LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Vytautas Stankus
Lašišų (Salmo salar L.) ir šlakių (Salmo trutta trutta L.) kolumnariozės
tyrimai
Study of Columnaris Disease in Salmon (Salmo salar L.) and Trout
(Salmo trutta trutta L.)
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: prof. dr. Artūras Stimbirys
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Lašišų (Salmo salar L.) ir šlakių (Salmo trutta trutta L.) kolumnariozės tyrimai“.
1. Yra atliktas mano paties;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas,
pavardė)
(parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
3 Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas)
4 TURINYS SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 8 ĮVADAS ... 10 1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12 1.1 Taksonomija ... 12 1.2 Epidemiologija ... 12 1.3 Klinikiniai simptomai ... 15 1.4 Diagnostika ... 16 1.5. Kontrolė ... 21
2. TYRIMO OBJEKTAS, MEDŢIAGA IR METODAI ... 24
3. TYRIMO REZULTATAI IR APTARIMAS ... 27
3.1. Šlakių jauniklių, augusių skirtingomis sąlygomis: veislyne išnerštų ir iki rudens augintų (veislyno) (1 grupė), į upes pavasarį išleistų ir rudenį sugautų (išleistiniai) (2grupė), bei natūralaus neršto (laukiniai) (3 grupė), biologiniai rodikliai ... 27
3.2. Lašišų jauniklių, augusių besiskiriančiomis sąlygomis: veislyne iki rudens augintų (veislyno) (1 grupė), į upes pavasarį išleistų ir rudenį sugautų (išleistiniai) (2 grupė), bei natūralaus neršto (laukiniai) (3 grupė), biologiniai rodikliai ... 35
4. IŠVADOS ... 46
5. PASIŪLYMAI ... 47
6. PADĖKOS ... 48
5 SANTRUMPOS
0+ - vienerių metų neturintys ţuvų jaunikliai. 0 – jaunesni nei 6 mėnesių ţuvų jaunikliai (mailius) 1 – vyresni nei vienerių metų ţuvų jaunikliai
C. columnaris – Cytophaga columnaris (s. F. columnare). F. columnare – Flavobacterium columnare.
PGR – polimerazės grandininė reakcija (angl. Polymerase chain reaction (PCR)).
KFIP – karpytų fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. Restriction fragment length polymorphism). DNR-ISH – dezoksiribonukleininės rūgšties in situ hibridizacija.
Er – eritrocitai Hb – hemoglobinas Hct - hematokrito lygis Leu - leukocitų kiekis
VET - vidutinis eritrocitų tūris
VhbKE - vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite CA – Cytophaga agaras
KSV – kolonijas sudarantys vienetai AOA – Anacker Ordal agaras KMnO4 – kalio permanganatas
6 Lašišų (Salmo salar L.) ir šlakių (Salmo trutta trutta L.) kolumnariozės tyrimai
SANTRAUKA
Magistro baigiamasis darbas parašytas lietuvių kalba. Darbo apimtis – 56 puslapiai. Struktūra: santrauka, summary, įvadas, literatūros apţvalga, tyrimo objektas, medţiaga ir metodai, išvados, literatūros sąrašas. Rengiant darbą panaudoti 89 literatūros šaltiniai, 18 lentelių ir 13 paveikslėlių.
Flavobacterium columnare yra gerai ţinomas patogenas sukeliantis kolumnariozę, ir kurio sukeliama liga paliečia gėlavandenes ţuvis: tiek akvariumines, tiek ţuvivaisos įmonėse, tiek gyvenančias natūraliose gamtinėse sąlygose. Bakteriją pirmą kartą 1922 metais aprašė Herber Spencer Davis, ir jai suteikė pavadinimą, kuris vėliau kelis kartus keitėsi (Bacillus columnaris, Cytophaga columnaris, Chondrococcus columnaris, Flexibacter columnaris) kol buvo pripaţintas Flavobacterium columnare pavadinimas, kuris dabar naudojamas. Jungtinėse Amerikos Valstijose ši bakterija atneša labai didţiulius nuostolius. Registruotais duomenimis 2003 m. kolumnaris liga nusinešė daugiau nei 30 milijonų JAV dolerių vien tik iš šamų pramonės.
F. columnare daţniausiai pasiţymi tuo, kad sukelia ţiaunų nekrozę, pelekų erozijas ir ţvynų paţeidimus. Išauginta ant Cytophaga agaro kolonija daţniausiai būna rizoidinio tipo, adhezyvi, gelsvos spalvos (dėl pigmento fleksirubinino). Raudonųjų Kongo daţų absorbcija – vienas labiausiai patikimiausių biocheminių testų. Taip pat egzistuoja ir kiti diagnozavimo metodai – serologiniai, molekuliniai.
Šios ligos prevencijai reikia reguliariai naudoti kalio permanganatą, vario sulfatą ar kitą dezinfekcinę medţiagą, kuri naikina F. columnare bakterijas. Jei tenka gydyti – visai neseniai pasirodė tyrimai, kuriuose buvo aprašytas fagų panaudojimas. Jie pasiţymi kolonijų augimą stabdančiu ar bakterijas naikinančiu poveikiu, tačiau dar reikia atlikti daugybę tyrimų norint nustatyti, ar šis gydymo metodas gali būti naudojamas.
Darbo tikslas – įvertinti lašišų ir šlakių jauniklių morfofiziologinę ir mikrobiologinę, Flavobacterium columnare atţvilgiu, būklę skirtingomis augimo sąlygomis (Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyne ir natūraliai gamtoje).
Atliekant darbo uţdavinius buvo įvertinti šie rodikliai: morfologiniai (Q, L), morfofiziologiniai (Q/L, įmitimo koeficientas, vidutinis svoris ir vidutinis ilgis), ţiauninių dangtelių ir pelekų būklė, mikrobiologiniai F. columnare tyrimai ir ţuvų kraujo tyrimai buvo atlikti norinti palyginti skirtingas augimo sąlygas bei atrasti biomarkerius.
7 Visi prieš tai minėti tyrimai buvo atlikti 2011 – 2012 metais. Bandyme buvo naudojami Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyno dirbtinio neršto (1 grupė), dirbtinio neršto į gamtine sąlygas paleisti ir sugauti (2 grupė) bei laisvėje išneršę (3 grupė) lašišų ir šlakių mailius ir jaunikliai. Tyrimų metu buvo nustatyti ir praktiniam naudojimui pasiūlyti biomarkeriai.
Raktiniai ţodţiai: Flavobacterium columnare, lašišų kolumnariozė, šlakių kolumnariozė, morfofiziologija, biomarkeriai.
8 Study of Columnaris Disease in Salmon (Salmo salar L.) and Trout (Salmo trutta trutta L.)
SUMMARY
This final study is written in Lithuanian, containing 56 pages and includes: an introduction, review of literature, object, materials and methods, results, conclusions. The literature list with 59 resources, 18 tables and 13 pictures are also a part of the study.
Flavobacterium columnare is a well known worldwide pathogen, causative agent of Columnaris disease, elicting significant problems in freshwater fish including aquariums, culture places, natural surroundings. The first time the bacteria was described and named by Herber Spencer Davis. The name has changed for several times till reached the one is used now (Bacillus columnaris, Cytophaga columnaris, Chondrococcus columnaris, Flexibacter columnaris). In the industry of USA catfish this pathogen causes millions of dollars of losses. According to the statistics of the year 2003, the industry lost more than 30 millions of dollars of income.
F. columnare in fish infections may cause skin lesions, fin erosions and gill necrosis, with a high degree of mortality. Cultured on Cytophaga agar grows mostly in rhizoit type very much adhesive collonies coloured in yellow due to pigment flexirubinin. One of the most revieling biochemical tests – absorbance of Congo red dye. Also it can be diagnosed by many serological and molecular assays. Preventive control should be used regularly involving potassium permanganate, copper sulphate or other desinfecant, which is available for F. columnare on the market. The latest treatment described for columnariosis is based upon phages which prevent the growth of F. columnare or kill it, but there are many studies to be done before making any conlusions.
The aim of the research – to evaluate morfophysiological status and infestation with Flavobacterium columnare in Baltic salmon (Salmo salar) and trout (Salmo trutta trutta) fingerlings in different surroundings (Zeimenos culturing place and natural surroundings). Some parameters: morfological (Q, L), morfophysiological (Q/L, nutritional status coefficient, mean of Q and L), status of fins and operculum, bacteriological culturing of F. columnare, bloodworks were done to compare surroundings, find biomarkers.
All the above mentioned examinations were done in 2011 and 2012 for groups of Baltic salmon and trout fingerlings from natural surroundings and Zeimenos culturing place. The
9 biomarkers were suggested to use which would easily and fast show when the outbreak of columnariosis could be expected, when the treatment should be started.
Keywords: Flavobacterium columnare, columnariosis in salmon, columnariosis in trout, morphophysiology, biomarkers.
10 ĮVADAS
Kolumnariozė – tai viena seniausiai ţinomų šiltavandenių gėlavandenių ţuvų ligų, kurią pirmasis 1922-aisiais metais aprašė Herber Spencer Davis (Durborrow et al., 1998). Be to tai viena labiausiai pasaulyje paplitusių ţuvų ligų (Farkas, Olah, 1986; Rintamaki-Kinnunen et al., 1997; Decostere et al., 1998; 1999; Altinok, Grizzle, 2001; Tiirola et al., 2002; Virbickas et al., 2002; Bader et al., 2003; Shoemaker et al., 2003; Thomas-Jinu, Goodwin, 2004; Skrodenytė-Arbačiauskienė, 2005; Figueiredo et al., 2005; Guan et al., 2013) ne vien pramoninių, bet ir akvariuminių ţuvų tarpe (Decostere et al., 1999).
Jungtinėse Amerikos Valstijose kasmet dėl kolumnaris ligos prarandami milijonai. Tai ypač liečia šamų (Ictalarus punctatus) veisėjus ir tampa didţiule tarptautine problema (Wagner et al., 2002; Olivare-Fuster et al., 2007).
Kolumnariozės sukėlėjas anksčiau buvo vadintas kitais pavadinimais: Bacillus columnaris (Davis, 1922), Chondrococcus columnaris (Ordal, Rucker, 1944), Flexibacter columnaris (Bernardet, Grimont, 1989). Galiausiai 1996-aisiais išėjusiame tarptautiniame sisteminės bakteriologijos ţurnale (angl. International Journal of Systematic Bacteriology) gentis buvo oficialiai pervadinta į Flavobacterium (Bernardet et al., 2006) ir iki šiol sukėlėjo pavadinimas liko toks pat – Flavobacterium columnare (F. columnare).
1999-aisiais, F. columnare klasteris atsiţvelgiant į 16S rRNR sekas, karpytų fragmentų ilgio polimorfizmą (KFIP) ir DNR-DNR hibridizaciją buvo padalintas į 3 genomovarus (Triyanto, Wakabayashi, 1999).
Flavobacterium columnare yra ilgos (ilgis plotį viršija iki 20 kartų), judrios, lanksčios, plonos Gram – neigiamos lazdelės. Petri lėkštelėje išaugusios bakterijų kolonijos yra plokščios, gelsvos kiaušinio trynio spalvos, dėl turimo pigmento fleksirubinino. Augdamos kolonijos formuojasi pagal rizoidinį modelį, auga ant maţo praturtinimo terpių stipriai priglusdamos, įsikabindamos (Staroscik, Nelson, 2008).
Lietuvoje Flavobacterium columnare pirmą kartą ţuvims buvo uţfiksuotos 2000 m. Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyne (Virbickas et al., 2002). Infekcija pasireiškia odos, raumenų ir ţiaunų audinių destrukcija (Skrodenytė-Arbačiauskienė et al., 2006). Daţniausiai sukėlėjas sukelia matomas opas, kurios išsidėsto ant lašišų ir šlakių ţiaunų, plečiasi, vėliau bakterijų išskiriami toksinai sukelia ląstelių ţūtį ir pačių ţiaunų erozijas, kurios pradţioje matomos neryškiai, vėliau įgauna gelsvai rusvą spalvą, invazijos vietos centre atsiveria ţaizda. Labiau paţengusiuose atvejuose opos randamos ant viso kūno, joms būdinga apvali ir ovali formos, balkšva spalva
11 (Dorborow et al., 1998). Ţuvų gaišimas įvyksta dėl uţdusimo ir/arba didelių odos plotų paţeidimų (Skrodenytė-Arbačiauskienė et al., 2006). Daţniausiai susirgimą sukelia aplinkos stresiniai veiksniai: vandens temperatūra, druskingumas, didelis ţuvų tankis tūrio vienete (Wakabayashi, 1991; Altinok, Grizzle, 2001; Matt, 2005; Suomalainen, 2005; Skrodenytė-Arbačiauskienė et al., 2006).
Darbo tikslas: įvertinti lašišų ir šlakių jauniklių morfofiziologinę ir mikrobiologinę, Flavobacterium columnare atţvilgiu, būklę skirtingomis augimo sąlygomis (Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyne ir natūralai gamtoje).
Darbo uţdaviniai:
1. Ištirti ir išanalizuoti dirbtinio neršto, augintų veislyne, ir natūralaus neršto lašišų ir šlakių: 1.1. morfologinius ir morfofiziologinius rodiklius;
1.2. mikrobiologinius rodiklius – uţterštumą Flavobacterium columnare bakterijomis; 1.3. hematologinius rodiklius;
1.4. ţiauninių dangtelių ir pelekų būklę;
2. Atlikti lašišų ir šlakių biologinių rodiklių lyginamąją analizę ir atrinkti biologinius vertinimo kriterijus (bioţymeklius).
12 1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Taksonomija
Flavobacterium columnare pirmasis aprašė Herber Spencer Davis 1922-aisiais metais (Durborrow et al., 1998). Kolumnariozės sukėlėjas anksčiau buvo vadintas kitais pavadinimais: Bacillus columnaris (Davis, 1922), Chondrococcus columnaris (Ordal, Rucker, 1944), Cytophaga columnaris (Garnjobst, 1945), Flexibacter columnaris (Bernardet, Grimont, 1989). Galiausiai 1996-aisiais išėjusiame tarptautiniame sisteminės bakteriologijos ţurnale (angl. International Journal of Systematic Bacteriology) gentis buvo oficialiai pervadinta į Flavobacterium (Bernardet et al., 2006) ir iki šiol sukėlėjo pavadinimas liko toks pat – Flavobacterium columnare (F. columnare). 1999-aisiais, F. columnare klasteris atsiţvelgiant į 16S rRNR sekas, karpytų fragmentų ilgio polimorfizmą (KFIP) ir DNR-DNR hibridizaciją buvo padalintas į 3 genomovarus (Triyanto, Wakabayashi, 1999).
1.2 Epidemiologija
F. columnare bakterija yra paplitusi viso pasaulio gėluose vandenyse, jai neatsparios tiek laisvėje gyvenančios, tiek sukultūrintos ir akvariuminės ţuvys (Shoemaker et al., 2011). Dar 1969 metais Anderson ir Conroy aprašė, kad šia bakterija gali uţsikrėsti 36 ţuvų rūšys, tokios kaip: šamai (Ictalurus punctatus), karpiai (Cyprinus carpio) auksinės ţuvelės (Carassius auratus), unguriai (Anguillarostrata japonica, A. anguilla), tilapijos (Oreochromis spp.), upėtakiai (Oncorhynchus mykiss, Salmo trutta, Salvelinus fontinalis).
Jungtinėse Amerikos Valstijose F. columnare yra antra labiausiai paplitusi bakterija ţuvų veislininkystėje po Edwardsiella ictaluri (Wagner et al., 2002); dėl jos kasmet prarandama apie 30 milijonų Amerikos dolerių (Shoemaker et al., 2011). Ši bakterija gali būti randama gėlavandenių ţuvų veisimo, ikrų auginimo, ţuvų auginimo vietose kaip natūralios mikrofloros dalis (Declercq et al., 2013).
Ţuvys, kurios anksčiau buvo uţkrėstos F. columnare, šį mikroorganizmą savyje išlaiko (pavyzdţiui ant ţiaunų), tačiau jokių klinikinių poţymių galima ir nematyti, ypač ţiemos metu, kai būna prastos sukėlėjo dauginimosi ir ligos plitimo sąlygos. Atėjus šiltesniam metų laikui bakterijos vėl dauginasi ir plinta (Wood, 1979; Kunttu et al., 2009). Japonijos mokslininkai nustatė, kad
13 tokios, vizualiai gyvybingos ir sveikos ţuvys gali išskirti iki 5 x 103 KSV/ml/h bakterijų, pagrinde iš
ţiaunų (Fujihara et al., 1971) Nugaišus ţuviai, iš lavono uţkrato plitimo greitis yra dar didesnis (Kunttu et al., 2009).
Buvo atlikti tyrimai įrodantys, kad F. columnare gali ilgai išgyventi aplinkoje. Fijan nustatė, kad ji gali išgyventi iki 16 dienų +25 ºC temperatūroje šarmingame bei kietame (druskingame) vandenyje. Minkštame vandenyje (10 mg/ml kalcio karbonato) ir rūgštesnės terpės vandenyje bakterijų išgyvenamumas yra prastesnis. Ilgesniam išgyvenimui vandenyje bakterijai būtini kalcio, magnio, kalio ir natrio jonai. (Fijan, 1968; Declercq et al., 2013).
F. columnare gyvenant aplinkoje (vandenyje, o ne ant ţuvies), keičiasi jos virulentiškumas. Tai nustatoma iš išaugusių kolonijų – manoma dėl to, kad išsaugotų daugiau energijos atsargų, ilgiau išgyventų.
Virulentiškumas. Daugeliu atvejų F. columnare išaugusios kolonijos būna rizoidinio tipo, tačiau egzistuoja ir švelniosios. Taip pat Kunttu ir kiti su juo dirbę mokslininkai 2011 m. įrodė, kad bakterijų kolonijų paviršius gali būti ir šiurkštus. Išaugusios rizoidinės kolonijos buvo nustatytos kaip virulentiškos ir vidutiniškai kibios, ne rizoidinės šiurkščiu paviršiumi – ne virulentiškos ir stipriai kibios, ir kolonijos švelniu paviršiumi – ne virulentiškos ir silpnai kibios. (Kunttu et al., 2011). Savo kibumą bakterijų kolonijos praranda jas kelis kartus persėjus į mitybines terpes (Bernardet et al., 2006).
1999 m. Triyanto ir Wakabayashi nustatė genų variacijų skirtumus tarp skirtingų F. columnare variacijų ir sukūrė 16S rDNR genais paremtą karpytų fragmentų ilgio polimorfizmo tyrimą. Naudojantis KFIP buvo nustatyti 3 genomovarai: I, II ir III. 2007 m. Olivares–Fuster ir kiti mokslininkai pakartojo tyrimą ir nustatė, kad yra dar grupių tarp genomovarų, todėl buvo pasiūlyti papildomai naudoti I-B ir II-B genomovarai. Nustačius genotipus buvo pradėta gilintis kuris iš jų yra virulentiškiausias ir ar tai sietina su kildinimo vieta. Shoemaker ir jo mokslininkų komanda 2008 m. nustatė, kad II tipo genomovaro padermės yra virulentiškesnės uţ pirmojo (1 lentelė).
1 lentelė. Genomovarų virulentiškumo palyginimas (Shoemaker et al., 2008)
Padermė Genomovaras Dozė Mirtingumas, %
LSU II 7,0 x 105 100,0 530 II 7,2 x 105 100,0 515 II 7,7 x105 96,2 02-26 II 6,9 x 105 92,3 ARS-1 I 7,3 x 105 46,2 HS I 7,5 x 105 3,9 463 I 7,7 x 105 0,0
14 Panašius tyrimus atliko ir tą pačią išvadą padarė ir Olivares-Fuster 2011-aisiais metais. 2012 m. LaFretz ir kiti pasinaudoję vaivorykštinio upėtakio modeliu (eksperimentiniai tyrimai) ne vien vėl gi įrodė tai ką ir pirmi autoriai buvo aprašę, tačiau taip pat susiejo kolonijų morfologiją su genomovarais (2 lentelė). Jų išaugintos kultūros pavaizduotos pirmame paveiksliuke (LaFrentz et al., 2013).
2 lentelė. Genomovarų virulentiškumo palyginimas susiejant su kolonijų morfologija (LaFrentz et al., 2013)
Padermė Genomovaras Šaltinis
Mirtingumas, % (Rizoidinės kolonijos) Mirtingumas, % (kolonijos švelniais lygiais kraštais) B67 II Rudasis upėtakis (Salmo trutta L.) 100,0 0,0 B245 II Baseino vanduo 100,0 12,5 B185 I Baseino vanduo 50,0 0,0
Os06 I Baltijos lašiša
(Salmo salar L.) 25,0 0,0
1975 m. Holt ir kiti kartu dirbę mokslininkai nustatė, kad ne vien virulentiškumas turi įtakos bakterijos poveikiui į ţuvį. Pasirinkę 3 skirtingas lašišinių ţuvų veisles, mokslininkai ţuvis uţkrėtė ir laikė jas skirtingose temperatūrose. Esant teigiamai 9,4 ºC vandens temperatūrai negaišo nei viena ţuvis, o esant 20,5 ºC – liko tik vienos rūšies 30 % gyvų individų.
Inkubacinis ligos periodas priklauso ne vien nuo bakterijos padermės virulentiškumo, bet ir jau nuo aukščiau pastraipoje minėto temperatūrinio rėţimo. Esant palankioms sąlygoms ir aukšto virulentiškumo bakterijai, ligos klinikiniai simptomai ar ţuvų gaišimas gali būti matomas jau po 12 valandų, o esant maţesnio virulentiškumo bakterijai ir nepalankioms dauginimosi sąlygoms – tai uţtrunka nuo 48 valandų iki kelių savaičių (Warren, 1989; Declercq et al., 2013).
1 pav. LaFrentz ir kiti mokslininkų komandos išaugintų F. columnare kolonijų morfologija (LaFrentz et al., 2013).
15 1.3 Klinikiniai simptomai
Remiantis vieta, kurioje bakterija įsiskverbia, dauginasi ir ţaloja ţuvį, klinikiniai poţymiai vadinami įvairiais pavadinimais – balnu (nugaros srities paţeidimai), ţvynų puviniais (kūno šonų paţeidimai), medvilnės liga (burnos ertmės ir lūpų srities paţeidimai) (Griffin, 1987). Tačiau daţniausiai sutinkamas – ţiaunų paţeidimas (Davis, 1922).
Klinikinių simptomų pasireiškimas priklauso ir nuo ţuvies amţiaus. Jauni individai gali gaišti ir be klinikinių poţymių esant ţaibinei infekcijai (kuri jiems daţniausiai ir pasitaiko), o vyresnieji daţniau serga nuo ūmios iki lėtinės ligos eigos. Taip pat labai daug įtakos turi padermės virulentiškumas: retai sutinkami klinikiniai simptomai iki ţuvies gaišimo uţsikrėtus virulentiška bakterijų paderme (Rucker et al., 1953; Pacha, Ordal, 1967; Foscarinini, 1989).
Esant ūmiai ar poūmiai ligos eigai pagrindinis simptomas – gelsvai nekrotizuoti ţiaunų pakraščiukai. Tokiu atveju ţiaunos labai greitai ir sunkiai paţeidţiamos, ištinka greitas gaišimas dėl uţdūsimo (Decostere, 2002) (2 pav.).
2 pav. F. columnare apimtos ţiaunos (pageltonavimai). Ţuvis - Chana hanamensis (Ha et al., 2011)
Esant lėtinei ligos eigai, praeina ilgesnis laiko tarpas, kol pamatomi ţiaunų paţeidimai. Taip pat vėliau pastebimos ir erozijos, atsiradusios ant likusio kūno paviršiaus. Šie paţeidimai prasideda odos diskoloracija tam tikromis zonomis, kurios daţnai yra apvestos paraudimu. Pastarieji poţymiai daţniausiai atsiranda nugaros srityje, ties nugaros peleku. Vėliau stebima nugarinio peleko puviniai, diskoloruota zona su vėliau būsiančiu paţeidimu leidţiasi ţemyn iš abiejų pusių ir taip sudaro „balno“ vaizdą (3 pav.) (Declerq, 2013).
16 3 pav. F. columnare invazijos sukeltas balno formos
paţeidimas (Declercq, 2013)
Vaivorykštiniams upėtakiams taip pat sutinkamas riebalinio peleko paţeidimas, erozijos susidarymas. Paţeidimas gali slinkti tiek kranialiai, tiek kaudaliai, apimti gilesnius sluoksnius. Erozijos būna padengtos balkšvai gelsvomis gleivėmis (Bernardet, Bowman, 2006).
„Medvilnės liga“ – klinikinis simptomas kai F. columnare paţeidţia burnos ertmę, prasideda burnos puviniai. Ţuvims plaukiant matomi išlindę siūlai. Paţeidimas gali išplisti giliai – iki viršutinio ir apatinio ţandikaulio. Tokiu atveju ţuvys nesimaitina, tampa sulysusios, uţsikrečia kitais mikroorganizmais ir galiausiai gaišta (Ferguson, 2006).
Kaip ir buvo minėta aukščiau kolumnariozė gali sukelti ir gilius paţeidimus – opinį dermatitą, kuris tęsiasi iki hipodermio, pasiekia raumeninį audinį. Per paţeistą odos vietą ir paţeistą osmosinį barjerą audiniuose kaupiasi vanduo sudarydamas aplinkinių audinių edemą. F. columnare bakterijų susitelkimo vietos būna tarp odos kolageno. Jos gerai matomos mikroskopuojant nudaţytus mėginius hemotoksilinu ir eozinu arba Gimzos daţais. Taip pat taikomas ir skenuojantis elektroninis mikroskopas bakterijų invazijai nustatyti (Ferguson, 2006).
1.4 Diagnostika
Fenotipinės ir biocheminės Flavobacterium columnare savybės. Tai ilga (ilgis yra didesnis net iki 20 kartų negu plotis), siaura, plona, neturinti ţiuţelio, Gram – neigiama lazdelė. Dydis – nuo 0,3 iki 0,7 μm pločio ir nuo 3 iki 12 μm ilgio. Jos pasiţymi judrumu ant plokščių paviršių. Judėjimas priklauso nuo to kokioje terpėje kultivuojama. Kolonijos ant Cytophaga agaro (toliau CA) auga neiškiliai, šviesiai geltonos spalvos, rizoidiniu šablonu, stipriai prikimba, lėkštelėje ant standaus paviršiaus plinta įvairiomis kryptimis. Fenotipiniai poţymiai išdėstyti 3 lentelėje. Ant infekuotų audinių bakterijos formuoja stulpelių formos figūras, kurios primena šieno kupetą ar kūgį. F. columnare sudaro kapsulę, o jos storis teigiamai koreliuoja su bakterijos virulentiškumu. Labai virulentiškų padermių sienelės storis siekia 120-130 nm, o maţiau virulentiškųjų – tik apie 80–90 nm (Decostere et al., 1998). Bakterija gamina ekstraląstelinį galaktosamino glikaną, kuris nustatomas iš to, kad uţlašinus ant kolonijos Kongo raudonųjų daţų – šie yra absorbuojami. Anot
17 Bernardet (1989) F. columnare padermės Cytophaga sultinyje su 0,5 % NaCl gali augti net esant rūgščiai terpei (pH–6) esant 22 ºC ir 25 ºC temperatūrai.
3 lentelė. Fenotipinės F. columnare savybės (Kubilay et al., 2008)
Bruoţas Būdingumas
Kolonijos spalva Šviesiai geltona
Kolonijos forma Plokščia, plečiasi, kraštai rizoido formos
Daţymas Gramo būdu Neigiamas
Morfologija Plonos, ilgos lazdelės
Judėjimas Teigiamas (judrios)
Oksidacija - fermentacija Neigiama
Jautrumas O/129 Teigiamas
Bertolini ir kiti (1992) nustatė, kad bakterijos degraduoja ţelatiną, hemoglobiną, elastiną, kazeiną bei fibrinogeną. Šiuos ir kitus biocheminius rodiklius ţiūrėti 4 lentelėje.
4 lentelė. Biocheminės F. columnare savybės (Bertolini et al., 1992)
Bruoţas Būdingumas
Katalazė +
Oksidazė +
Fleksirubininas (pigmentas) +
Nitrato redukcija +
Kongo raudonųjų daţų absorbcija +
Beta-galoksidazė - Arginino dihidrolazė - Lizino dekarbosilazė - Ornitino dekarboksilazė - Ureazės gamyba - Triptofano deaminazė - Indolo reakcija -
Voges Proskauer reakcija -
Sieros vandenilio gamyba +
Kazeino skaidymas +
Krakmolo skaidymas -
Ţelatinos skaidymas +
Citrato utilizacija -
Rūgščių produkcija skaidant gliukozę - Rūgščių produkcija skaidant manitolį - Rūgščių produkcija skaidant inositolį - Rūgščių produkcija skaidant laktozę - Rūgščių produkcija skaidant sorbitolį - Rūgščių produkcija skaidant ramnozę - Rūgščių produkcija skaidant sukrozę - Rūgščių produkcija skaidant melibiozę - Rūgščių produkcija skaidant manozę - Rūgščių produkcija skaidant arabinozę -
18 Rūgščių produkcija skaidant amygdaliną -
Augimas ant Shieh agaro su tobramicinu + Augimas ant CA su polimiksinu B ir neomicinu + Augimas ant triptikazės sojos agaro - Augimas ant Shotts Waltman agaro -
Augimas nesant NaCl +
Augimas su 0,5 % NaCl +
Augimas su 1 % NaCl -
Augimas 4 °C temperatūroje -
Augimas 30 °C temperatūroje +
1992 m. Griffin sukūrė metodą morfologiškai panašioms akvakultūros bakterijoms atskirti. Metodas pavadintas „Grifino tinkleliu“ (angl. „Griffin screen”). Jis susideda iš penkių dalių, pagal kurias ir patvirtinamas/paneigiamas F. columnare buvimas tiriamojoje medţiagoje:
1. augimas esant antimikrobinių medţiagų – neomicino sulfato ir polimiksino B; 2. ant CA agaro kolonijos auga rizoidiniu šablonu ir yra gelsvos spalvos;
3. gamina ţelatiną skaidančius baltymus;
4. bakterijų kolonijos absorbuoja Kongo raudonuosius daţus; 5. gamina chondroitino sulfatą A skaidančius baltymus.
Bakterijų kolonijų auginimas. F. columnare mėginys kolonijoms išauginti imamas iš įvairių paţeistų ţuvų vietų nuo viso kūno, iš švieţiausiai atrodančios ţaizdelės, nuo krašto. Tiriamajai bakterijai auginti reikalinga maţai praturtinta terpė. Kolumnaris ligos sukėlėjas neauga ant triptikazės sojos agaro, maitinamojo ir jūrinio 2216 agaro. Taip pat neauga esant didesnei nei 0,5 % NaCl koncentracijai. (Bernardet et al., 2006). Pirmąjį kartą bakterija buvo uţauginta ant CA agaro. Nuo tada keletas mitybinių terpių F. columnare kultivuoti buvo sukurta: Shieh (Shieth, 1980) ir TYES (Holt, 1988). Optimaliausia augimo temperatūra – +25 ºC, tačiau auga ribose tarp +5 ir +37 ºC (Decostere et al., 1998; Suomalainen et al., 2006; Declerq et al., 2013).
Bakterijos auga tik aerobinėmis sąlygomis, jos nėra halofilinės (Pacha, Porter, 1970). Po inkubacijos praėjus 24-48 valandoms ant terpės paviršiaus pasirodo kolonijos. Ţinant, kad yra bakterijų, kurios gali greičiau išaugti mitybinėje terpėje nei F. columnare, buvo sukurtos specifinės terpės turinčios antimikrobinių medţiagų, kurioms tiriamoji bakterija yra atspari – polimiksino B ir neomicino (Declercq, 2013). Išaugusios mitybinės kolonijos pasiţymi gelsva spalva, dėl gaminamo pigmento fleksirubinino (Bernardet et al., 2006).
2009 m. pasirodţiusiame straipsnyje Dash ir jo mokslininkų komandos aprašytas atliktas kolonijų auginimo tyrimas: eksperimentiniam tyrimui buvo atrinktos tam tikros terpės: CA agaras, maitinamasis agaras, triptono sojos agaras, MacConkey agaras ir selektyviniai Aeromonas
19 kultivavimui agaras, tiosulfato citrato tulţies sukrozės agaras, Pseaudomonas kultivavimui agaras ir Rimler-Shott terpė. Tyrimo pabaigoje nustatyta, kad kolonijos uţaugo ant CA agaro (visose pasėtose Petri lėkštelėse), maitinamojo agaro ir triptono sojos agaro (ant dviejų pastarųjų augimas buvo prastas palyginus su CA agaru). Ant kitų terpių F. columnaris padermių augimas buvo nenustatytas (Dash et al., 2009).
Diskų difuzijos testas. 2008 m. buvo atliktas tyrimas siekiant nustatyti F. columnare padermės jautrumą antimikrobinėms medţiagoms. Kubilay ir jo mokslininkų komanda atlikinėjant tyrimą ir vertinant antibiogramą rėmėsi Nacionalinio klinikinės laboratorijos komiteto pateiktomis (dokumentas M42R, 2001 metų) gairėmis, tyrimui buvo naudotas CA agaras; padermių jautrumui nustatyti buvo išbandyta ATB-VET (Biomerieux 14289) testų sistema. Išaugusios F. columnare kolonijos buvo jautrios šioms antimikrobinėms medţiagoms: oksitetraciklinui (30 μg), chloramfenikoliui (30 μg), eritromicinui (15 μg) ir streptomicinui (10 μg) (5 lentelė).
5 lentelė. F. columnare jautrumas antimikrobinėms medţiagoms. Jautrios – J, atsparios – A.
Antimikrobinė medţiaga Zonos dydis Jautrumas
Chloramfenikolis 30 μg 34 J Oksitetraciklinas (30 μg) 40 J Furazolidonas (100 μg) 36 J Nitrofurantoinas (300 μg) 40 J Eritromicinas (15 μg) 35 J Streptomicinas (10 μg) 16 J Tobramicinas (10 μg) 0 A Oksacilinas (1 μg) 0 A Cotrimoksizolis (25 μg) 15 A Kanamicinas (10 μg) 10 A
Atlikus bandymus su ATB-VET testais, gauta, kad F. columnare jautri chloramfenikoliui, oksitetraciklinui, furazolidonui, nitrofurantoinui, eritromicinui, streptomicinui, penicilinui, amoksicilinui, amoksicilino ir klavulano rūgšties deriniui, cefalotinui, spektinomicinui, gentamicinui, apramicinui, tetraciklinui, doksiciklinui, linkomicinui, tilozinui, cotrimazoliui, sulfametizoliui, flumekvinui, oksolininiai rūgščiai, enrofloksacinui, fusidinei rūgščiai, rifampicinui ir metranidazoliui (6 lentelė).
20 6 lentelė. ATB-VET diagnostinės sistemos testų panaudojimo rezultatai F. columnare atţvilgiu. Jautrios – J, atsparios – A.
Antimikrobinė medţiaga (mg/ml) Jautrumas Antimikrobinė medţiaga (mg/ml) Jautrumas Penicilinas 0,25 J Doksiciklinas 4 J Amoksicilinas 4 J Eritromicinas 1 J Amoksicilino ir klavulano rūgšties junginys 2 J Linkomicinas 2 J Oksacilinas 2 A Pristinamicinas 2 A Cefalotinas 8 J Tilozinas 2 J Cefoperazonas 4 A Kolistinas 4 A Streptomicinas 8 J Kotrimoksazolis 2/38 J Spektinomicinas 64 J Sulfametizolis 100 J Kanamicinas 8 J Flumekvinas 4 J
Gentamicinas 4 J Oksolininė rūgštis 2 J
Apramicinas 16 J Enrofloksacinas 0,5 J
Chloramfenikolis 8 J Nitrofurantoinas 25 J
Tetraciklinas 4 J Fusidinė rūgštis 2 J
Rifampicinas 4 J Metranidazolis 4 J
Serologiniai nustatymo metodai. Uţ kultūrų auginimą kur kas tikslesni yra serologiniai tyrimai. F. columnare nustatymui naudojama ELISA ir antikūnių fluorescencijos testai (Shoemaker et al., 2003). Taip pat taikomas LAMP testas, kuris puikiai pritaikomas F. columnare nustatyti iš ţiaunų, nuo kūno ir galvos paţeidimų bei inkstų (Yeh, 2006).
Molekulinės diagnostikos metodai. Vis daţniau naudojami labiau jautrūs ir ţymiai maţiau laiko uţimantys diagnostikos būdai nustatyti ligų sukėlėjus, tame tarpe ir F. columnare. Anot Griffin (1987) viena pirmųjų metodikų buvo fluorescuojančių antikūnių tyrimas. Buvo sukurtas monokloninis antikūnas prieš F. columnare, kuris puikiai veikė, buvo patvirtintas ir naudojamas nustatyti mikroorganizmą iš šaldytos ţuvies mėginių. Taip pat šią bakteriją galima išskirti iš švieţių lašišinių ţuvų ţiaunų mėginių – tam naudojamas netiesioginės fluorescencijos metodas. Panašiame tyrime panaudojus pastarąjį diagnostikos metodą buvo patvirtinta 19 % susirgimų F. columnare iš prieš tai preliminariai diagnozuotų Flavobacterium branchiofilum (Speare et al., 1995).
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) – tai tyrimas, naudojamas aptikti ir nustatyti F. columnare nukleininę rūgštį iš infekuotos ţuvies odos mėginių ir bakterinės kultūros. Ši technika naudoja rūšiai būdingus nukleotidų sekos segmentus tam, kad galima būtų dauginti 16S rRNR geną (Bader et al., 2003).
Kombinuota PGR ir KFIP leidţia atlikti kur kas tikslesnę mikroorganizmo diagnostiką. Atliekant tyrimą tiesioginiu molekuliniu metodu, daugiausia nustatyta labai panašių sekų į F. columnare, tačiau didţioji dalis padermių, kurios buvo izoliuotos dirbtinėje mitybinėje terpėje, buvo
21 Flavobacterium hibernum. Skirtumas tarp šių dviejų analitinių metodų (PGR ir KFIP) buvo apibūdintas kaip F. columnare replikacijos atidėjimas dėl tos pačios genties saprofitinių rūšių buvimo ar dėl kitų antagonistiškumu pasiţyminčių bakterijų (pvz.: Pseudomonas spp.) Bader ir kiti (2003) aprašė, kad nustatytas kolumnariozę sukeliančio mikroorganizmo išskyrimo būdas iš kitų genčiai priklausančių bakterijų (Flavobacterium psychrophilum, Flavobacterium aquatile, Flavobacterium branchiophilum) ir kitų ţuvų patogeninių bakterijų (pvz.: Edwardsiella spp., Aeromonas spp., Streptococcus iniae) naudojant rūšiai būdingą 16S rRNR genu paremtą pradmenį. Pasirinktos pradmenų poros gali būti naudojamos specifiškai diagnozuoti įvairius patogenus, įskaitant ir F. columnare. Tačiau minėtas mikroorganizmas taip pat esti aplinkoje kaip nepatogeninis organizmas, o tuo tarpu patogeninių virulentiškumas yra skirtingas (Tiirola et al., 2002; Bader et al., 2003). Teoriškai kiekybinis PGR diagnostinis tyrimas yra labai jautrus ir gali vieną DNR sekos fragmentą padauginti net ir iki vieno milijono kartų. Todėl ir net tik kelios F. columnare bakterijos, esančios paimtame mėginyje duos teigiamą atsakymą. Tačiau kaip ir minėta anksčiau – tyrinėjamas organizmas yra plačiai paplitęs gamtoje ir todėl jo kelių vienetų radimas ant paviršinių ţuvies audinių dar nereiškia, kad mėginys buvo paimtas iš kolumnarioze sergančios ţuvies. Daţniausiai imant mėginius iš sergančių ţuvų – randama begalė F. columnare bakterijų (Bader et al., 2003).
DNR in situ (DNR-ISH) hibridizacija – tai dar vienas specifinis molekulinis tyrimo metodas, tinkantis nustatyti F. columnare buvimą ar nebuvimą paimtame mėginyje. Jis ypatingas tuo, kad ne tik identifikuoja, bet ir lokalizuoja bakteriją esančią histologiniame preparate. Tinkama DNR dalis yra nustatoma, kuri nustatys bakterijos genomo nukleotidų seką. Paimto mėginio – audinio dalis yra trumpai apvirškinama cheminėmis medţiagomis, kad palengvintų praeinamumą. Tinkama dalis yra pritaikoma ir galima pradėti atlikti hibridizaciją bet kurioje DNR sekos vietoje, palaikant tam tikras sąlygas, pvz.: temperatūrą, skiediklio koncentraciją, jonų koncentraciją. Tokie tyrimai paprastai naudoja antidigoksigeninius antikūnius, kurie konjuguoti su šarmine fosfataze ir tai yra naudojama kaip indikatorinė sistema. Chromageno tirpalas yra šviesiai geltonos spalvos, kurią suteikia nitro-mėlynojo tetrazoliumo daţai, kurie vėliau šarminės fosfatazės įtakoje redukuojami iki netirpaus mėlynai juodo formazano pigmento (Tripathi, 2003).
1.5. Kontrolė
Geras auginimo sistemų valdymas, anot Cunningham, Suomalainen ir kt. su jais dirbančių mokslininkų, yra pagrindinis dalykas dalykas, kuris gali padėti suvaldyti F. columnare proverţius.
22 Stebint tokius parametrus kaip šėrimas, amoniako kiekis, deguonies kiekis, temperatūra, vandens kiekis, ţuvų auginimo tankis ir juos registruojant galima matyti ir tikėtis kada gali įvykti kolumnariozės pasireiškimas (Suomalainen et al., 2005a; Cunningham et al., 2012).
Gamybinėmis sąlygomis lašišinės ţuvys yra auginamos panaudojant atviros ir uţdaros (recirkuliacinės) vandens apytakos sistemas. Pastaroji yra autonomiška ir leidţia efektyviai panaudoti turimus išteklius. Maţa priklausomybė nuo išorinių veiksnių leidţia plačiai kontroliuoti veisimo technologinius procesus. Visiškai valdant tokius veiksnius, kaip vandens temperatūrą, pH, ištirpusio deguonies kiekį, individų tankį, pašarų kokybę galima labai efektyviai siekti maksimalių rezultatų. Atviros sistemos, pagrįstos natūralaus vandens pratekėjimu, taip yra pigiau. Tokiose sistemose sunkiau kontroliuoti aplinkos veiksnius, ligų plitimą, tačiau čia sukuriamos sąlygos, artimos natūralioms – tai yra privalumas galintis pasireikšti auginant ţuvis natūraliems ištekliams atstatyti. Jose organizmas gali geriau prisitaikyti prie būsimų sąlygų. Auginimo sistemos pasirinkimas nuo pasirinktos ţuvų rūšies bei nuo kitų susiklosčiusių aplinkybių: finansinių, gamtinių-gamybinių infrastruktūrų, ir yra individualus (Kazlauskienė et al., 2008).
Profilaktika ir prevencija. Suomalainen ir kt. nustatė, kad druskų ir rūgštaus vandens procedūros, turėtų padėti sunaikinti F. columnare vandenyje, kuriame plaukioja ţuvys (Suomalainen et al., 2005b). Shoemaker ir kiti (2003) pasiūlė auginant šamus; juos šerti kartą per dieną ar kartą per 2 dienas (jei jie nesusiranda ar nėra natūralaus maisto) tam, kad palaikyti geresnį imunitetą. Altinok ir Grizzle (2001) atliktas bandymas su šamais ir auksinėmis ţuvelėmis parodė, kad vandenį prisotinus iki 1 NaCl promilės, ţuvų mirtingumas ţenkliai sumaţėjo, o koncentraciją padidinus iki 9 promilių – po bandymo liko sveiki visi naudoti individai. Jei ţuvis išeitų pripratinti iki bent minimalios terapinės druskos koncentracijos (1 promilės), būtų galima sumaţinti F. columnare paplitimą ir tuo pačiu sergamumą.
Thomas – Jinu ir Goodwin (2004) aprašė ţuvų auginimo baseinų prieţiūrai skirtą preparatą – „Diquat“ (herbicidas 6,7-dihidrodipirido pirazidinumo bromidas). Jo 5,4 mg/l koncentracija labai gerai dezinfekavo laikymo talpas.
2012 m. Darwish ir kitų mokslininkų, dirbusių kartu tyrimas parodė, kad kalio permanganatas (KMnO4) yra labai veiksminga priemonė kovojant su kolumnarioze. Remiantis jų tyrimų
duomenimis, panaudojus minėtą preparatą (koncentracija 2,08 ± 0,08 mg/l) iš karto po apsikrėtimo F. columnare, ţuvų išgyvenamumas buvo 99 %, o jo nenaudojus tik – 78 %. Tačiau atlikus studiją išsamiau – panaudojus KMnO4 1-ą, 6-ą ir 9-ą dienomis po uţkrėtimo kolumnaris bakterijomis,
23 individų. Taip pat šie mokslininkai tyrė ir 2,1 mg/l vario sulfato (CuSO4) prevencinį veikimą.
Tyrimas parodė, kad tai veiksminga priemonė ne vien nuo Aeromonas spp., tačiau ir nuo F. columnare.
Ţuvų vakcinacija – tai dar viena prevencinė priemonė kovojant su kolumnarioze. Fujihara ir Nakatani (1971) sėkmingai imunizavo trejų mėnesių sidabrines lašišas (Oncorhynchus kisutch) pridėdami į pašarą termiškai sunaikintų F. columnare ląstelių. Nors vakcinacijos ţuvims ne visada pavyko, tačiau Moore ir kiti (1990) įrodė, kad kasmet imunizuoti šamai sirgo daug maţiau nei neimunizuoti.
Shoemaker ir kiti kartu dirbę mokslininkai (2011) aprašo savo atliktus tyrimus, kuomet paėmus gyvų F. columnare virulentiškas padermes ir jas paveikus rifampicinu iki atenuacijos, buvo sukurta vakcina. Panaudojus vakciną šamų (Ictalurus punctatus) 10-48 dienų mailiui vėliau mėginant uţkrėsti F. columnare bakterijomis, buvo nustatytas 57 – 94 % išgyvenamumas. Išgyvenamumas skyrėsi dėl skirtingo vakcinacijos laiko. Panaudojus vakciną didţiaburniams ešeriams (Micropterus salmoides) dešimtą dieną po išsiritimo buvo pasiektas 74 – 94 % išgyvenamumas (procentas skiriasi dėl skirtingų dozių, taikytų vakcinavimui).
Gydymas. Kolumnariozės gydymas ţinomas jau senai, tačiau jis ne visada veiksmingas. Esant nedideliems ţuvų paviršiniams paţeidimams, susirgimus galima gydyti panaudojant antimikrobines medţiagas į vandenį, tačiau esant sisteminei infekcijai – pastarosios įmaišomos į pašarą. Bandant gydymo variantus, Baltijos lašišai (Salmon salar) buvo nustatyta, kad oksitetraciklinas yra tinkamas naudojant 10 dienų su pašaru, tačiau gydymas turi būti pradėtas anksti pastebėjus ligą (Bullock et al., 1986).
Thomas-Jinu ir Goodwin (2004) aprašė „Romet“ (sudėtyje – sulfadimetoksinas ir ormetoprimas) ir „Terramycin“ (sudėtyje – oksitetraciklinas) poveikį. Panaudojus jų prieš uţkrečiant ţuvis bakterijomis, vėliau mirtingumas nebuvo visose grupėse.
Hawke ir Thune (1992) aprašė, kad esant ligos protrūkiui galima vartoti „Romet“ paruošiant 50 mg/kg koncentraciją arba „Terramycin“ paruošiant 80 mg/kg koncentraciją. Antimikrobinės medţiagos sumaišomos su pašaru ir suduodamos ţuvims.
Laanto ir kiti kartu dirbę mokslininkai (2011) aprašė fagų lizatus, kurių pagalba galima sustabdyti F. columnare kolonijų augimą ar jas visai sunaikinti. Buvo atlikti tyrimai su šamais (Claries batrachus), kurie taip pat įrodė sėkmingą fagų FCP1 veikimą (100 % išgyvenamumas). Po sėkmingo gydymo buvo atliktas bakteriologinis testas, kuris buvo neigiamas. Tokiu atveju tai vienas labiausiai veikiančių gydymo metodų (Prasad Y. et al., 2011).
24 2. TYRIMO OBJEKTAS, MEDŢIAGA IR METODAI
Magistro baigiamasis darbas buvo rengiamas Lietuvos sveikatos mokslų universitete Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje 2011 – 2014 metų laikotarpiu.
Magistro baigiamasis darbas buvo ruošiamas prisilaikant metodinių nurodymų reikalavimų (Januškevičienė, Januškevičius, 2013).
Lašišų ir šlakių mailiaus ir jauniklių morfologiniai, morfofiziologiniai, mikrobiologiniai, ţiauninių dangtelių ir pelekų, hematologiniai tyrimai buvo atlikti Gamtos tyrimų centro Ekologijos instituto Gėlųjų vandenų ekologijos sektoriaus laboratorijoje.
Tyrimai buvo atlikti 2011, 2012 metų pavasarį ir rudenį. Šlakių ir lašišų mailius ir jaunikliai buvo auginami Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyne uţdaros vandens apytakos sistemos sąlygomis. Pavasarį Ţeimenos veislyne augintas mailius buvo išleistas į Plaštakos upę, kur augo iki rudens. Rugsėjį buvo sugauti išleistiniai ir laukiniai šlakių, lašišų jaunikliai (0+). Plaštakoje ţuvys buvo gaudomos sertifikuotu elektros ţūklės aparatu (srovės stiprumas 540 V, daţnis – 20–60 Hz, impulso trukmė 2–12 ms-1), fiksuoto ilgio upės atkarpoje.
2011-ųjų, 2012-ųjų m. birţelio ir rugsėjo mėnesiais Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyne, esančiame Švenčionių rajone, buvo atlikti dirbtinai veistų ir auginamų šlakių ir lašišų jauniklių (0+) morfologinių, morfofiziologinių, mikrobiologinių, patologinių bei kraujo tyrimai. Ţuvys buvo auginamos uţdaros vandens apytakos sistemos sąlygomis.
Kraujo rodikliai: ţuvims buvo analizuoti šie rodikliai: eritrocitai (Er, 106 x mm3), hemoglobino koncentracija (Hb, g/l), hematokrito lygis (Hct, l/l), leukocitų skaičius (Leu, 103 x mm3), gliukozės kiekis (mmol/l). Taip pat buvo apskaičiuota: vidutinis eritrocitų tūris (VET, fl) ir vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (VHbKE, pg) (Svobodova, Vykusova, 1991). Eritrocitai buvo suskaičiuoti įvairiose vystymosi stadijose: eritroblastai (nesubrendę), vidutiniai (subrendę) ir polichromatofiliniai eritroblastai (išsivystę). Gliukozės kiekis kraujyje įvertintas elektrocheminiu metodu, naudojant prietaisą „EKSAN-G“. Hematokritas nustatytas naudojant centrifugą „Hematocrit 210”. Hemoglobinas nustatytas spektrofotometriniu metodu (bangos ilgis - 540 nm) su „Drabkino” tirpalu.
Pelekų ir ţiauninių dangtelių būklės įvertinimas: atlikta vizuali šlakių ir lašišų mailiaus ir jauniklių pelekų ţiauninių dangtelių apţiūra. Pelekų pavyzdţiai išanalizuoti mikroskopu (Meiji
25 Techno RZ Series) bei fotografuoti „Nikon“ „Coolpix 995“ ir „Sony a450“ skaitmenininias fotoaparatais.
Mikrobiologinis tyrimas: kolumnariozės tyrimams šlakių ir lašišų mailiaus ir jauniklių bei vandens mėginiai buvo surinkti iš Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyno geguţės ir spalio mėnesiais, o natūralaus ir dirbtinio neršto analizuotos ţuvys buvo gaudomos rugsėjo mėnesį upėse (Plaštakoje ir Šašuoloje). Iš viso buvo išanalizuoti 24 šlakių ir 36 lašišų individai.
Ţuvų bei vandens mėginiai į laboratoriją buvo transportuojami ant ledo. Laboratorijoje vizualiai buvo įvertinta ţiaunų būklė, buvo steriliai atskirtos nuo kūnų. Ţiaunos buvo sveriamos, homogenizuojamos, buferiniu tirpalu (pH – 7,3) atliekami praskiedimai nuo 10-1 iki 10-6.
Vandens mėginiai buvo skiedţiami nuo 10-1
iki 10-6.Flavobacterium columnare skaičius (kolonijas sudarantys vienetai, ksv/g) iš ţiaunų ir vandens buvo nustatyti paskleidţiant tam tikrą mėginių atskiedimą Petri lėkštelėse ant Anacker ir Ordal agaro (AOA) su polimiksino B sulfatu (10 U/ml).
Lėkštelės buvo inkubuotos 5 paras +20 °C temperatūroje. F. columnare kolonijos buvo skaičiuojamos atrenkant gelsvas kolonijas, pasiţyminčias stipriu prisitvirtinimu prie agaro su rizoidinio augimo tipo pakraščiais. Nudaţius Gramo būdu, buvo atrinktos tik Gram – neigiamos lazdelės, 2–12 µm ilgio. Taip pat buvo atlikti katalazės ir oksidazės testai, biocheminės charakteristikos buvo nustatytos naudojantis Griffin (1992), Shamsudin ir Plumb (1996) metodikas.
Morfologiniai rodikliai: vidutinė kūno masė (Q g), vidutinis kūno ilgis (L cm).
Morfofiziologiniai rodikliai: įmitimo koeficientas pagal Fultoną (QF), kūno masės ir ilgio
santykis (Q/L).
1. Vidutinė kūno masė Q, g, nustatyta pagal formulę:
Q Q Q
n
2 1
, kur
Q - vidutinė vieno individo kūno masė Q1 - indo masė su vandeniu
Q2 - individo ir indo su vandeniu masė, n - individų skaičius
2. Įmitimo koeficientas (CF arba QF) pagal Fultoną:
Q Q
L F
100 3 , kur
26 CF - įmitimo koeficientas
Q - individo kūno masė L - individo kūno ilgis
3. Q/L - kūno masės ir ilgio santykis.
Tyrimo metu Ţeimenos lašišų veislyne, esančiame Švenčionių rajone, ūkio specialistų buvo nuolat sekamas vandens hidrocheminis reţimas, ţuvys buvo šeriamos Skreting pašarais
Statistiniai metodai. Gauti rezultatai buvo įvertinti statistiškai. Apskaičiuoti rezultatų vidurkiai ir standartinė paklaida (M SE). Patikimi skirtumai tarp matuojamų dydţių įvertinti naudojant Stjudento kriterijų t (p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05). Statistinė analizė atlikta programa STATISTICA 6.0 [GraphPAD InStat (JAV)].
27 3. TYRIMO REZULTATAI IR APTARIMAS
3.1. Šlakių jauniklių, augusių skirtingomis sąlygomis: veislyne išnerštų ir iki rudens augintų (veislyno) (1 grupė), į upes pavasarį išleistų ir rudenį sugautų (išleistiniai) (2grupė), bei
natūralaus neršto (laukiniai) (3 grupė), biologiniai rodikliai
Morfologiniai ir morfofiziologiniai rodikliai. 2011m. birţelį ir rugsėjį buvo įvertinti šlakių mailiaus ir jauniklių, augusių skirtingomis sąlygomis, morfologiniai ir morfofiziologiniai rodikliai (7 lentelė, 4, 5 pav.).
7. lentelė. Skirtingomis sąlygomis augusių šlakių mailiaus ir jauniklių morfologiniai ir morfofiziologiniai rodikliai, (X ± SE).
Vieta Data L, cm Q, g Q/L Įmitimo koeficientas, % Šlakių mailius Veislynas (n 17) 2011 06 5,66 ± 0,26 1,61 ± 0,19 0,29 ± 0,02 0,87 ± 0,02 Šlakių jaunikliai Veislynas (I gr.) (n 10) 2011 09 10,8 ± 0,23* 12,22 ± 0,23* 1,12 ± 0,05* 0,96 ± 0,11* Išleistiniai (II gr.) (n 10) 2011 09 9,65 ± 0,32*# 8,16 ± 0,66*# 0,83 ± 0,05*# 0,90 ± 0,14* Laukiniai (III gr.) (n 18) 2011 09 7,36 ± 0,14 4,61 ± 0,20 0,63 ± 0,02 1,16 ± 0,15
Pastaba: patikimi skirtumai:
* - lyginamos I-III gr. ir II- III gr. patikima (p 0,05) # - lyginamos I-II gr. patikima (p 0,05)
Lyginant 2011 m. rugsėjo mėn. šlakių jauniklių, augusių skirtingomis sąlygomis, morfologinius rodiklius nustatyta, kad natūralaus neršto šlakių jauniklių iš Plaštakos upės vidutinis kūno ilgis (L), vidutinė kūno masė (Q) buvo maţesni nei veislyno ir išleistinių, duomenys yra patikimi (p 0,05). Išleistinių jauniklių aukščiau minėti rodikliai buvo maţesni nei veislyno, duomenys patikimi (p 0,05) (4 pav.).
28 4 pav. Dirbtinai veistų (Veislynas) – 1 gr.; pavasarį išleistų ir rudenį
sugautų (Plaštaka) – 2 gr.; laukinių (Plaštaka) – 3 gr., šlakių jauniklių (0+) morfologinių rodiklių palyginimas 2012 m.
Laukinių individų kūno masės ir ilgio santykis (Q/L) buvo patikimai maţesnis nei išleistinių ir veislyno šlakio jauniklių, duomenys patikimi (p 0,05). Išleistinių jauniklių šis rodiklis buvo maţesnis nei veislyno, duomenys patikimi (p 0,05). Natūralaus neršto šlakio jauniklių įmitimo koeficientas (QF) buvo truputį didesnis nei veislyno ir išleistinių jauniklių, tačiau skirtumas
nepatikimas. Išleistinių šlakio jauniklių šis rodiklis buvo toks pats kaip ir veislyno jauniklių (5 pav.).
5 pav. Dirbtinai veistų (Veislynas) – I gr.; pavasarį išleistų ir rudenį sugautų (Plaštaka) – II gr.; laukinių (Plaštaka) – III gr. šlakių jauniklių (0+) morfologinių rodiklių palyginimas 2012 m.
29 Įveisiamų ţuvų kokybę ir jų auginimo sąlygas galime būti įvertinti pagal morfofiziologinius, hematologinius, mikrobiologinius ir kitus tyrimus. Pasaulyje plačiai naudojami biologiniai ţymekliai, kurie greitai ir teisingai atspindi aplinkos veiksnių neigiamą įtaką organizmo būklei. Tarp jų daţnai taikomi morfologiniai ir morfofiziologiniai ţymekliai. Įmitimo koeficientas suteikia informaciją apie organizmo bendrą sveikatos būklę. Aukštos įmitimo koeficiento reikšmės parodo gerą aplinkos kokybę, o labai ţemos – prastą aplinkos kokybę (Heath, 1995; Chellappa et al., 2006). Pelekų ir ţiaunų būklė. Šlakių mailiaus ir jauniklių, augusių skirtingomis sąlygomis, pelekų ir ţiauninių dangtelių būklė parodyta 8 lentelėje ir 6–7 paveikslėliuose.
2011 metų birţelį. šlakių mailiui (n=10), augusiam Ţeimenos veislyne, ţiauninių dangtelių anomalija nustatyta 60,0 %; iš jų 20,0 % kartu matoma krūtinės bei nugaros pelekų nekrozė (8 lentelė,6-7 pav.). 40,0 % individų visi pelekai buvo sveiki.
8 lentelė. Šlakių mailiaus ir jauniklių, augusių skirtingomis sąlygomis, pelekų būklė
Vieta Ţuvis Paţeisti Sveiki Dalinai
atsistatę
Veislynas 2011 09 Mailius (n = 10) 60 % 40 % -
Jaunikliai (n = 10) 100 % - -
Išleistiniai 2011 09 Jaunikliai (n = 10) - 40% 60 %
Laukiniai 2011 09 Jaunikliai (n = 10) - 100 % -
Visiems tirtiems ţuvų veislyne augusiems šlakių jaunikliams taip pat buvo nustatyta pelekų nekrozė. 100 % ţuvų buvo konstatuota nugaros peleko nekrozė; iš jų 30 % kartu buvo matoma ir uodegos pelekų (7 pav.), 50 % krūtinės pelekų, 90 % pilvo dešiniojo peleko, 20 % ţiauninių dangtelių nekrozė (20 pav.).
Pastebėta, kad krūtinės, nugaros ir pilvo pelekai, dėl anksčiau buvusio uţdegimo ir nekrozės, būna depigmentuoti, sunykę ir deformuoti, galai sustorėję, gleivėti, sutrumpėję iki 30–50 % buvusio ilgio. 60 % Plaštakoje pagautų išleistinių šlakiukų buvo nustatyta, kad nekrozuoti nugaros ir krūtinės pelekai ataugo, 40 % ţuvų pelekai buvo sveiki. Visų natūralaus neršto šlakių, sugautų Plaštakoje, pelekai buvo nepaţeisti.
30 7 pav. Šlakių jauniklių (0+), augusių veislyne, uodegos
pelekų nekrozė
2008 metais atlikti tyrimai nurodė, kad Ţeimenos lašišų veisimo įmonėje auginamų šlakių pelekų nekrozę sukelia Aeromonas spp. bakterijos (Kazlauskienė et al., 2008). Aeromonas gentis yra patogenai, kurių yra vandens aplinkoje, tačiau ligas ţuvims sukelia tik susidarius tam tikroms sąlygoms (neigiamoms), kurių pasekoje susilpnėja ţuvų imunitetas, jos uţsikrečia kitomis ligomis. Pasiţymėdamos didţiulėmis dauginimosi galimybėmis šios bakterijos gali greitai sukelti infekcijos protrūkį. Paleidus šlakių mailių į natūralias gyvenimo sąlygas, nekrozė sumaţėja (net beveik baigiasi), kai kuriais atvejais matoma paţeistų pelekų dalinė regeneracija, vis dėl to susirgimas ţenkliai sumaţina lašišinių ţuvų verslinį sugrįţimą (Sidorov et al., 2000, Schrader et al., 2013).
6 pav. Šlakių mailiaus, augusio veislyne, ţiauninių dangtelių anomalija (viršuje), ir sveikas individas (apačioje).
31 Ţiauninių dangtelių anomalija – tai kaulinių elementų (operculum) neišsivystymas, dėl ko dangtelis būna sutrumpėjęs ir pilnai neuţdengia ţiaunų. Deja, anomalijų prieţastys kol kas dar nėra išaiškintos. Daţniausiai yra minimi terminio inkubavimo ir paauginimo sąlygų paţeidimai, pagreitintas vystymasis nuo apsivaisinimo iki dirbtinio maitinimo pradţios; per didelis embrionų tankis inkubacijos metu, didelės amonio koncentracijos, kitos cheminės medţiagos, vandens srovės greitis, vandens druskingumo pasikeitimai, deguonies koncentracijos vandenyje ir apšvietimo intensyvumo kaita, įvairių patogenų poveikis (Kazlauskienė et al., 2006).
Kraujo rodikliai. Ţeimenos veislyne augintų ir pavasarį išleistinių (rugsėjį analizuotų) į upes šlakiukų fiziologinei būklei įvertinti buvo analizuojami šie hematologiniai rodikliai: eritrocitų kiekis (Er, 106 x mm3), hemoglobino koncentracija (Hb, g/l), hematokritas (Hct, l/l), leukocitų kiekis (Leu, 103 x mm3), gliukozės koncentracija (mmol/l). Taip pat buvo paskaičiuota: vidutinis eritrocitų tūris (VET, fl) ir vidutinė hemoglobino koncentracija eritrocite (VHbKE, pg) (10 lentelė).
Rugsėjo mėnesį (2011 m.) analizuotų Ţeimenos veislyne augintų šlakių jauniklių (0+) eritrocitų koncentracija kraujyje svyravo nuo 0,70 0,04 iki 1,15 0,03 106
× mm3, vidurkis sudarė 0,97 0,02 106
x mm3. Tyrimo metu nustatyta, kad vidutinį dydį atitikę eritrocitai sudarė 88,65 %, o 17,52 % ir 3,50 % atitinkamai sudarė eritroblastai (nesubrendę eritrocitai) ir polichromatofiliniai eritroblastai (subrendę eritrocitai). Leukocitų koncentracija svyravo nuo 13 iki 35 (103 x mm3), o vidurkis sudarė 20,40 2,59 x 103
mm3. Nustatyta hemoglobino koncentracija buvo 74,80 3,86 g/l, o hematokrito lygis buvo 0,39 0,01 l/l. Duomenys pateikti 9 lentelėje. Šlakių jauniklių hematokrito, hemoglobino ir kitų išvestinių rodiklių reikšmės buvo fiziologiškai normalių rodiklių ribose (Kazlauskienė et al., 2009).
9 lentelė. Šlakių jauniklių, augusių skirtingomis sąlygomis, eritrograma
Grupės
Er, 106 x mm3
Normalūs Eritroblastai Polichromatofiliniai
eritroblastai Suma
Veislynas 0,76±0,04 0,17±0,02 0,034±0,003 0,97±0,02
Išleistiniai 0,39±0,03 0,25±0,02 0 0,65±0,02
Rugsėjo mėn. (2011 m.) taip pat buvo analizuoti Plaštakos upėje suţvejoti pavasarį išleisti šlakiai. Jų kraujo parametrai svyravo plačiose ribose (lyginant su veislyno šlakių kraujo parametrais). Nustatyta, kad visų kraujo rodiklių reikšmės (išskyrus leukocitų kiekį) buvo statistiškai patikimai maţesnės lyginant su veislyno šlakiais.
Plaštakos upės šlakių kraujyje eritrocitų apskaičiuota 0.65±0.015 (106 × mm3), tai yra 32,9 % maţiau nei veislyno šlakių. Kitų hematologinių rodiklių reikšmės taip pat buvo maţesnės:
32 hemoglobino – 14 %, hematokrito – 33 %, gliukozės – 61 %, VET – 10 %, VHbKE – 15 % atitinkamai. Tačiau būtina paţymėti, kad rodiklių reikšmių skirtumas iki 10 % yra fiziologinės normos rodiklių svyravimų ribose.
10 lentelė. Šlakių jauniklių, augusių skirtingomis sąlygomis, kraujo rodikliai
Grupės Er, 106 x mm3 Hb, g/l Hct, l/l Leu, 103 x mm3 Gliukozė, mmol/l VET, fl VHb KE, pg Veislynas 0,97±0,02* 74,8±3,86 0,39±0,01* 20,4±2,59 3,1±0,43* 415±24,31* 77,1± 3,98* Išleistiniai 0,65±0,02* 64±3,00* 0,26±0,03* 19,2±2,50* 1,2±0,32 369±44,12 65,9± 3,10*
Pastaba: * - patikimi skirtumai (p ≤ 0,0001)
Išleistinių šlakių ţemesnės nei nominalios kraujo rodiklių reikšmės, yra susiję su ţemesniu ţuvų svoriu. Kraujo rodiklių reikšmės buvo tokios dėl ţuvų augimo spartos ir vystymosi. Dalis autorių teigia, kad ţuvų kraujo parametrų reikšmės priklauso nuo ţuvies svorio (Hassana et al., 1993). Nors išleistinių šlakių visi hematologiniai parametrai buvo maţesni nei veislyno ţuvų, atsiţvelgiant į ţuvies dydį, svorį, jų reikšmės yra fiziologinės normos ribose (Kazlauskienė et al., 2009) Verta atkreipti dėmesį, kad Plaštakos upės šlakių jauniklių VET ir VHbKE buvo tik 10 ir 15 %, atitinkamai ţemesni nei ţuvivaisos veislyne augintų ţuvų, tuo tarpu individai buvo ţymiai maţesni, o gliukozės koncentracija skyrėsi net 61 %. Šios rodiklių reikšmės ir jų pasiskirstymas leidţia manyti, kad natūralioje aplinkoje ţuvys auga kiek lėčiau. Ţuvų augimas priklauso nuo aplinkos sąlygų, vandens temperatūros pasikeitimai ţenkliai veikia metabolizavimo procesų spartą (Talbot, 1993). Martinez ir kiti (1994) nustatė teigiamą koreliaciją tarp bendro proteino koncentracijos ir vandens temperatūros. Nors tyrimo metu nustatytas eritrocitų kiekis ţemesnis, hemoglobino rasta tik 14 % maţiau, kas rodo uţtenkamą ţuvų organizmo aprūpinimą deguonimi teigiamam medţiagų apykaitos procesų vyksmui. Taip pat ţemesnę hemoglobino koncentraciją galima paaiškinti ir išleistinių šlakių kraujyje nustatytu statistiškai reikšmingai (32 %) didesniu nesubrendusių eritrocitų kiekiu, lyginant su veislyno šlakiais, nes nesubrendę eritrocitai turi maţiau hemoglobino nei suaugę. Nustatyti eritrogramos ypatumai Plaštakos upės šlakių kraujyje parodo intensyvius kraujodaros procesus. Taip pat parodo padidėjusį eritropoetino aktyvumą priekinėje inkstų dalyje jaunų, intensyviai augančių ţuvų organizme, eritroblastų patekimą į kraujotaką (Nikinmaa, 1992).
2011 m. rugsėjo mėnesį nustatyta ţemesnė kraujo hemaglobino koncentracija tenkanti eritrocitų skaičiui rodo prastesnį organizmo apsirūpinimą deguonimi (10 lentelė). Pastebėta, kad
33 gliukozės kiekis visais metais veislyno ţuvyse buvo praktiškai toks pat, o lyginant su natūralaus neršto ir išleistiniais šlakių jaunikliais didesnis. Sprendţiama, kad tam galėjo turėti įtakos geresnės mitybos sąlygos veislyne arba nedidelis streso poveikis. Dalies mokslininkų darbuose padidėjusi gliukozės koncentracija kraujyje siejama su streso poveikiu ţuvies organizmui, o Ţeimenos veislyne ţuvys yra nuolat veikiamos kai kurių neigiamų veiksnių (padidintas ţuvų tankis, galimai per didelė azoto junginių koncentracija vandenyje) (Pickering et al., 1982; Hoar et al., 1992).
Nustatyta, kad stresinė situacija, dėl tam tikrų ţmogaus įsikišimų ar hidrocheminių savybių, sukelia neigiamus pokyčius (maţėja kraujo forminių elementų ar jie pakinta į neigiamą pusę) lašišinių ţuvų kraujyje (Cho et al., 2002). Daugelio autorių aprašyta, kad kraujo parametrai yra susiję su organizmo atsaku į aplinkos poveikį ir kad aplinka, kurioje gyvena ţuvys, gali įtakoti šiuos rodiklius. Vis maţiau dėmesio yra sutelkiama ţuvų populiacijoms. Tokie tyrimai, nagrinėjantys ţuvų morfofiziologinių rodiklių ypatumus yra gana reti, tačiau juose pabrėţiama, kad pastarieji parametrai įvairių vandens santelkų ţuvų skiriasi (Olarinmoye, 2008).
Mikrobiologiniai rodikliai. F. columnare kiekis vandenyje. Ţeimenos lašišų veislyno vandens mėginiuose geguţės mėn. buvo aptikta 1,5 ± 0,1 x 102
KSV ml x 10-1 F. columnare skaičius, o spalio mėn. jų skaičius siekė 2,0 ± 0,4 x 102
KSV ml-1 (11 lentelė).
11 lentelė. F. columnare skaičius Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyno vandenyje (vidurkis SD)
Mėginių paėmimo data F. columnare skaičius, KSV ml x 10-1
2011 geguţės mėn. 1,5 ± 0,1 x 102
2011 spalio mėn. 2,0 ± 0,4 x 102
Gauti rezultatai parodo, kad Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyne baseinų vandenyje yra F. columnare bakterijų, kurios esant neigiamiems aplinkos veiksniams gali sukelti kolumnariozės protrūkį ir padaryti ūkiui didţiulį nuostolį.
F. columnare kiekybinė sudėtis šlakių ţiaunose. Vizualiai įvertinus tirtas ţuvis, kolumnariozės poţymių nenustatyta nei ant ţiaunų, nei ant pelekų, nei ant likusio kūno. Ţeimenos veislyne šlakių mailiaus ţiaunose (geguţės mėnesį) ir jauniklių (spalio mėn.) F. columnare skaičius patikimai nesiskyrė, jų kiekis buvo nuo 2,0 ± 0,2 x 103
iki 3,2± 0,8 x 104 KSV g-1 (12 lentelė). Veislyne augintų, vėliau pavasarį paleistų ir rudenį sugautų šlakių ţiaunose F. columnare skaičius patikimai nesiskyrė nuo veislyne augintų šlakių ir siekė 3,0 ± 1,0 x 103
KSV g-1. Laukinių šlakių ţiaunose Plaštakos upėje kolumnariozės ligos sukėlėjas nebuvo aptiktas.
34 12 lentelė. F. columnare skaičius šlakių mailiaus ir jauniklių ţiaunų mikrofloroje (vidurkis SD)
Tyrimo objektas
Mėginių ėmimo
data Mėginių ėmimo vieta
F. columnare skaičius, KFV g-1
Mailius (n=8) 2011 geguţės mėn. Ţeimenos lašišinių ţuvų
veislynas 3,2 ± 0,8 x 10
4
Jaunikliai (n=5) 2011 spalio mėn. Ţeimenos lašišinių ţuvų
veislynas 2,0 ± 0,2 x 10
3
Dirbtinio neršto
jaunikliai (n=5) 2011 rugsėjo mėn. Plaštakos upė 3,0 ± 1,0 x 10
3
Natūralaus neršto jaunikliai
(n=5)
2011 rugsėjo mėn. Plaštakos upė 0 ± 0
Flavobacterium columnare tai vienas seniausiai ţinomų šiltavandenių gėlavandenių ţuvų ligų sukėlėjas, jį pirmasis aprašė Herber Spencer Davis 1922-aisiais metais (Durborrow et al., 1998). Be to tai viena labiausiai pasaulyje paplitusių ţuvų ligų (Farkas, Olah, 1986; Rintamaki-Kinnunen et al., 1997; Decostere et al., 1998; 1999; Altinok, Rizzle, 2001; Tiirola et al., 2002; Virbickas et al., 2002; Bader et al., 2003; Shoemaker et al., 2003; Thomas-Jinu, Goodwin, 2004; Skrodenytė-Arbačiauskienė, 2005; Figueiredo et al., 2005; Guan et al., 2013). Kolumnaris ligos protrūkiai įprastai pasireiškia jauniems ūkiuose auginamiems individams - ţuvų šiųmetinukams (0+) ir metinukams (1) šiltuoju vasaros sezono metu, kada vanduo sušyla virš 20ºC. Tokio amţiaus ţuvys nėra atsparios šiai ligai ir gaišta beveik visi. Aukšta vandens temperatūra, stresas, bloga vandens kokybė, didelis ţuvų tankis baseine ir bloga ţuvų mityba gali sukelti F. columnare protrūkį (Decostere et al., 1998; 1999; Wakabayashi, 1991; Holt et al., 1975; Klesius et al., 1999; Shoemaker et al., 2003). Buvo nustatyta, kad pasveikusios ţuvys tampa kolumnariozės ligos nešiotojos ir išskiria į aplinką ligos sukėlėją tuo sukeldamos grėsmę sveikiems individams (Becker, Fujihara, 1978). Kolumnariozės sukėlėjas daţniausiai paţeidţia ţuvies ţiaunas ar odą, tačiau kai kuriais atvejais F. columnare buvo išskirtas ir iš inkstų, kepenų (Welker et al., 2005). Tipiški ligos simptomai yra ţiaunų ir pelekų nekrozė, kūno vientisumo paţeidimai, burnos puvinys. Ţuvų gaišimas pasireiškia priklausomai ar virulentiška padermė infekavusi ţuvį ir svyruoja nuo 12 val. iki kelių savaičių. Stiprūs odos ir ţiaunų paţeidimai sutrikdo osmosinę reguliaciją ir elektrolitų homeostazę kas ir sukelia audinių edemas ir vėliau uţdusimą (Tripathi et al., 2005; Declercq et al., 2013).
Apibendrinus gautus rezultatus galima teigti, kad kolumnariozės sukėlėjų pastoviai yra Ţeimenos lašišinių ţuvų veislyno vandenyje ir šlakių ţiaunose. Susidarius palankioms jiems vystytis sąlygoms, šių patogenų skaičius gali sparčiai pradėti augti ir sukelti kolumnariozės protrūkį. Dirbtinio neršto ir vėliau išleistų į natūralius vandens telkinius šlakių jauniklių ţiaunose
