Interazioni multitrofiche nella difesa del frumento dalla fusariosi della spiga

(1)

UNIVERSITA’ DI PISA

Tesi di Laurea

Corso di Laurea in Produzioni Agroalimentari e

Gestione degli Agroecosistemi

Interazioni multitrofiche nella difesa del

frumento dalla fusariosi della spiga

RELATORI: Prof. Giovanni Vannacci

Dott.ssa Sabrina Sarrocco

CORRELATORE: Prof. Marco Mazzoncini

CANDIDATO: Fabio Valenti

(2)

(3)

INDICE

1. INTRODUZIONE... 4

1.1 Fusarium Head Blight ... 4

1.2 Ecologia degli agenti patogeni... 9

1.2.1 Fusarium graminearum ... 9

1.2.2 Fusarium culmorum... 11

1.3 Controllo biologico del FHB ... 12

1.4 Trichoderma spp. ... 14

1.4.1 Trichoderma gamsii 6085 ... 15

1.5 Fusarium oxysporum ... 16

2. SCOPO DEL LAVORO ... 18

3. MATERIALI E METODI... 19

3.1 Isolati fungini ... 19

3.2 Prova di inibizione in vitro ... 20

3.3 Valutazione della capacità di accrescimento degli isolati fungini ... 22

3.4 Valutazione del NOI (Niche Overlapping Index) dei patogeni e dei funghi antagonisti attraverso la capacità di crescita su diverse fonti di carbonio (Sistema Biolog) ... 23

3.5 Valutazione della capacità saprofitica competitiva su suolo e paglia... 26

4. RISULTATI ... 28

4.1 Prova di inibizione in vitro ... 28

4.2 Valutazione della capacità di accrescimento degli isolati fungini ... 42

4.3 Valutazione del NOI (Niche Overlapping Index) dei patogeni e dei funghi antagonisti attraverso la capacità di crescita su diverse fonti di carbonio (Sistema Biolog) ... 46

4.4 Valutazione della capacità saprofitica competitiva su suolo e paglia... 48

5. DISCUSSIONE ... 52

(4)

1. INTRODUZIONE

1.1 Fusarium Head Blight

Il Fusarium Head Blight (FHB), malattia nota anche come fusariosi della spiga di

frumento, è una tra le avversità delle piante più rilevanti dal punto di vista economico,

diffusa in tutto il mondo, che colpisce grano, orzo, riso ed altri cereali minori, provocando ingenti perdite di raccolto (Starkey et al., 2007; Xu et al., 2008).

Negli anni ‘90 la fusariosi della spiga di frumento ha causato perdite per 3 miliardi di dollari negli Stati Uniti nelle colture di grano e orzo (Windels, 2000; Starkey

et al., 2007).

E’ stato osservato che 19 specie fungine sono associate al FHB (Parry et al., 1995; Xu & Nicholson, 2009), anche se i principali agenti causali della malattia sono

Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae, Microdochium nivale e Microdochium majus (Xu et al., 2008; Xu & Nicholson, 2009). I

suddetti agenti patogeni possono agire singolarmente o formare un complesso che genera la malattia. Infatti, alcuni patogeni, sebbene appartenenti a diverse specie, si comportano allo stesso modo quando infettano e colonizzano l’ospite (Xu & Nicholson, 2009) e possono coesistere nello spazio e nel tempo (Fitt et al., 2006). Questi patogeni non possono essere differenziati solo sulla base di sintomi visivi (Xu & Nicholson, 2009).

Generalmente si ritiene che la malattia produca danni di maggiore entità in ambienti caldi e umidi durante la fase di antesi (Parry et al., 1995, Xu et al., 2008). Grano e orzo sono colture altamente suscettibili in questa fase fenologica, in particolar modo quando questo stadio della pianta è accompagnato da frequenti precipitazioni ed elevata umidità (Windels, 2000).

Oltre alle condizioni climatiche, diversi aspetti agronomici come l’applicazione di azoto, la rotazione delle colture e le tecniche di lavorazione possono influenzare la relativa preponderanza di specie all’interno del complesso che causa il FHB (Xu & Nicholson, 2009). Lemmens et al. (2004) hanno dimostrato che aumentando l’applicazione di azoto da 0 a 80 kg/ha, si incrementa la diffusione della malattia con

(5)

conseguente riduzione del raccolto. Si ritiene, comunque, che l’azoto non modifichi la suscettibilità delle spighe di grano, piuttosto che l’effetto sia il risultato dell’aumento di densità della coltura e alterazione del microclima.

Le tecniche di lavorazione del terreno e di gestione delle stoppie condizionano fortemente lo sviluppo del FHB, soprattutto quando i residui colturali presenti nel terreno sono di grano o mais. Negli ultimi anni si sta sempre più diffondendo il

minimum tillage, cioè la lavorazione minima per la preparazione del letto di semina, al

fine di ridurre l’erosione del suolo. Di conseguenza i residui colturali non vengono rimossi, rappresentando un’importante fonte d’inoculo della malattia. E’ stato dimostrato sperimentalmente che il FHB è di minore intensità nei campi in cui viene eseguita la lavorazione convenzionale, mentre è superiore in caso di applicazione del

minimum tillage e del no-tillage (Dill-Macky, 2008).

La malattia è facilmente diagnosticabile osservando sintomi quali: riduzione del raccolto, perdita di colore della granella, che risulta anche striminzita, quindi diminuzione del peso dei semi e della loro qualità (Windels, 2000). Su grano alcune parti della spiga o addirittura l’intera spiga appaiono schiarite. Queste spighe biancastre sono molto numerose nelle varietà suscettibili.

Il fungo può infettare anche lo stelo immediatamente sotto la spiga, causandone un imbrunimento dei tessuti. Un ulteriore sintomo del FHB su frumento è rappresentato dalla comparsa di un ammasso di spore del fungo osservabili sulla spighetta infetta che presenta una colorazione lievemente arancione e talvolta anche le cariossidi possono sviluppare una colorazione rosa o rossa (Matarese et al., 2012).

Al fine di poter ostacolare la diffusione della malattia è di notevole importanza conoscerne l’epidemiologia. Nel caso in cui si applichino tecniche conservative di gestione del suolo, non vengono eliminati i residui della coltura precedente e su questi si sviluppa l’inoculo iniziale, che sopravvive o come micelio saprofita o sottoforma di clamidospore o periteci a seconda della specie, incrementando la capacità di infezione delle giovani piantine (Xu & Nicholson, 2009).

Successivamente, durante l’antesi e il primo periodo di sviluppo della cariosside, conidi e ascospore possono infettare la spiga, provocando il FHB.

Le colonie fungine svernano sui residui colturali di mais, grano o orzo e quindi una ridotta lavorazione può incrementare il livello dell’inoculo che sverna.

La maggior parte delle specie di Fusarium sono diffuse attraverso la dispersione dei conidi per effetto di venti o piogge. La produzione di conidi è fortemente influenzata

(6)

da temperatura e umidità. I conidi sono generalmente dispersi dagli schizzi d’acqua e quindi la distanza a cui possono essere trasportati risulta limitata; per esempio F.

culmorum ha un’altezza di dispersione massima di 60 cm (in condizioni di laboratorio).

Quindi solo una ridotta percentuale di conidi presenti sui residui colturali su suolo potrebbe raggiungere direttamente la parte apicale delle piante. Tuttavia è stato osservato che i conidi sono trasportati attraverso una serie successiva di passaggi verso il sito di infezione (Paul et al., 2004).

F. graminearum ha un potenziale vantaggio epidemiologico perché la forma

sessuata (Gibberella zeae) genera regolarmente periteci coinvolti nella produzione delle ascospore. Studi di laboratorio hanno dimostrato che lo sviluppo e la maturazione dei periteci di F. graminearum avvengono con un ciclo di 2 settimane. Tuttavia temperature al di sotto dei 3 °C sembrano inibirne la formazione. La produzione delle ascospore è favorita da elevata umidità; le temperature minime e ottimali per la produzione delle ascospore sono rispettivamente 7-10 °C e 15-20 °C e, spesso, la dispersione è legata ad eventi piovosi.

Oltre a conidi o ascospore sui residui colturali, i semi infettati da Fusarium potrebbero rappresentare un’ulteriore fonte di inoculo iniziale.

I processi di infezione e colonizzazione nelle spighe di grano e le reazioni da parte dei tessuti infetti sono essenzialmente gli stessi per F. culmorum, F. avenaceum, F.

graminearum e M. nivale (Kang et al., 2005; Kang et al., 2008; Kang & Buchenauer,

1999; Wanjiru et al., 2002).

In seguito all’inoculazione a metà fioritura, le spore germinano dopo 6-12 h su tutta la superficie dell’ospite con la quale sono a contatto. Il micelio che ne ha origine non infetta i tessuti dell’ospite immediatamente ma dà forza alle ife che crescono e si diramano sui tessuti dell’ospite. Il micelio si forma di solito sulla superficie interna di lemma e palea e sull’ovario 24-36 h dopo l’inoculazione, mentre la crescita ifale sulle superfici esterne è scarsa. La penetrazione dei tessuti dell’ospite si svolge principalmente attraverso le glumelle, e sulla parte superiore dell’ovario. Successivamente, il patogeno prosegue verso la rachilla e il nodo del rachide con crescita inter e intra-cellulare. Dal nodo del rachide, le ife si estendono attraverso i fasci vascolari e i tessuti corticali parenchimatici (Xu & Nicholson, 2009).

Durante la colonizzazione delle spighe del grano, si osserva la degenerazione del citoplasma e degli organelli delle cellule e la rottura delle cellule ospiti. La degradazione di cellulosa e pectine nella parete cellulare dell’ospite fa pensare che gli

(7)

agenti causali del FHB possano produrre enzimi che degradano la parete cellulare. Questi enzimi che degradano i polisaccaridi potrebbero essere importanti fattori di patogenicità, ad esempio, in F. graminearum nell’infezione delle spighe di frumento (Xu & Nicholson, 2009).

Il FHB compromette anche la sanità del raccolto a causa della produzione di tricoteceni da parte dei funghi patogeni del genere Fusarium ovvero metaboliti tossici (micotossine). Si ritiene, invece, che entrambe le specie del genere Microdochium causanti la malattia non siano in grado di produrre micotossine (Xu et al., 2008).

Più di 180 tricoteceni e loro derivati sono stati isolati e descritti (Desjardins, 2006). Si tratta di molecole sesquiterpeniche non volatili e a basso peso molecolare (Rocha et al., 2005). Presentano un gruppo epossidico in C-12 e C-13, che determina la loro tossicità (Desjardins et al., 1993).

La pericolosità di queste molecole è dovuta alla loro capacità di mantenersi stabili se sottoposti a calore e quindi non vengono degradate durante i processi di cottura del cibo o in autoclave (Rocha et al., 2005). I tricoteceni sono stabili anche a pH neutro o acido e di conseguenza, non sono idrolizzati nello stomaco dopo l’ingestione (Eriksen, 2003).

I suddetti metaboliti secondari sono suddivisi in 4 gruppi (tipi A-D) in base alle loro proprietà chimiche e alle specie fungine che li producono (Ueno et al., 1973).

I funghi del genere Fusarium producono tricoteceni di tipo A e di tipo B, che sono distinguibili in base alla presenza, rispettivamente, di un ossigeno o di un gruppo carbonilico in posizione C-8 (Rocha et al., 2005). I principali prodotti della via biosintetica dei tricoteceni sono la tossina T-2 e il Diacetossiscirpenolo (DAS) (tipo A) e il Deossinivalenolo (DON) e il Nivalenolo (NIV) (tipo B) (Rocha et al., 2005). Le specie di Fusarium che producono tricoteceni di tipo B possono essere suddivise in 2 chemotipi a seconda che siano coinvolte nella produzione di DON (o derivati acetilati) o NIV (Rocha et al., 2005).

Il DON è uno dei principali tricoteceni che si possono ritrovare su frumento ed è comunemente prodotto da diverse specie fitopatogene di Fusarium tra cui F.

graminearum e F. culmorum (Cooney et al., 2001; Rocha et al., 2005). Grano

contaminato con DON risulta spesso inutilizzabile per la produzione di farine o malto ed è tossico come mangime per animali non ruminanti (Windels, 2000; Xu & Nicholson, 2009).

(8)

Il DON spesso può essere rinvenuto sottoforma di derivati acetilati (3-ADON e 15-ADON) (Xu & Nicholson, 2009). Sebbene questi derivati siano meno tossici per i mammiferi rispetto al DON, sono fitotossici in ugual misura.

Il NIV è ritenuto essere, in alcuni casi, più tossico del DON e delle sue forme acetilate (Ryu et al., 1988). NIV e 4ANIV sono prodotti da alcuni isolati di F.

graminearum, F. culmorum e F. poae (Langseth, 1998).

Isolati di F. graminearum e F. culmorum sono in grado di produrre tricoteceni di differente tossicità: NIV o DON. E’ stato, infatti, identificato il gene Tri13 in grado di convertire DON in NIV, mentre il gene Tri7 trasforma il NIV in 4-ANIV. Questi risultati dimostrano che i geni Tri13 e Tri7 sono necessari per l’ossigenazione e l’acetilazione dell’ossigeno al C-4 durante la sintesi di NIV e 4-ANIV (Lee et al., 2002). Entrambi i geni non sono funzionali in tutti gli isolati di F. graminearum e F.

culmorum osservati che producono DON. Quindi i produttori di DON potrebbero essere

considerati come dei mutanti. Comunque, la predominanza del DON suggerisce che essi possano avere un vantaggio selettivo per l’infezione dei cereali, in particolare per il grano (Xu & Nicholson, 2009) e un ruolo biologico nella competizione con altri microrganismi (Sarrocco et al., 2012).

Proctor et al. (1995) hanno condotto un’analisi genetica sul ruolo dei tricoteceni nella virulenza di F. graminearum su grano e mais. L’esperimento ha previsto l’uso di isolati fungini con il gene Tri5 inattivato, il gene che codifica per la tricodiene sintasi. E’ stato osservato che i mutanti di F. graminearum con un gene Tri5 inattivato non sono in grado di produrre DON o qualsiasi tricotecene intermedio. In campo, i mutanti per il gene Tri5 sono meno virulenti rispetto ai ceppi progenitori produttori di tricoteceni. Studi successivi hanno dimostrato che il DON non è fondamentale per la patogenicità del fungo, ma agisce come fattore di virulenza su grano ovvero non è richiesto per provocare la malattia, ma quando prodotto aumenta la colonizzazione dell’ospite (Jansen et al., 2005).

I tricoteceni inibiscono la sintesi delle proteine, intaccando le normali funzioni cellulari (McLaughlin et al., 1977; Pestka & Smolinsky, 2005; Starkey et al. 2007; Ueno et al., 1973). Sono modulatori delle funzioni immunitarie dell’uomo e provocano effetti negativi sulla crescita (anoressia ed efficienza nutrizionale ridotta) e sulla riproduzione (dimensione ridotta della prole) (Pestka & Smolinsky, 2005).

(9)

1.2 Ecologia degli agenti patogeni

La distribuzione e la predominanza dei patogeni sono determinate dalle condizioni ambientali, in particolare da temperatura e umidità (Xu et al., 2008).

Al centro e nel Sud-Est Europeo, che rappresentano le regioni più calde del continente, la principale specie fungina associata al FHB è F. graminearum, così come negli USA (Windels, 2000, Xu et al., 2008), ma negli ultimi anni, F. culmorum, F.

avenaceum e F. poae stanno gradualmente incrementando la loro incidenza (Bottalico

& Perrone, 2002). Nelle regioni marittime più fredde del Nord-Ovest Europeo, le specie che comunemente provocano il FHB sono F. culmorum, F. avenaceum, M. nivale e M.

majus (Parry et al., 1995; Xu et al., 2008; Xu & Nicholson, 2009). Tuttavia, studi

recenti dimostrano un incremento dell’incidenza di F. graminearum nelle regioni più fredde (Waalwijk et al., 2003, Xu et al., 2008). Ciò sembra essere dovuto ad un aumento di produzione di mais in rotazione con grano (Logrieco et al., 2002).

1.2.1 Fusarium graminearum

F. graminearum, specie patogena associata al FHB, è una specie omotallica. Tale

specie è stata per lungo tempo definita F. graminearum Gruppo 2, per differenziarla dalla forma eterotallica morfologicamente simile, definita Gruppo 1. Pertanto è molto difficile differenziare morfologicamente i due gruppi, ma si possono riscontrare importanti differenze ecologiche e patologiche. Mentre gli isolati di entrambi i gruppi possono produrre sintomi di FHB su grano, solo gli isolati del Gruppo 1 sono in grado di causare i sintomi tipici del crown rot (Purss, 1971, Xu & Nicholson, 2009).

Il Gruppo 1 è stato identificato come F. pseudograminearum (Aoki & O’Donnell, 1999) e la sua forma teleomorfa è stata descritta come Gibberella coronicola (Aoki & O’Donnell, 1999, Xu & Nicholson, 2009). Gli isolati del Gruppo 2 appartengono alla specie F. graminearum la cui forma sessuata è Gibberella zeae.

Da un punto di vista pratico il modo più semplice per distinguere le due specie consiste nell’osservare la formazione di periteci da parte di isolati di singole spore purificati su CLA (Carnation Leaf Agar) o CA (Carrot Agar). Infatti utilizzando questo sistema si può osservare la formazione di periteci da parte di F. graminearum, in quanto

(10)

si tratta di una specie omotallica; al contrario, F. pseudograminearum, essendo una specie eterotallica, non può formare periteci.

L’impiego di tecniche molecolari ha permesso un’ulteriore differenziazione di F.

graminearum in 9 specie filogeneticamente distinte (O’Donnell et al., 2004). La specie

denominata F. graminearum è stata mantenuta per la linea 7, cioè quella associata al FHB negli Stati Uniti, in Europa e in Canada. Le altre specie sono: F.

austroamericanum Aoki, Kistler, Geiser & O’Donnell (linea 1); F. meridionale Aoki,

Kistler, Geiser & O’Donnell (linea 2); F. boothii O’Donnell, Aoki, Kistler & Geiser (linea 3); F. mesoamericanum Aoki, Kistler, Geiser & O’Donnell (linea 4); F.

acaciae-mearnsii O’Donnell, Aoki, Kistler & Geiser (linea 5); F. asiaticum O’Donnell, Aoki,

Kistler & Geiser (linea 6); F. cortaderiae O’Donnell, Aoki, Kistler & Geiser (linea 8);

F. brasilicum Aoki, Kistler, Geiser & O’Donnell.

Molti isolati formano periteci in natura e rilasciano ascospore che causano malattie sulle parti aeree delle piante. I periteci sono in grado di sopravvivere per più di 16 mesi su cariossidi di mais (Reis, 1990) o 23 mesi su paglia di grano (Pereyra et al., 2004). La temperatura ottimale per la formazione di periteci è di circa 29°C ed è più alta della temperatura massima a cui le ascospore vengono rilasciate, che si aggira intorno ai 26°C (Tschanz et al., 1976). L’infezione può essere causata sia dalle ascospore che dai macroconidi, mentre non si riscontra la formazione di microconidi.

F. gramineaurum è capace di produrre clamidospore nei macroconidi e nel

micelio, riuscendo a sopravvivere nei residui colturali, potendo, in tal modo, provocare nuovamente la malattia (Figura 1.1).

(11)

1.2.2 Fusarium culmorum

F. culmorum è un agente patogeno di notevole pericolosità, molto diffuso nel

nostro areale di coltivazione, in grado di causare il FHB. Risulta essere il principale agente patogeno di FHB su grano in Gran Bretagna (Jennings et al., 2004). Filogeneticamente è simile a F. graminearum (Mulè et al., 2004). Tuttavia le specie possono essere distinte sulla base dei metaboliti secondari prodotti. Infatti, come F.

graminearum, F. culmorum produce tricoteceni di tipo B ma solo due chemotipi sono

conosciuti in quest’ultima specie: NIV e 3 ADON (Jennings et al., 2004). La produzione di micotossine risulta maggiormente legata alla temperatura più che alla disponibilità di acqua (Llorens et al., 2004).

I macroconidi prodotti hanno una lunghezza inferiore rispetto a quelli di F.

graminearum. F. culmorum non è in grado di produrre microconidi e non è attualmente

nota la sua forma sessuata (Xu & Nicholson, 2009).

I residui colturali presenti sul suolo costituiscono un’importante fonte di inoculo di F. culmorum per le colture successive, in quanto il fungo è capace di produrre clamidospore (Xu & Nicholson, 2009). La temperatura ottimale richiesta per la diffusione del patogeno è leggermente inferiore rispetto a quella di F. graminearum. I conidi vengono trasportati fino alla parte apicale della pianta per mezzo degli schizzi d’acqua (Paul et al., 2004). Questo tipo di dispersione è fondamentale per F. culmorum, che altrimenti non sarebbe in grado di produrre i medesimi effetti dannosi (Snijders, 1990).

E’ stato dimostrato che livelli subletali di fungicidi possono incrementare la produzione di micotossine da parte di F. culmorum, mentre alte concentrazioni di fungicida inibiscono la produzione di tricoteceni (Covarelli et al., 2004).

F. culmorum è ritenuto responsabile di malattie alla pelle nell’uomo (Snijders et al., 1996). Inoltre, sia gli animali da allevamento, come polli e maiali, sia quelli usati

negli esperimenti (ad esempio topi e conigli), sono sensibili alle micotossine prodotte del fungo, ma non tutte sono state ancora identificate.

(12)

1.3 Controllo biologico del FHB

Le avversità che possono interessare i prodotti agricoli devono essere contenute al fine di garantire la produzione attesa dall’agricoltore e la relativa remunerazione, e l’immissione sul mercato di prodotti che non siano nocivi per la salute del consumatore.

Per il controllo delle malattie delle piante possono essere utilizzati diversi sistemi di lotta. Tra questi il sistema maggiormente impiegato prevede l’utilizzo di prodotti chimici, che però possono determinare conseguenze ambientali negative e produrre effetti indesiderati su altri organismi non patogeni, oltre al rischio di selezionare popolazioni resistenti di parassiti. Si stima che la popolazione mondiale raggiungerà i 9 miliardi di individui a metà del secolo corrente, per cui sarà necessario incrementare la produzione di cibo. Ciò deve essere ottenuto producendo più cibo nella stessa area, riducendo l’impatto ambientale (Godfray et al. 2010).

L’efficacia di metodi chimici per il controllo del FHB e della contaminazione da micotossine su grano è stata dimostrata essere inconsistente (Paul et al., 2007). Infatti è sempre più comune lo sviluppo di forme di resistenza all’applicazione dei fungicidi in molti funghi patogeni. Inoltre l’utilizzo di sistemi chimici può causare perdite nella qualità dei prodotti agricoli trattati. Per tali ragioni, si rende necessario l’impiego di altri sistemi in grado di garantire un maggior successo nella lotta agli agenti patogeni.

A tale scopo alcuni microrganismi possono giocare un ruolo importante, venendo impiegati come agenti di biocontrollo. Infatti il controllo biologico utilizzato come unico metodo di lotta o all’interno di un sistema di lotta integrata, appare essere la strategia vincente per il futuro, al fine di sviluppare un’agricoltura tesa al rispetto della natura e dell’uomo.

Il termine biocontrollo, in patologia vegetale, si riferisce all’uso di antagonisti microbici per ridurre la malattia e la diffusione del patogeno. L’organismo che è in grado di ostacolare la diffusione del patogeno è noto come agente di biocontrollo.

Le strategie di controllo biologico dei patogeni delle piante possono essere raggruppate in tre categorie sulla base del sistema impiegato o dell’effetto prodotto: a) riduzione dell’inoculo del patogeno da parte dell’antagonista; b) protezione della pianta ospite con un antagonista del patogeno; c) impiego di isolati non virulenti del patogeno. Un microrganismo antagonista può agire in qualità di agente di biocontrollo mediante uno o più meccanismi di azione. Comunque, i meccanismi di azione di alcuni agenti di biocontrollo sono ancora sconosciuti.

(13)

Tra gli agenti di biocontrollo alcuni isolati fungini a carattere saprofita hanno riscosso un notevole successo per i loro effetti positivi prodotti. Questi ultimi sono organismi benefici che riducono gli effetti negativi provocati dal patogeno sulla pianta e producono risposte positive sulla pianta stessa (Shoresh et al., 2010).

Uno dei meccanismi di azione dei potenziali agenti di lotta biologica si basa sul micoparassitismo. Si tratta di un processo complesso che comprende una sequenza di eventi, cioè riconoscimento, attacco e successiva penetrazione e uccisione dell’ospite. Questi eventi si verificano in seguito alla produzione di chitinasi e altri enzimi degradatori e cambiamenti morfologici, come la formazione di coilings, che servono a penetrare le ife dell’ospite e contengono alte concentrazioni di soluti osmotici come il glicerolo (McIntyre et al., 2004).

L’antagonismo microbico si può realizzare anche mediante altri meccanismi quali la competizione, l’antibiosi e l’induzione di resistenza. La competizione si ha quando due specie viventi consumano la stessa risorsa che è presente in quantità limitata. Si può verificare competizione per lo spazio, per le sostanze nutritive, per l’ossigeno, etc. L’antagonista dimostra la capacità di adattarsi molto bene all’ambiente e di colonizzare rapidamente un substrato che viene così sottratto al patogeno. Sono stati eseguiti numerosi studi in vitro e in vivo sulle capacità di colonizzazione di un substrato da parte di antagonisti, e si è visto che il loro rapido sviluppo su tale substrato rende difficile una successiva colonizzazione di esso da parte dei patogeni.

L’antibiosi si ha quando un microrganismo produce una o più sostanze tossiche che inibiscono lo sviluppo e provocano la morte di altre forme di vita nelle immediate vicinanze dell’organismo che le produce. Nel caso dei funghi è l’antagonista a produrre queste sostanze tossiche ed è il patogeno a subirne gli effetti negativi.

Infine, la resistenza ai patogeni può essere indotta da microrganismi associati alla pianta che colonizzandone l’apparato radicale come endofiti, scatenano una cascata di risposte nella pianta che si traduce nell’espressione di geni associati alla resistenza nei confronti dei patogeni.

Esperimenti di controllo biologico nei confronti del FHB hanno dimostrato che un ceppo di Fusarium equiseti è risultato essere particolarmente efficace nel controllo della malattia e nel ridurre la produzione di DON su frumento (Dawson et al., 2004). Lieviti appartenenti al genere Cryptococcus sono anche molto efficaci contro FHB su frumento duro in campo (Khan et al., 2001). Risultati di notevole importanza sono stati ottenuti impiegando isolati appartenenti al genere Trichoderma (Matarese et al., 2012). In

(14)

particolare, due isolati di Trichoderma gamsii e uno di Trichoderma velutinum sono risultati capaci di inibire sia la crescita del fungo che la produzione di DON. T. gamsii è morfologicamente simile a Trichoderma viride, una specie che racchiude diversi isolati ad attività antagonista.

Oltre ai suddetti generi ad attività antagonista risulta di notevole interesse la valutazione di isolati di Fusarium oxysporum, che è considerata una tra le specie saprotrofiche più competitive per i residui colturali, fonte di inoculo per F.

graminearum e F. culmorum, che quindi può risultare essere un valido agente di

biocontrollo nei confronti del FHB.

In ogni caso, il successo di un metodo di controllo nell’applicazione in campo è subordinato ad una serie di variabili ambientali, quali temperatura, umidità e disponibilità di nutrienti, difficilmente riproducibili in laboratorio.

1.4 Trichoderma spp.

I funghi del genere Trichoderma sono normalmente classificati come funghi imperfetti, in ragione del fatto che non è nota la forma sessuata nella maggior parte delle specie. La loro forma perfetta è rara ed appartiene al genere Hypocrea (ordine

Hypocreales, divisione Ascomycota).

Questo genere ha dimostrato un’elevata efficacia di azione antagonista nei confronti di molti funghi patogeni e per questo viene utilizzato come agente di lotta biologica.

Trichoderma spp. è largamente distribuito in tutte le aree geografiche: diverse

specie sono abbondanti in tutti i tipi di suolo, soprattutto quelli ricchi di sostanza organica e tipici di zone a clima fresco o umido. La loro attività antagonista è stata dimostrata sia in vitro che in vivo. Ad esempio, nei confronti del FHB, la loro efficacia in qualità di agenti di biocontrollo è stata verificata sia in condizioni di pieno campo sia in colture protette (Perrotto et al, 2013; Sarrocco et al., 2013).

Il successo dell’utilizzo di Trichoderma spp. tra i sistemi di biocontrollo è imputabile ad una forte capacità competitiva, dovuta a diversi fattori, come la capacità di trarre carbonio e azoto da diversi substrati, alcuni dei quali non utilizzabili da altri

(15)

funghi, la rapidità di sviluppo, l’adattabilità ad un ampio range di temperature, la forte attività saprofitaria, l’enorme produzione di conidi.

Trichoderma spp. agisce utilizzando tutti i meccanismi d’azione. Per quanto

riguarda il micoparassitismo e la produzione di enzimi litici, è stato osservato che le ife del patogeno, quando vengono circondate da quelle di Trichoderma spp., vanno incontro a una forte vacuolizzazione, collassano e si disintegrano. La lisi della parete cellulare dell’ospite è dovuta alla produzione di glucanasi, chitinasi e cellulasi. Questi enzimi agiscono attaccando i polisaccaridi, la chitina e i glucani che sono responsabili della rigidità della parete cellulare del fungo, distruggendone così l’integrità (Howell, 2003).

Il meccanismo d’azione è articolato in fasi successive: inizialmente le ife di

Trichoderma hanno un accrescimento chemiotropico verso quelle del patogeno,

probabilmente per effetto di essudati prodotti dall’ospite; successivamente avviene il contatto ifale tra i due funghi, mediato da meccanismi di riconoscimento specifici; molto spesso l’antagonista sviluppa degli appressori che gli permettono di aderire meglio all’ifa del patogeno; infine le ife di Trichoderma si avvolgono attorno a quelle del patogeno, con formazione di coilings, determinandone la morte.

Diversi studi in vitro hanno rilevato che, ad esempio, T. viride e Trichoderma

harzianum, producono sostanze volatili e non volatili capaci di inibire lo sviluppo

miceliare di importanti patogeni appartenenti ai generi Rhizoctonia e Fusarium.

Infine è nota la capacità di isolati di Trichoderma di agire come induttori di resistenza, il che ha portato alla definizione di questi funghi come microrganismi benefici (Harman et al., 2010).

Per quanto concerne la lotta al FHB, una specie di Trichoderma si è rivelata particolarmente efficace nel controllo di F. graminearum e F. culmorum. Si tratta di

Trichoderma gamsii, nello specifico l’isolato 6085, che è in grado di contenere lo

sviluppo dei suddetti agenti patogeni di FHB e la produzione di DON (Matarese, 2012).

1.4.1 Trichoderma gamsii 6085

T. gamsii 6085 è noto per il suo ruolo di antagonista, micoparassita e competitore

(16)

et al., 2013). Questo isolato è anche capace di ridurre significativamente la produzione

di DON da parte dei patogeni sopra citati (Matarese, 2012). Nel corso di una prova sperimentale l’efficacia di questo isolato di T. gamsii come agente di biocontrollo è stata testata in pieno campo per due stagioni di crescita ed è stata osservata una riduzione del 57% della severità della malattia in caso di applicazione sulle spighe in fase di antesi (Sarrocco et al., 2013).

Studi di interazione a livello molecolare tra T. gamsii, F. graminearum e F.

culmorum hanno mostrato il coinvolgimento di numerose chitinasi, appartenenti ai

diversi sub-gruppi, nell’attività micoparassitaria nei confronti dei due patogeni. Inoltre, fattore non di secondaria importanza, l’isolato 6085 è in grado di crescere in presenza di elevate dosi di DON (50 ppm, oltre le dosi comunemente ritrovate in natura), caratteristica non frequentemente diffusa all’interno del genere Trichoderma. Non sono, ad oggi, tuttavia chiari i meccanismi che conferiscono al fungo questa capacità. E’ stata esclusa la capacità di degradare la micotossina o di modificarne la struttura. L’ipotesi più verosimile, in corso di conferma, vedrebbe il coinvolgimento dei trasportatori ABC e dei MFS (Major Facilitator Superfamily) nella resistenza al DON (Matarese et al., 2012; Sarrocco et al., 2013).

Il genoma dell’isolato 6085 è disponibile ed è attualmente in corso di annotazione presso il laboratorio di Micologia Fitopatologica del DISAAA-a; questo consentirà una maggiore e più approfondita conoscenza dei meccanismi d’azione che rendono questo isolato potenzialmente utilizzabile come agente di lotta biologica per il controllo della

fusariosi del frumento.

Questi risultati suscitano particolare interesse nel valutare ulteriori potenzialità di

T. gamsii 6085 come agente di biocontrollo, studiando il suo ruolo in un approccio

multitrofico con altre specie fungine potenzialmente efficaci nella lotta al FHB.

1.5 Fusarium oxysporum

F. oxysporum Schlechtendahl emend. Snyder & Hansen è stato descritto per la

prima volta dal botanico tedesco D.F.L. von Schlechtendahl nel 1824. E’ la specie del genere Fusarium più diffusa e ubiquitaria, dal momento che riesce ad adattarsi a diverse condizioni climatiche, e può avere sia caratteristiche fitopatogene sia saprofitiche.

(17)

Isolati in colture di questa specie presentano un’alta variabilità morfologica. Su PDA producono un micelio che può assumere colorazioni diverse a seconda del ceppo preso in esame. I macroconidi prodotti sono di media lunghezza, leggermente curvi e presentano generalmente tre setti. Molti isolati producono abbondanti clamidospore e microconidi ovali o reniformi.

F. oxysporum è specie molto rilevante dal punto di vista economico in ambito

agricolo, dato l’ampio spettro di ospiti vegetali che è in grado di attaccare e le ingenti perdite che può causare quando infetta una pianta a seguito dello sviluppo della malattia nota come tracheomicosi o tracheofusariosi.

Tuttavia questa specie di Fusarium, oltre che essere rinomata per i suoi effetti dannosi in agricoltura, è anche un saprofita ubiquitario ed è stato isolato sia da radici che da semi di una larga varietà di piante (Leslie et al., 1990).

Sebbene sia stato sporadicamente isolato da cariossidi di cereali, si è dimostrato non patogeno nei confronti del frumento in test di virulenza sotto condizioni controllate. Tuttavia non è stato associato alla fusariosi della spiga di orzo, mais, avena, segale o frumento (Bottalico & Perrone, 2002; Logrieco et al., 2002; Parry et al.,1995).

E’ stata descritta la capacità di alcuni isolati di F. oxysporum di produrre zearalenone e altre micotossine appartenenti alla classe dei tricoteceni (Marasas et al., 1984), ma la maggior parte dei ceppi di F. oxysporum manca del gene tri5 necessario per la produzione dei tricoteceni (Tan & Niessen, 2003).

Tuttavia, a discapito del potenziale micotossigeno di cui dispone, F. oxysporum appare essere di minore interesse dal punto di vista patologico rispetto ad altre specie del suo genere perché non viene generalmente associato a mais, frumento o altri cereali (Desjardins, 2006).

Isolati non patogeni di F. oxysporum sono spesso stati proposti per un utilizzo in programmi di lotta biologica. Infatti, in molti casi i ceppi di F. oxysporum si comportano come micoparassiti e sono ottimi competitori (Benhamou et al., 2002; Weideman e Wehner, 1993). F. oxysporum è un efficace colonizzatore dei residui di paglia parzialmente decomposta ed è stato dimostrato avere una maggiore capacità saprofitica rispetto ai comuni agenti causali del FHB (Pereyra et al., 2004).

Queste ragioni stimolano l’approfondimento degli studi relativi a ceppi non patogeni di F. oxysporum che, date le sue caratteristiche, potrebbe rivelarsi un efficace agente di biocontrollo anche per la fusariosi della spiga di frumento.

(18)

2. SCOPO DEL LAVORO

L’attività sperimentale condotta al fine di poter realizzare il presente elaborato è stata svolta presso i laboratori di Micologia Fitopatologica del Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari ed Agro-ambientali dell’Università di Pisa.

Scopo del lavoro è stato quello di individuare uno o più isolati di F. oxysporum in grado di agire come agenti di lotta biologica nei confronti di F. graminearum e F.

culmorum, agenti causali della fusariosi del frumento (Fusarium Head Blight – FHB),

da soli o in combinazione con l’isolato Trichoderma gamsii 6085, in un approccio di tipo multitrofico. Tale specie fungina, che presenta alcuni ceppi saprotrofi, è ritenuta tra le più efficaci nel contrastare lo sviluppo di patogeni sui residui colturali e per tale ragione presumibilmente in grado di ricoprire il ruolo di agente di biocontrollo del FHB.

Gli isolati di F. oxysporum sono stati scelti all’interno di un ampio gruppo comprendente ceppi in grado o non capaci di crescere in presenza della micotossina Deossinivalenolo (DON) e appartenenti a diversi gruppi filogenetici, sulla base del profilo AFLP e tef e selezionati per le seguenti capacità:

-antagonismo ed inibizione della crescita -micoparassitismo

-niche overlapping

-capacità saprofitica competitiva

(19)

3. MATERIALI E METODI

3.1 Isolati fungini

Le indagini condotte nella presente tesi sono state effettuate utilizzando 21 isolati di Fusarium oxysporum (Tabella 3.1) appartenenti ad una più ampia popolazione composta da ceppi provenienti da residui colturali di frumento, trattati e non trattati con DON (Sarrocco et al., 2012) e filogenicamente raggruppati sulla base dei profili AFLP e tef (Rossi, 2008). In aggiunta, nel presente lavoro è stato utilizzato un isolato di

Trichoderma gamsii (T6085) già oggetto di studio grazie all’azione inibitoria nei

confronti di F. graminearum e F. culmorum (Matarese et al., 2012) e alla capacità di contenimento dello sviluppo del FHB in campo (Sarrocco et al., 2013). In aggiunta sono stati usati i funghi patogeni Fusarium graminearum 124 e Fusarium culmorum 627, gentilmente forniti dal ISPA-CNR di Bari, entrambi agenti causali del Fusarium Head Blight (FHB) su grano e cereali minori e capaci di produrre DON (Sarrocco et al., 2013).

I suddetti isolati sono depositati presso la collezione fungina del Laboratorio di Micologia Fitopatologica, Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-ambientali dell’Università di Pisa.

Tutti gli isolati sono mantenuti su Potato Dextrose Agar (PDA) sotto olio alla temperatura di 4°C.

Tabella 3.1.Classificazione filogenetica (AFLP e tef) e capacità di crescere su DON (+ / -) dei 21 ceppi di Fusarium oxysporum utilizzati nel presente lavoro.

GRUPPO I GRUPPO II GRUPPO III GRUPPO IV

II α II β III α III β 7105 (+) 7007 (+) 7132 (+) 7013 (-) 7015 (+) 7119 (+) 7146 (+) 7165 (+) 7968 (+) 7028 (+) 7143 (+) 7128 (+) 7160 (+) 7184 (+) 7121 (+) 8715 (-) 7131 (+) 7147 (+) 7135 (+) 7181 (-) 7137 (-)

(20)

3.2 Prova di inibizione in vitro

I 21 ceppi di F. oxysporum sono stati testati in vitro al fine di valutare la loro capacità antagonista nei confronti di F. culmorum 627 e F. graminearum 124 e la loro interazione con T. gamsii 6085, in vista di un possibile impiego combinato nella lotta al FHB. Per la prova d’inibizione condotta con F. culmorum 627 e F. graminearum 124 è stato utilizzato come substrato di crescita OA (Oatmeal Agar, Difco, 72 gL-1) in quanto si è osservata una migliore crescita del patogeno rispetto a quanto si verifica con l’uso di PDA, su cui si riscontra la formazione di setti.

Per la prova con T. gamsii 6085 è stato impiegato il PDA come substrato di crescita.

Dischetti di micelio del diametro di 8 mm, praticati da piastre di PDA o OA contenenti F. culmorum, F. graminearum, T. gamsii e i 21 ceppi di F. oxysporum in attivo accrescimento, sono stati prelevati ed utilizzati per inoculare le piastre delle colture duali. In particolare i suddetti dischetti sono stati posti su piastre da 90 mm di diametro ad una distanza reciproca di 45 mm. Per ogni combinazione F. oxysporum vs

F. graminearum, F. oxysporum vs F. culmorum o F. oxysporum vs T. gamsii sono state

allestite tre repliche.

Le piastre sono state incubate a 24 °C con alternanza luce/buio di 12h fino al momento in cui i funghi raggiungevano il bordo della piastra o i miceli venivano a contatto. Sono stati misurati il raggio controllo e il raggio verso l’altro fungo per entrambi gli isolati presenti su piastra (Figura 3.1), prendendo due misure al giorno. I valori ottenuti sono stati utilizzati per creare le curve di crescita (con l’ausilio del software Sigmaplot 11.0).

Le curve (“controllo” e “verso l’altro fungo”) ottenute sono state confrontate mediante analisi della varianza della regressione al fine di confrontare le P slope e le P

elevation delle curve, assumendo P<0.05 come valore significativo (utilizzando il

software GraphPad Prism 5).

Al fine di verificarne la capacità micoparassitaria, i 21 ceppi di F. oxysporum sono stati anche testati contro i patogeni e contro T. gamsii 6085 ponendo i dischetti di micelio di 8 mm di diametro su cellophane sterile posto su WA (Water Agar, agar 15 gL-1), incubando le piastre a 24 °C con alternanza luce/buio di 12h, al fine di verificare, con l’utilizzo del microscopio ottico, la presenza di coilings. Anche per questa prova sono state allestite tre repliche.

(21)

Figura 3.1. Schema di inoculo e misurazione per la prova di inibizione in vitro . F1: F. oxysporum,

F2: F. graminearum o F. culmorum o T. gamsii 6085; Rc: Raggio controllo; RF2: Raggio verso la colonia del fungo F2; RF1: raggio verso la colonia di F. oxysporum (F1).

(22)

3.3 Valutazione della capacità di accrescimento degli isolati fungini

Sulla base dei risultati ottenuti dalla prova di inibizione in vitro e considerando la differenza di velocità nella crescita sono stati selezionati 6 ceppi di F. oxysporum al fine di valutarne la capacità germinativa delle spore e la velocità di accrescimento e confrontarla con quella di F. culmorum, F. graminearum e T. gamsii 6085.

Da piastre di PDA su cui erano presenti in attivo accrescimento T. gamsii 6085 e i ceppi di F. oxysporum e da OA per F. culmorum e F. graminearum, sono state preparate le sospensioni di spore in Potato Dextrose Broth (PDB , Difco, 24 gL-1) alla concentrazione 106 spore mL-1.

La sospensione di spore è stata inoculata in piastre multipozzetto MICROWELL a 96 pozzetti, ponendone in ciascun pozzetto 150 µL. In particolare ogni ceppo di F.

oxysporum è stato inoculato in 6 pozzetti, così come ciascuno dei funghi patogeni e T. gamsii 6085, mentre la fila dei pozzetti centrali e quella dei terminali della piastra sono

stati utilizzati per il controllo inoculando PDB (Figura 3.2). Per questa prova sono state realizzate 2 repliche tecniche.

Le piastre sono state poste in camera di crescita a 24 °C con alternanza luce/buio di 12h.

Utilizzando il lettore di piastre BIORAD sono state rilevate 4 misure giornaliere (a distanza di 4 ore, 12 ore di intervallo per la notte) per verificare la variazione di densità ottica alla lunghezza d’onda di 595 nm. La prova è stata condotta per 96 ore, cioè fino al momento in cui la densità ottica dei pozzetti manteneva un valore pressoché costante.

I dati ottenuti sono stati elaborati per creare le curve di crescita con l’utilizzo del software Sigmaplot 11.0. Le curve derivate sono state sottoposte all’analisi della varianza della regressione, al fine di valutare le differenze (P slope e le P elevation) tra i potenziali antagonisti (F. oxysporum e T. gamsii) e i due patogeni, mediante l’impiego del software GraphPad Prism 5, assumendo come valore significativo P<0.05.

(23)

Figura 3.2. Schema di inoculo di una piastra a 96 pozzetti per la valutazione della crescita degli isolati

fungini in PDB.

3.4 Valutazione del NOI (Niche Overlapping Index) dei patogeni e dei funghi antagonisti attraverso la capacità di crescita su diverse fonti di carbonio (Sistema Biolog)

Al fine di valutare la capacità di competizione per diversi substrati attraverso

l’indice di sovrapposizione delle nicchie (NOI), nel presente elaborato è stata valutata la

capacità di crescita di F. graminearum, F. culmorum, F. oxysporum 7121 (che ha fornito i risultati migliori nelle prove precedenti tra tutti i ceppi di F. oxysporum saggiati) e T. gamsii 6085 in 96 substrati diversi contenuti all’interno di FF microplate (BIOLOG).

Il sistema BIOLOG si basa sulla variazione delle densità ottiche corrispondenti ai 96 pozzetti della piastra (FF microplateTM), rilevabili mediante l’apposito lettore di piastre, cui corrisponde un accrescimento del fungo dovuto all’utilizzo della fonte di carbonio presente nel pozzetto. In Figura 3.3 sono riportati i substrati contenuti nelle piastre FF microplate.

(24)

Figura 3.3. Fonti di carbonio in una FF microplateTM (BIOLOG).

Le piastre sono state inoculate con una sospensione di spore preparata in acqua sterile da colture in attivo accrescimento su PDA e corretta alla concentrazione di 106 spore mL-1. 100 µL di sospensione sono stati inoculati in ogni pozzetto della piastra, sulla base di quanto indicato dal protocollo fornito dall’azienda produttrice delle piastre, riempiendo interamente 4 piastre (una per ogni specie fungina) per ciascuna replica, allestendo 3 repliche biologiche ovvero per ogni replica sono state preparate sospensioni di spore differenti.

Le piastre sono state incubate in camera di crescita a 24°C con alternanza luce/buio di 12 ore. Utilizzando il lettore di piastre BIORAD sono state effettuate 4 letture giornaliere alla lunghezza d’onda di 595 nm, al fine di valutare la velocità di crescita sulle diverse fonti di carbonio. La prova è stata condotta per 96 ore dall’inoculazione e i valori di densità ottica ottenuti per ciascun substrato sono stati sottoposti a trasformazione in Logit e quindi utilizzati per creare le curve di crescita su

(25)

ciascuno dei 96 substrati. Per ciascun fungo, le rette relative ad ognuna delle 95 risorse di carbonio sono state confrontate, mediante analisi della varianza della regressione, con quella relativa all’acqua al fine di valutare se le diverse fonti di carbonio fossero utilizzate da ciascun isolato. Questo ha permesso di individuare quali substrati erano utilizzati, cioè quelli che non mostravano differenze statisticamente significative nel valore della Pslope rispetto all’acqua. Le curve di accrescimento sui substrati metabolizzati sono state, quindi, utilizzate al fine del calcolo del NOI (Niche Overlapping Index) tra due isolati, applicando la seguente formula:

n. di fonti di carbonio utilizzate nello stesso modo da due isolati a confronto NOI =

n. di fonti di carbonio utilizzate da uno dei due isolati

Per ottenere l’informazione necessaria al numeratore, per ciascun substrato utilizzato, le curve di crescita sono state sottoposte ad analisi della varianza della regressione tra i due isolati via via confrontati, assumendo una P slope<0.05 come significativa. La suddetta analisi è stata condotta mediante l’utilizzo del software GraphPad Prism 5.

(26)

3.5 Valutazione della capacità saprofitica competitiva su suolo e paglia

Al fine di riprodurre in vitro una condizione simile a quella che si verifica in natura, 7 beute del volume di 250 mL sono state riempite con 200 g di terreno tendenzialmente sabbioso prelevato in uno dei campi del Centro di Ricerca Agro-Ambientale “Enrico Avanzi”, con 30 pezzi di paglia di Triticum durum (grano duro) della lunghezza di 3 cm con un nodo centrale e addizionati di 13 mL di acqua distillata sterile. Le beute sono state poste in autoclave per 30 min a 121 °C (due cicli di sterilizzazione) e successivamente inoculate con le sospensioni di spore di F.

graminearum 124, T. gamsii 6085 e F. oxysporum 7121 alla concentrazione di 104

conidi g-1 di terreno.

La prova ha previsto l’allestimento di 8 tesi, ciascuna con 3 repliche biologiche. Le 8 tesi sviluppate sono le seguenti:

F. graminearum 124 (Fg) T. gamsii 6085 (T6085) F. oxysporum 7121 (Fox)

F. graminearum 124 vs F. oxysporum 7121 (Fg + Fox) T. gamsii 6085 vs F. oxysporum 7121 (T6085 + Fox) T. gamsii 6085 vs F. graminearum 124 (T6085 + Fg)

F. graminearum 124 vs T. gamsii 6085 vs F. oxysporum 7121 (Fg + T6085+ Fox)

Controllo non inoculato (Ck)

Le beute sono state poste in camera di crescita a 24°C con alternanza luce/buio di 12h per 28 giorni.

Trascorsi i 28 giorni le beute sono state svuotate del loro contenuto e sono stati prelevati i pezzetti di paglia, che sono stati sciacquati sotto acqua corrente per eliminare il terreno presente su di essi. In seguito i pezzetti di paglia sono stati sterilizzati in una soluzione contenente etanolo (50%), ipoclorito di sodio (1% di Cloro attivo) e acqua per 5 minuti e tre successivi lavaggi in acqua sterile da 5 minuti ciascuno e infine asciugati.

Dei 30 pezzetti di paglia presenti in ciascuna beuta, 10 sono stati posti in un contenitore sterile e conservati a -80°C per successive analisi. I restanti 20 pezzi sono

(27)

stati trattati diversamente a seconda che la tesi presa in considerazione fosse l’inoculo singolo o un coinoculo di più specie.

In particolare, i pezzetti prelevati dalle beute con singolo inoculo e dal controllo sono stati tagliati a metà longitudinalmente. Una metà è stata conservata a -80°C per successive analisi, mentre l’altra metà è stata tagliata in 5 parti e posta su piastre contenenti i terreni selettivi o semi-selettivi per ciascun isolato.

Nel caso del coinoculo, i pezzetti di paglia tagliati longitudinalmente a metà sono stati a loro volta tagliati in 5 pezzi e posti su due piastre contenenti substrati di crescita differenti al fine di favorire o meno la crescita di uno dei funghi del coinoculo (sia con due che con tre funghi presi in esame).

Per inoculare la paglia contenuta nella beuta Ck e quella in cui è stata inoculata la sospensione di F. graminearum, è stato utilizzato come substrato di crescita OA, che si è dimostrato il miglior substrato di crescita per tutti i funghi presi in esame, anche se non selettivo, ma che consentiva la distinzione dei singoli funghi su base morfologica. Lo stesso substrato è stato anche utilizzato per il coinoculo Fg + Fox; questa tesi è stata inoculata anche su piastre contenenti come mezzo di crescita K (Komada: K2HPO4 1.0

gL-1, KCl 0.5 gL-1, MgSO4 · 7H2O 0.5 gL-1, FeNa-EDTA 0.01 gL-1, L-asparagina 2.0

gL-1, D-Galattosio 20.0 gL-1, Agar 30.0 gL-1, PCNB 1.0 gL-1, Oxgal 0.5 gL-1, Na2B4O ·

10H2O 1.0 gL-1, Streptomicina 0.3 gL-1), mezzo selettivo per Fusarium. Su OA è stata

anche inoculata la tesi T6085 + Fg. Su Komada sono state poste anche le altre tesi contenenti F. oxysporum (Fox, T6085 + Fox, Fg + T6085 + Fox). Le tesi in cui è stata inoculata la sospensione di T. gamsii 6085 (T6085, T6085 + Fox, T6085 + Fg, Fg +

T6085 + Fox) sono state poste anche su piastre contenenti P190 (PDA 42.0 gL-1,

Streptomicina 0.05 gL-1, Bacitracina 0.1 gL-1, Hymexazolo 0.3 gL-1) terreno selettivo per il genere Trichoderma.

(28)

4. RISULTATI

4.1 Prova di inibizione in vitro

La prova di inibizione in vitro ha permesso di valutare la crescita miceliare dei patogeni F. graminearum 124 (Figura 4.1a) e F. culmorum 627 (Figura 4.1b) e dell’isolato benefico T. gamsii 6085 (Figura 4.1c) in presenza dei 21 isolati di F.

oxysporum.

Quando i dati della crescita (raggio verso l’antagonista/patogeno e raggio controllo) sono stati utilizzati per l’analisi della regressione, tutte le curve di crescita sono risultate altamente significative (R2>0.8513 e P<0.0001).

L’analisi della varianza della regressione ha permesso, attraverso il confronto tra rette, di verificare eventuali effetti di inibizione della crescita dei funghi quando allevati in colture duali. In particolare, quando i 21 isolati di F. oxysporum sono stati fatti crescere in presenza di F. graminearum (Tabella 4.1) non sono stati osservati valori statisticamente significativi nella P slope (P>0.24).

(29)

Tabella 4.1. Analisi della varianza della regressione delle curve di crescita di F. graminearum 124 e degli

isolati di F. oxysporum in culture duali su PDA. Fg ctrl: Rc di F. graminearum; Fg F1: RF1 di F.

graminearum; Fox ctrl: Rc di F. oxysporum; Fox F2: RF2 di F. oxysporum; P: significatività della retta di

regressione; P slope: significatività della differenza tra le slope delle rette (ctrl vs F1/F2); P elevation: significatività della differenza delle elevations tra le rette(ctrl vs F1/F2).

Slope R2 P P slope P elevation F.g. ctrl 0.4122 ± 0.0133 0.987 < 0.0001 F.g. F1 0.4018 ± 0.0134 0.986 < 0.0001 0.5862 0.07183 Fox ctrl 0.2179 ± 0.0145 0.945 < 0.0001 F o x 7 0 0 7 Fox F2 0.2188 ± 0.0135 0.952 < 0.0001 0.9639 0.694

(30)

(31)

Nelle colture duali di F. oxysporum con F. culmorum non sono state osservate, in seguito al confronto mediante analisi della varianza della regressione, differenze statisticamente significative tra le rette di crescita derivanti dai raggi controllo e quelli nella direzione dell’altro fungo, come mostrato dai valori di P slope che sono risultati tutti ≥0.18 (Tabella 2).

A titolo esemplificativo in Figura 4.2, sono riportate le curve di crescita di F.

oxysporum 7119 vs F. graminearum (Figura 4.2a) e di F. oxysporum 7119 vs F. culmorum (Figura 4.2b), e F. oxysporum 7121 vs F. graminearum (Figura 4.2c) e di F. oxysporum 7121 vs F. culmorum (Figura 4.2d).

(32)

Figura 4.1b. Crescita miceliare di F. culmorum 627 e F. oxysporum 7121 in coltura duale su OA

Tabella 4.2. Analisi della varianza della regressione delle curve di crescita di F. culmorum 124 e degli

isolati di F. oxysporum in culture duali su PDA. Fc ctrl: Rc di F. culmorum; Fc F1: RF1 di F. culmorum; Fox ctrl: Rc di F. oxysporum; Fox F2: RF2 di F. oxysporum; P: significatività della retta di regressione; P

slope: significatività della differenza tra le slope delle rette (ctrl vs F1/F2); P elevation: significatività

della differenza delle elevations tra le rette (ctrl vs F1/F2).

Slope R2 P P slope P elevation F.c. ctrl 0.3991 ± 0.0147 0.983 < 0.0001 F.c. F1 0.3986 ± 0.0198 0.969 < 0.0001 0.98 0.34 Fox ctrl 0.2340 ± 0.0109 0.972 < 0.0001 F o x 7 0 0 7 Fox F2 0.2408 ± 0.0115 0.971 < 0.0001 0.67 0.62

(33)

(34)

(35)

Quando i 21 isolati di F. oxysporum sono stati fatti crescere in colture duali con l’isolato T. gamsii 6085, non sono stati osservati effetti di inibizione della crescita in nessuno dei funghi saggiati, come evidente dal valore di P slope >0.073. L’unica eccezione si osserva nella crescita di T. gamsii 6085 in presenza di F. oxysporum 7013, dove si ottiene una Pslope < 0.05 (Tabella 4.3).

Come esempio, in Figura 3, sono riportate le curve di crescita nelle colture duali di T. gamsii 6085 vs F. oxysporum 7119 (Figura 4.3a) e vs F. oxysporum 7121 (Figura 4.3b).

(36)

Figura 4.1c. Crescita miceliare di T. gamsii 6085 e F. oxysporum 7121 in coltura duale su OA

Tabella 4.3. Analisi della varianza della regressione delle curve di crescita di T. gamsii 6085 e degli

isolati di F. oxysporum in culture duali su PDA.Tg ctrl: Rc di T. gamsii 6085; Tg F1: RF1 di T. gamsii 6085; Fox ctrl: Rc di F. oxysporum; Fox F2: RF2 di F. oxysporum; P: significatività della retta di regressione; P slope: significatività della differenza tra le slope delle rette (ctrl vs F1/F2); P elevation: significatività della differenza delle elevations tra le rette (ctrl vs F1/F2).

Slope R2 P P slope P elevation T.g. ctrl 0.7813 ± 0.0477 0.978 < 0.0001 T.g. F1 0.7813 ± 0.0670 0.958 < 0.0001 1.00 0.26 Fox ctrl 0.1120 ± 0.0112 0.943 < 0.0001 F o x 7 0 0 7 Fox F2 0.1146 ± 0.0236 0.797 0.0029 0.92 0.65

Slope R2 P P slope P elevation T.g. ctrl 0.8249 ± 0.0165 0.996 < 0.0001 T.g. F1 0.7711 ± 0.0191 0.995 < 0.0001 0.048 / Fox ctrl 0.1149 ± 0.0264 0.678 0.0018 F o x 7 0 1 3 Fox F2 0.1824 ± 0.0520 0.577 0.0067 0.26 0.64

Slope R2 P P slope P elevation T.g. ctrl 0.7309 ± 0.0194 0.993 < 0.0001 T.g. F1 0.7148 ± 0.0378 0.973 < 0.0001 0.71 0.065 Fox ctrl 0.1117 ± 0.0103 0.921 < 0.0001 F o x 7 0 2 8 Fox F2 0.1019 ± 0.0144 0.833 < 0.0001 0.59 0.48