La fusariosi della spiga del frumento (Fusarium Head Blight - FHB) è una malattia su cui si sta focalizzando il lavoro di molti ricercatori al fine di poter trovare soluzioni efficaci per ridurne l’incidenza nelle aree in cui è presente ed evitarne l’introduzione in zone in cui non sono presenti le specie patogene di Fusarium e
Microdochium responsabili della malattia. Sono state proposte ed impiegate diverse
strategie per diminuire l’impatto della fusariosi della spiga, tra cui l’impiego di varietà resistenti, le rotazioni colturali idonee, pratiche agricole finalizzate alla soppressione dell’inoculo e l’applicazione di fungicidi.
La resistenza al FHB di alcune varietà di frumento è legata alla presenza di loci per i caratteri quatitativi (QTL), per cui sono state identificate varietà resistenti fhb1, che inibiscono l’infezione iniziale, e fhb2, che limitano la diffusione del patogeno verso la spiga. Sia fhb1 che fhb2 conferiscono principalmente il secondo tipo di resistenza. La resistenza di tipo 2 potrebbe, comunque, generare una pressione selettiva verso gli isolati che producono DON (Xu & Nicholson, 2009).
Un’adeguata rotazione colturale potrebbe rivelarsi utile per il contenimento della malattia. Dill-Macky (2008) ha osservato che la diffusione di FHB è ridotta del 25% nel caso in cui la coltura antecedente a frumento sia soia e non il frumento stesso.
Infine, l’applicazione dei fungicidi nel controllo del FHB e contaminazione da micotossine di grano è stata dimostrata essere inconsistente (Paul et al., 2007). L’applicazione del fungicida può ridurre maggiormente i livelli di DON rispetto a quelli di NIV, anche se le ragioni di ciò sono totalmente sconosciute. I triazoli sono efficaci contro le specie di Fusarium ma il loro effetto risulta inferiore contro quelle di
Microdochium. Il risultato contrario si ottiene quando viene impiegata la strobilurina
(Xu & Nicholson, 2009).
Tuttavia si ritiene necessaria un’azione sinergica dei suddetti sistemi di difesa in modo tale da ridurre significativamente la malattia, evitando, inoltre, l’ingresso di micotossine nella catena alimentare. Il controllo biologico si inserisce perfettamente in quest’ottica, potendo essere impiegato anche all’interno di un sistema di lotta integrata, anche in virtù del decreto legislativo n. 150 del 14 agosto 2012, che recepisce la direttiva comunitaria 2009/128/CE, in cui vengono definite le misure per un uso sostenibile dei prodotti fitosanitari al fine di ridurre i rischi sulla salute umana, sull’ambiente e sulla biodiversità, promuovendo l’applicazione di metodi non chimici.
Lo scopo del presente lavoro è stato la ricerca di uno o più isolati di F. oxysporum in grado di agire come agenti di lotta biologica nei confronti di F. graminearum e F.
culmorum, agenti causali del FHB e produttori di micotossine tra cui il DON e il NIV,
da soli o in combinazione con l’isolato Trichoderma gamsii 6085, in un approccio di tipo multitrofico. L’efficacia di T. gamsii 6085 come agente di biocontrollo del FHB è stata dimostrata in esperienze precedenti sia in condizioni di laboratorio che in pieno campo (Matarese et al., 2012; Sarrocco et al., 2013).
All’interno del F. oxysporum complex sono presenti alcuni isolati saprotrofi, capaci di contrastare lo sviluppo di patogeni sui residui colturali e per tale ragione presumibilmente in grado di ricoprire il ruolo di agenti di biocontrollo del FHB. Infatti numerose specie sono state esaminate per la capacità di ridurre il potenziale inoculo dei
Fusarium spp. patogeni, principalmente attraverso la riduzione della biomassa nei
residui colturali colonizzati da Fusarium (Dawson et al. 2004, Luongo et al, 2005). Gli isolati di F. oxysporum utilizzati nel presente lavoro fanno parte di un’ampia popolazione isolata da frammenti di paglia interrati in suoli con precedente storia di coltivazione a frumento (Sarrocco et al., 2012) e potrebbe rivelarsi una strategia vincente dal momento che questa specie è un effettivo colonizzatore di residui di frumento ed è noto per la capacità saprofitica a volte maggiore rispetto ai comuni agenti causali del FHB (Pereyra et al., 2004). Inoltre tale specie fungina forma clamidospore che conferiscono la capacità di resistenza su suolo per lunghi periodi. E’ noto, infatti, che l’inoculo fungino nei residui colonizzati presenti nel terreno può sopravvivere sia come micelio saprotrofico che sottoforma di clamidospore (Miedaner et al., 2008).
Sulla base di tali conoscenze è stata condotta un’analisi al fine di valutare i meccanismi d’azione degli isolati di F. oxysporum nei confronti dei due patogeni e la loro interazione con T. gamsii 6085. La prova di inibizione condotta in vitro contro F.
culmorum 627 e F. graminearum 124 ha dimostrato l’incapacità dei ceppi saprotrofi di F. oxysporum selezionati di agire come micoparassiti dei funghi patogeni dal momento
che non è stata riscontrata la formazione coilings. Inoltre può anche essere esclusa l’attività antibiotica di F. oxysporum perché l’analisi della varianza della regressione condotta sulla crescita miceliare non ha evidenziato differenze statisticamente significative nella crescita dei patogeni in presenza dei suddetti antagonisti. Al contempo, la prova di inibizione in vitro con T. gamsii 6085 fornisce risultati incoraggianti nel possibile impiego di F. oxysporum con il suddetto isolato di
negativamente della presenza di T. gamsii 6085 né il loro micelio viene parassitizzato, così come non si osserva un’azione negativa di F. oxysporum nei confronti dell’isolato 6085. Questo risultato denota una specificità di azione di T. gamsii 6085 nei confronti di altri funghi, poiché da ricerche precedenti era emersa la capacità antibiotica e micoparassitaria di questo isolato nei confronti dei due patogeni F. graminearum e F.
culmorum (Matarese et al., 2012).
La prova di inibizione in vitro ha permesso una selezione dei migliori ceppi di F.
oxysporum (Fox 7007, Fox 7028, Fox 7119, Fox 7121, Fox 7143, Fox 7181) che sono
stati utilizzati nella successiva prova di accrescimento in PDB e messi a confronto con i due patogeni e T. gamsii 6085. In particolare si osserva che F. graminearum e F.
culmorum hanno una breve fase di latenza raggiungendo in tempi piuttosto rapidi il
massimo livello di crescita; l’accrescimento degli isolati di F. oxysporum ha un andamento sigmoidale, con una fase di latenza leggermente più lunga dei patogeni, ma con una velocità di accrescimento in fase esponenziale maggiore rispetto a quanto mostrato dai due patogeni, con particolare riferimento all’isolato 7121, su cui sono state condotte ulteriori indagini sperimentali. Questo risultato potrebbe suggerire una maggiore capacità di crescita di F. oxysporum a parità di nutrienti a disposizione, lasciando ipotizzare il coinvolgimento di meccanismi di competizione che sono stati confermati nei test successivi sui nostri isolati, ma già noti in questa specie.
Le risorse nutritive disponibili possono condizionare la coesistenza dei microrganismi, determinando interazioni inevitabili tra differenti funghi nell’ecosistema terrestre (Magan & Aldred, 2007). E’ stato ipotizzato che l’utilizzo in vitro di diverse fonti di carbonio possa consentire la formulazione di un indice di sovrapposizione di
nicchia (NOI), sulla base del quale si possa stabilire la coesistenza o meno di
microrganismi all’interno di una stessa nicchia ecologica (Wilson & Lindow, 1994). Infatti, la capacità di funghi antagonisti di occupare la stessa nicchia ecologica di funghi patogeni potrebbe indicare le loro potenzialità competitive.
Sono stati pubblicati diversi lavori aventi come oggetto di studio la Niche
Overlapping in cui viene valutato l’utilizzo di diverse risorse di carbonio da parte di
microrganismi. Wilson & Lindow (1994), al fine di stabilire il valore del NOI, hanno preso in esame le risorse di carbonio in comune tra due specie diverse o due isolati fungini differenti rapportandole con tutte le fonti utilizzate da uno solo degli agenti coinvolti. Il valore del NOI >0.9 era indice di coesistenza tra le specie in una nicchia ecologica, mentre un risultato <0.9 rappresentava l’occupazione di nicchie separate.
Tuttavia è stato successivamente dimostrato che il NOI non può prescindere da alcuni parametri che ne cambiano il risultato finale. Ad esempio, Mohale et al. (2013) hanno condotto un lavoro sulla sovrapposizione delle nicchie basato sull’utilizzo di diverse fonti di carbonio da parte di isolati tossigeni e atossigeni di Aspergillus flavus, osservando un cambiamento del NOI legato alla variazione della temperatura e dell’attività dell’acqua. Inoltre altro dato che si può tenere in considerazione è la velocità di utilizzo delle varie fonti di carbonio da parte delle specie in esame.
Le indagini sperimentali condotte nel presente elaborato per la determinazione del NOI sottolineano la capacità di Fox 7121 di utilizzare il maggior numero di substrati rispetto ai due patogeni e all’isolato antagonista di Trichoderma. In generale, dai dati ottenuti relativamente ai substrati utilizzati, emerge un diverso andamento delle curve di crescita di F. oxysporum 7121, T. gamsii 6085, F. culmorum 627 e F. graminearum 124, rappresentativo di un diverso utilizzo delle fonti di carbonio, sia che si tratti di zuccheri, aminoacidi o acidi grassi. Effettuando l’analisi della varianza della regressione delle curve di crescita emergono differenze statisticamente significative che comportano una riduzione del NOI. Infatti qualora non si considerasse la velocità di utilizzo dei substrati, ma esclusivamente la capacità di utilizzo, il NOI ottenuto sarebbe più elevato e, in gran parte dei casi, sarebbe sinonimo di sovrapposizione delle nicchie ecologiche (si veda Tabella 4.8), sulla base di quanto riportato in letteratura. Bisognerà, dunque, meglio interpretare i dati ottenuti mediante ulteriori indagini, utilizzando magari una formula diversa per il calcolo del NOI.
La competizione può verificarsi mediante la colonizzazione da parte dell’antagonista di un substrato precedentemente occupato da un altro microrganismo. Lockwood (1988) si riferisce a questa categoria di interazione definendola
“competizione per il substrato”, simile a quella che Park (1963) descrisse come “reazione di antagonismo”. Gran parte del ciclo biologico dei funghi che causano il
FHB è saprotrofo ed è legato al mantenimento dell’occupazione dei residui colturali colonizzati in competizione con numerosi altri microrganismi (Bruehl, 1987). Poiché i residui colturali, come la paglia, rappresentano un teatro per la competizione tra le specie fungine conivolte nel FHB (Dill-Macky and Jones, 2000), F. oxysporum 7121, T.
gamsii 6085 e F. graminearum sono stati sottoposti ad una prova in laboratorio volta a
valutarne la capacità saprofitica competitiva. F. oxysporum 7121 risulta capace di ridurre sensibilmente la percentuale di colonizzazione della paglia da parte di F.
totale soppressione del patogeno. Inoltre, non si evidenzia alcun effetto di inibizione su
T. gamsii 6085 da parte di F. oxysporum 7121.
I risultati ottenuti aprono nuovi scenari per il controllo biologico del FHB, evidenziando interessanti potenzialità di utilizzo di F. oxysporum 7121 come antagonista di F. graminearum e F. culmorum. Inoltre la mancanza di interferenze nei confronti di T. gamsii 6085 è un fattore di non secondaria importanza poiché la copresenza dei due antagonisti dovrebbe garantire una maggiore efficacia nella lotta ai patogeni. In futuro si potrebbe ipotizzare l’impiego degli antagonisti oggetto di studio nel presente lavoro, “in pieno campo” e con un approccio di tipo multitrofico, con l’obiettivo di confermare i risultati delle prove condotte in laboratorio.