle del precedente) è di
• Fissato il tempo di ritenzione del [18F] FDG nel cromatogramma relativo all’analisi del campione di [18F] fluorodesossiglucosio ([18F]FDG), il tempo di ritenzione relativo di [18F] FDM (se rilevato) nel cromatogramma relativo all’analisi del campione di [18F] fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) deve essere di circa 0,9.
Limiti:
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cromatografico del detector elettrochimico rilevati con l’iniezione del campione di prodotto finito:
• l’area del picco imputabile a FDG non deve essere maggiore dell’area del picco principale nel cromatogramma ottenuto con l'iniezione della soluzione di riferimento (a) (0,050 mg/ml);
• l’area del picco imputabile a CDG non deve essere maggiore dell’area del picco principale nel cromatogramma ottenuto con l'iniezione della soluzione di riferimento (b) (0,050 mg/ml).
Ricavare le aree dei picchi identificati come FDG e FDM (se presente) nel tracciato cromatografico del detector radiochimico rilevati con l’iniezione del campione di prodotto finito:
• la somma delle aree di [18F] FDM e [18F] FDG non deve essere inferiore al 95% della area totale presente nel cromatogramma e dovuta al 18F- (R1, vedi § 4.6)
• l'area del picco dovuto a [18F] FDM non deve essere superiore al 10% della dell'area dovuta alla somma delle aree di [18F] FDM+[18F] FDG (R2, vedi § 4.6).
4.6. Calcoli
Detector radiochimico
Area[18F]FDG: area del picco imputabile a [18F]FDG Area[18F]FDM: area del picco imputabile a [18F]FDM Purezza radiochimica:
R1 = 100 x (Area[18F]FDG +Area[18F]FDM) / Area Totale R2 = 100 x (Area[18F]FDM / (Area[18F]FDG +Area[18F]FDM) dove:
Area Totale = somma delle aree di tutti i picchi presenti nel cromatogramma relativo al detector radiochimico.
4.7. Conservazione del campione da analizzare
Il campione da analizzare viene generalmente utilizzato subito dopo la preparazione.
Qualora l’utilizzo venga posticipato, esso deve essere conservato in apposito contenitore schermato collocato nel laboratorio di analisi Controllo Qualità, fino al momento dell’analisi.
Il campione è lasciato decadere, in una zona schermata, per un tempo corrispondente ad almeno 5 emivite del radionuclide fluro-18 (T1/2 = 109.7 min ) e successivamente eliminato.
4.8. Riferimenti
Soluzione iniettabile di [18F]fluorodesossiglucosio: Dossier registrativo IBA.
