Studio retrospettivo sulle procedure diagnostiche per l'identificazione delle Trombocitopenie Immuno-mediate nel cane

UNIVERSITA’ DI PISA

Dipartimento di Scienze Veterinarie

Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria

Studio retrospettivo sulle procedure

diagnostiche delle Trombocitopenie

Immuno-Mediate nel cane

Candidato Relatori

Giacomo Comassi Prof. George Lubas

Dott.ssa Alessandra Gavazza

INDICE

RIASSUNTO

5

ABSTRACT

6

INTRODUZIONE

7

PARTE GENERALE

1)PIASTRINOPOIESI

1. 1 Generalità sulla piastrinopoiesi

9

1. 2 Le piastrine

13

1.2.1 Morfologia piastrinica

13

1.2.2 Funzionalità piastrinica

15

1.2.3 Emostasi primaria

16

1.2.4 Alterazioni morfologiche delle piastrine

18

2) DISORDINI DEL NUMERO DI PIASTRINE

2.1 Le trombocitopenie: classificazione

20

2.1.1 Trombocitopenia da diminuita produzione

20

2.1.2 Trombocitopenia da sequestro o perdita

21

2.1.3 Trombocitopenia da aumentato consumo

22

2.1.4 Trombocitopenia da aumentata distruzione

23

3) TROMBOCITOPENIA IMMUNOMEDIATA

3.1

Eziopatogenesi della IMT

27

3.2 Caratteristiche clinico-patologiche della IMT

28

3.2.2 Esame fisico

29

3.3 Diagnosi della IMT

30

PARTE SPERIMENTALE

4. MATERIALI E METODI

4.1 Pazienti e dati raccolti

35

4.2 Strumenti analizzati

36

4.3 Metodi di classificazione dei dati raccolti

38

4.3.1 Segnalamento

38

4.3.2 Anemia

39

4.3.3 Leucogramma

39

4.3.4 Trombocitopenia

40

4.3.5 Segni clinici

40

4.3.6 Profilo epatico

41

4.3.7 Midollo osseo

41

5. RISULTATI

5.1 Segnalamento

43

5.1.1 Età

44

5.1.2 Sesso

44

5.1.3 Razza

45

5.2 Anemia

47

5.3 Leucogramma

48

5.4 Trombocitopenia

49

5.5 Segni clinici

51

5.6 Profilo epatico

54

5,7 Midollo osseo

55

6. DISCUSSIONI

6.1 Segnalamento

56

6.1.1 Età

56

6.1.2 Sesso

57

6.1.3 Razza

57

6.2 Anemia

57

6.3 Leucogramma

58

6.4 Trombocitopenia

59

6.5 Segni clinici

59

6.6 Profilo epatico

61

6,7 Midollo osseo

62

7.CONCLUSIONI

63

BIBLIOGRAFIA

64

RINGRAZIAMENTI

RIASSUNTO

Parole chiave: Trombocitopenia immunomediata, studio retrospettivo, diagnosi, cane Introduzione: La Trombocitopenia immuno-mediata(IMT) è una malattia dalla

complessa eziologia in cui gli anticorpi si legano alla superficie delle piastrine causandone una prematura distruzione da parte dei macrofagi. L'IMT può essere primaria (ITP) o può verificarsi secondariamente (IMTs) a infezioni batteriche, virali, da protozoi o da elminti, neoplasia o somministrazione di farmaci. La diagnosi di una ITP avviene dopo aver escluso altre potenziali cause di IMT.

Obiettivi: Il nostro studio si è prefissato come obiettivo di valutare nei soggetti affetti

da IMT le principali alterazioni cliniche e clinico-patologiche e confrontare i dati nei due gruppi di studio (ITP e IMTs).

Materiali e metodi: Sono stati inclusi 55 cani affetti da IMT (29 ITP e 26 IMTs),

visitati presso l’Ospedale Didattico Veterinario “Mario Modenato” (ODV) nel periodo di tempo compreso tra Maggio 2010 e Dicembre 2017. Per ciascun caso sono stati raccolti segnalamento, anamnesi, esame fisico ed esami clinico-patologici tra cui emogramma completo, profilo biochimico, profilo coagulativo, esame citologico dell’aspirato del midollo osseo, sierologia ed ecoaddome.

Risultati: Il nostro studio ha confermato che la razza Cocker Spaniel è predisposta allo

sviluppo di IMT (p<0,0001) e che la presenza delle petecchie si osserva nei soggetti con un valore di piastrine al sotto di 20.000/µL (p=0,0196). I risultati ottenuti non hanno mostrato alcuna differenza statisticamente significativa tra le principali alterazioni osservate nei due gruppi di studio fatta eccezione per la maggiore presenza di un leucogramma normale nei soggetti affetti da ITP rispetto a quelli affetti da IMTs(76% vs 23%)( P=0,031).

Conclusioni: Ad oggi, non esistono delle alterazioni cliniche e clinico-patologiche che

permettano di distinguere le ITP dalle IMTs, per cui diagnosi delle ITP si basa sull’esclusione di tutte le possibili cause secondarie

ABSTRACT

Key Words: Immunomediated thrombocytopenia, retrospective study, diagnosis, dog Background: Immuno-mediated thrombocytopenia (IMT) is a disease with a complex

etiology in which antibodies bind to the platelets surface causing premature destruction by macrophages.IMT may be primary (ITP) or secondary (IMTs) due to bacterial, viral, protozoal or helminth infection, neoplasm, drug administration, etc.. The diagnosis of an ITP occurs after excluding other potential causes of IMT.

Aims: Our study aims to evaluate the main clinical and pathological changes in subjects

with IMT and to compare data in the two study groups (ITP and IMTs).

Materials and methods: 55 dogs affected by IMT were included (29 ITP and 26

IMTs), visited at the "Mario Modenato" Veterinary Didactic Hospital (ODV) in the period between May 2010 and December 2017. For each case, signaling, anamnesis, physical examination and clinical-pathological examinations were collected including complete hemogram, biochemical profile, coagulation profile, cytological examination of bone marrow aspiration, serology and ecoaddomen.

Results: Our study confirmed that Cocker Spaniel breed is predisposed to the

development of IMT (p <0.0001) and that the presence of petechiae is observed in subjects with a platelet value below 20,000 / μL (p = 0.0196). The results obtained showed no statistically significant difference between the main alterations observed in the two study groups except for the increased presence of a normal leukogram in subjects affected by ITP compared to those affected by IMTs (76% vs 23%) (P = 0.031).

Conclusions: At present, there are currently no clinical or clinical-pathological changes

that allow ITP to be distinguished from IMTs, for which ITP diagnosis is based on the exclusion of all possible secondary causes

INTRODUZIONE

La trombocitopenia immunomediata(IMT) è una malattia in cui degli anticorpi si legano alla superficie delle piastrine causandone una prematura distruzione da parte dei macrofagi tissutali. L'IMT può essere primaria o può verificarsi secondariamente a infezioni, neoplasie o alla somministrazione di farmaci. Nella trombocitopenia immunomediata primaria (ITP) gli autoanticorpi reagiscono contro i normali antigeni piastrinici. Le glicoproteine (GP) IIb e / o IIIa sono state riconosciute come antigeni bersaglio in alcuni cani (Lewis & Meyers, 1996). Il complesso GP IIb / IIIa è il recettore del fibrinogeno essenziale per la normale aggregazione piastrinica. Questo può spiegare l’alterazione piastrinica che è stata osservata nei cani con ITP (Kristensen, et al., 1994). L'IMT secondaria (IMTs) può verificarsi se i complessi immuni vengono adsorbiti dalle piastrine, se gli anticorpi sono prodotti contro un antigene estraneo e legato alla superficie delle piastrine o se gli anticorpi stanno reagendo agli antigeni piastrinici alterati nel corso della patologia (Putsche & Kohn, 2008). L’IMT è un disordine di accelerata distruzione piastrinica. Nel cane l’emivita delle piastrine è di circa 5 giorni; nella ITP l’emivita piastrinica si riduce a ore o minuti (shulman e jordan 1987). La diagnosi per IMT non è semplice e si basa sulla concomitante presenza di una trombocitopenia e di una positività al test diretto anti IgG e IgM legate sulla superficie delle piastrine del cane. Alla diagnosi invece di ITP, si arriva per esclusione, eliminando tutte le possibili cause secondarie di trombocitopenia. (Scott & Jutkowitz, 2010) Lo scopo del nostro studio retrospettivo è stato quello di valutare tutti i casi di IMT nel cane che sono stati visitati presso l’Ospedale Didattico Veterinario “Mario Modenato”.

CAPITOLO 1

1.1 Generalità sulla piastrinopoiesi

Le piastrine circolanti nei mammiferi sono prodotte a partire da cellule giganti multinucleate nel midollo osseo chiamate megacariociti (Harvey, 2012). La cellula totipotente (PPSC: pluripotent stem cell) nel midollo osseo, genera due cellule progenitrici megacariocitiche funzionalmente riconoscibili: l’unità megacariocitica multipotente progenitrice (BFUMeg: Burts-forming unit-megakaryocyte) e l’unità megacariocitica formante colonia (CFU-Meg: colony- forming unit-megakaryocyte). La CFU-Meg, si divide e si differenzia in precursori riconoscibili (Jain, 1993). Questi precursori prendono il nome di promegacarioblasti (Harvey, 2012). La prima cellula riconoscibile morfologicamente è proprio quest’ultima. Essi hanno un elevato rapporto nucleo-citoplasma con un citoplasma di colore blu scuro e un diametro di circa 10 ɥm (Russell, 2010). I promegacarioblasti poi maturano in megacarioblasti, successivamente in promegacariociti ed infine in megacariociti. La divisione e la differenziazione della PPSC in CFU-Meg sono influenzate dal microambiente ematopoietico, dalle interazioni cellulari, e dai fattori umorali, mentre la divisione e la differenziazione della CFU-Meg in megacarioblasto sono regolate da uno specifico fattore stimolante le colonie cellulari (CFS Meg:colonystimulatingfactor) e altre citochine; lo sviluppo dei megacariociti e la produzione delle piastrine sono influenzate primariamente dalla trombopoietina. La megacariocitopoiesi si differenzia dall’eritropoiesi e dalla granulocitopoiesi unicamente in quanto implica la poliploidizzazione del precursore cellulare a seguito di un processo di endomitosi o endoreduplicazione (divisione nucleare senza divisione citoplasmatica) (Harvey, 2012). Negli esseri umani e animali domestici, i megacariociti si trovano principalmente nel midollo osseo. Tuttavia, nei topi adulti, la milza è considerata un organo ematopoietico primario e genera tutte le linee di cellule ematopoietiche, compresi i megacariociti. I megacariociti subiscono un certo grado di frammentazione nella circolazione polmonare nella maggior parte delle specie mammiferi. Durante le fasi iniziali dello sviluppo dei megacariociti, le cellule progenitrici subiscono una divisione cellulare tipica in quanto acquisiscono marcatori specifici della linea cellulare. Nelle fasi successive dello sviluppo, i megacariociti iniziano diversi step di endomitosi in cui l'anafase, la telofase e la citocinesi vengono saltate, causando la divisione del DNA senza divisione cellulare. I megacariociti maturi sono cellule poliploidi e la quantità del DNA contenuto è correlato con il numero di piastrine che un megacariocita alla fine produrrà. La progressione dei megacariociti dalla divisione normale a quella

atipica è dovuta alla mancanza di formazione di un normale fuso mitotico. Gli studi che utilizzano una linea di cellule eritroleucemia K562 suggeriscono che la diminuzione della espressione di stathmin può essere necessaria per l'induzione dell'endomitosi nei megacariociti. Stathmin è una fosfoproteina che promuove la depolimerizzazione del microtubulo e viene fosforilata e defosforilata in modo dipendente dal ciclo cellulare. Gli studi con la linea cellulare K562 suggeriscono che durante il primo sviluppo dei megacariociti, i livelli di espressione di stathmin sono elevati (Iancu-Rubin, et al., 2005). Generalmente si verificano da 2 a 5 replicazioni nucleari che determinano da 8 a 64 paia di cromosomi nei megacariociti maturi rispetto alle 2 paia che troviamo di solito nelle maggior parte delle cellule del corpo. Singoli nuclei possono essere osservati dopo le prime 2 replicazioni (promegacariociti) ma un nucleo grande polilobulato è evidente quando si sono formati i megacariociti maturi. Il citoplasma nei promegacariociti è intensamente basofilico. Nei megacariociti maturi c’è un decremento progressivo della basofilia e un aumento della granularità (Harvey, 2012). Quando un promegacariocita inizia a maturare in megacariocita, nel citoplasma si sviluppano granuli azzurrofili in particolare vicino al nucleo; con la maturazione i nuclei diventano molto lobulati, la cromatina nucleare si condensa e il citoplasma aumenta in quantità, diventa meno basofilico e acquisisce granularità. Di conseguenza lo stadio successivo, costituito dal megacariocita, ha una massa nucleare singola, multilobata, abbondante a colorazione pallida e con numerosi granuli azzurrofili; i megacariociti sono solitamente rotondi, sebbene occasionalmente la cellula può essere distorta a causa di problemi relativi al metodo di strisciamento su vetrino (Jain, 1993). Il volume della cellula aumenta ad ogni replicazione, quindi i megacariociti sono più grandi di ogni altra cellula del midollo esclusi gli osteoclasti. A differenza dei megacariociti, gli osteoclasti maturi hanno nuclei multipli discreti (Harvey, 2012). La differenziazione dei megacariociti avviene dopo che l'endomitosi è completata ed è associata all'invaginazione tubolare della membrana plasmatica con conseguente formazione del sistema di membrana di demarcazione (DMS). Il modello attuale della formazione di piastrine suggerisce che le funzioni DMS forniscono un serbatoio per membrana per la formazione e l'estensione delle propiastrine. Prima della formazione di propiastrine c'è un accumulo di fosfolipidi PI-4,5-P2 a seguito di attività di lipid-chinasi dei megacarociti. La sintesi dei granuli piastrinici avviene simultaneamente con la formazione del DMS e i granuli vengono impacchettati e mobilizzati come assemblaggio di microtubuli nell'estensione delle propiastrine. Il motore del microtubulo kinesin è probabilmente responsabile del

trasporto di organelli e granuli lungo microtubuli. Il movimento è bidirezionale e i microtubuli scivolano gli uni sugli altri. Una volta che i granuli e gli organelli entrano nella punta della propiastrina vengono immagazzinati all’interno per sviluppare la piastrina adulta. Oltre agli organelli, gli spliceosomi e il pre – mRNAs sono immagazzinati nella nuova piastrina che si sta formando per dare a quest’ultima la capacità di sintetizzare proteine. L'assemblaggio del microtubulo è un processo dinamico: la fotografia a tempo ridotto mostra l'estensione e la retrazione alternata nonché la flessione e la ramificazione dei raggi delle propiastrine. Le piastrine si formano dalle punte delle ramificazioni delle propiastrine. Le estensioni di quest’ultime si staccano grazie alle forze dell’actina. Inoltre la dineina regola il movimento dei microtubuli, fondamentale per la formazione delle piastrine. I microtubuli sono polimeri cavi formati da dimeri α / β-tubulina. La tubulina β -1 è la forma piastrinica β-tubulare più abbondante. Una mutazione nella tubulina β-1 causa macrotrombocitopenia nei Cavalier King Charles Spaniels. La formazione di propiastrine esaurisce tutto il citoplasma del megacariocita lasciando solo il nucleo che entra in un percorso apoptotico (Boudreaux, 2010).

È stato stimato che ogni megacariocita produce da 1000 a 3000 piastrine e la variabilità ipende dalla grandezza del megacariocita. Un certo numero di citochine può stimolare accrescere la proliferazione e l’espansione dei progenitori dei megacariociti. I fattori he possono essere coinvolti includono: il fattore delle cellule staminali(SCF), il ligando della tirosina chinasi 3 fms simile(Flt3L), l’interleuchina 3(IL-3),il fattore stimolante le colonie granulocito-macrofagiche (GM-CSF), l’interleuchina 11 (IL-11) e l’eritropoietina (EPO). La trombopoietina(TPO) è lo stimolatore chiave della produzione delle piastrine stimolando i megacariociti alla maturazione, alla sopravvivenza e all’ingrandimento (Harvey, 2012). La trombopoietina è l’ormone umorale regolatore chiave della trombopoiesi e non solo. È stato infatti dimostrato che la trombopoietina è importante per l’ematopoiesi in generale e in particolar modo per lo sviluppo delle cellule ematopoietiche staminali (Alexander, et al., 1996).

Il legame della TPO al recettore c-Mpl determina l’attivazione delle janus chinasi(JAKs), dei trasduttori di segnale e degli attivatori dei fattori di trascrizione(STAT) STAT 3 e STAT 5. La JAK2 è legata costantemente a c- Mpl e dopo l 'attivazione si fosforilano i residui di tirosina all'interno di c- Mpl e all'interno di STAT, di PI3K e delle kinasi proteiche attivate da mitogeni (MAPKs). Gli STAT3 e STAT5 sono necessari per la regolazione della normale megacariopoiesi e sono regolati

in maniera errata in alcuni disturbi mieloproliferativi e nelle leucemie megacarioblastiche nell'uomo. La TPO è sintetizzata principalmente dal fegato e, in misura minore, nel rene e nelle cellule stromali del midollo osseo. I recettori per la TPO si trovano sulle piastrine, sui megacariociti e sulle cellule endoteliali vascolari.

Anche se il numero di recettori per la TPO sulle cellule endoteliali supera quello che si trova sui megacariociti e sulle piastrine, i recettori per la TPO endoteliali non sono coinvolti nella regolazione dei livelli di TPO. In condizioni di stato stazionario, la TPO è prodotta in modo costitutivo ed è legata a piastrine e megacariociti attraverso specifici recettori per la TPO denominati c - Mpl. La TPO legata è internalizzata e degradata e non disponibile per stimolare la trombopoiesi sopra i livelli di stato stazionario. Sebbene la produzione di TPO sia costitutiva in condizioni di stato stazionario, la trombocitopenia grave può portare ad una maggiore produzione di TPO mediante cellule stromali del midollo osseo. Le condizioni infiammatorie, inoltre, possono determinare una aumentata produzione di TPO da parte degli epatociti (mediata dall’Interleuchina-6), con conseguente trombocitosi reattiva. Durante determinate condizioni patologiche può essere modificato il livello basale di TPO con conseguente livello di TPO che sarà discordante con quello che ci aspetteremmo basandosi sul numero di piastrine. In alcuni casi di gravi trombocitopenia idiopatica, in particolare dove i megacariociti sono notevolmente aumentati in numero e in dimensioni, i livelli di TPO potrebbero non essere alti come previsti a causa del legame di TPO ai recettori c-Mpl sui megacariociti. Sebbene la TPO sia un fattore fondamentale per la trombopoiesi esistono altre citochine che lavorano assieme ad essa. IL- 3 lavora in sinergia con la TPO per produrre cellule della linea ematopoietica; il fattore delle cellule staminali(SCF) e il fattore stimolante le colonie granulocito-macrofagiche (GM - CSF) agiscono in sinergia per aumentare l’espansione e la proliferazione dei progenitori del midollo osseo e della linea megacariocitica. Il fattore stimolante le colonie (G –CSF) combinato con la TPO può innescare le cellule staminali ematopoietiche per entrare nel ciclo cellulare e sostenere la formazione della colonia (Boudreaux, 2010). IL-6 stimola la trombopoiesi tramite l’incremento di produzione di TPO da parte del fegato che contribuisce alla trombocitosi in alcune condizioni infiammatorie (Harvey, 2012). Nelle fasi successive dello sviluppo dei megacariociti, è stato dimostrato che il fattore stimolante le colonie(G-CSF) sopprime la megacariopoiesi. IL - 11, IL – 12 e l’eritropoietina stimolano anche la proliferazione dei progenitori dei megacariociti mentre IL1 - α e il fattore di inibizione della leucemia (LIF) influenzano le fasi

successive della maturazione dei megacariociti e del rilascio delle piastrine. Il fattore piastrinico 4(PF4), detto anche fattore antieparinico, è immagazzinato in granuli alfa delle piastrine. È stato dimostrato che esso è in grado di inibire la megacariocitopoiesi in vitro. Inoltre un’attivazione anomala delle piastrine all’interno del midollo osseo con conseguente rilascio di PF4 può contribuire alla trombocitopenia (Boudreaux, 2010) .

1.2 Le piastrine

Le piastrine sono frammenti di megacariociti, hanno una forma di disco piatto e presentano numerosi organelli e un citoplasma irregolare (Baker, 2012). Al microscopio ottico presentano una regione periferica chiara detta ialomero, ed una regione centrale più scura detta granulomero. Nel sangue periferico umano si trovano da 200.000 a 400.000 piastrine per con una vita media di 14 giorni (Gartner & Hiatt, 2008).

1.2.1 Morfologia piastrinica

La piastrina può essere divisa in vari comparti o zone ognuna delle quali ha un distinto ruolo nella funzionalità piastrinica. Questi comparti sono la membrana esterna, il citoplasma, gli organelli e i sistemi di membrana. La membrana esterna è composta da una doppia membrana fosfolipidica, all’interno della quale è uniformemente distribuito il colesterolo. I fosfolipidi sono distribuiti asimmetricamente nella membrana; l’asimmetria è mantenuta da specifiche proteine di membrana. Nella piastrina a riposo lo strato esterno è ricco di fosfatidilcolina e sfingomielina, mentre lo strato interno è ricco di fosfatidilserina e fosfatidiletonalamina. L’asimmetria è essenziale per l’appropriato funzionamento della piastrina, in quanto alterazioni nella distribuzione dei fosfolipidi, che avvengono in seguito all’attivazione piastrinica, convertono la piastrina in una molecola procoagulante (Stokol, 2004). Le proteine e le glicoproteine, che fungono da recettori specializzati nelle risposte piastriniche sono presenti sia all'interno che all'esterno del doppio strato lipidico della membrana (Boudreaux & Catalfamo, 2010). Le glicoproteine sono contrassegnate sequenzialmente da numeri romani e appartengono ad alcune diverse famiglie di geni tra cui le integrine, le glicoproteine ricche di leucina, le selectine , le immunoglobuline superfamiliari e le quadrispanine

(Stokol, 2004) . La glicoproteina (GP) Ib - IX - V e GPVI, recettori implicati nella malattia di von willebrand e nel legame del collagene, rispettivamente, sono esempi di recettori posti all’interno del doppio strato della membrana lipidica. Il complesso della glioproteina IIb - IIIa (GPIIb - IIIa), anche conosciuto come integrin α-Ib β-3, è il complesso glicoproteico prevalente ed è localizzato fuori dallo strato lipidico. I recettori GPIIb-IIIa sono importanti per mediare l'aggregazione piastrinica legandosi al fibrinogeno, anche se questi complessi possono anche legarsi al fattore di von willebrand e aiutare nelle fasi iniziali l’adesione piastrinica al subendotelio (Boudreaux & Catalfamo, 2010). Il citoplasma contiene microfilamenti e microtubuli che formano il citoscheletro della piastrina e sono responsabili del mantenimento della regolare forma discoidale. Queste fibre permettono alle piastrine di cambiare forma e rilasciare i granuli nella cosiddetta “zona di rilascio”. Il citoplasma contiene anche il glicogeno che è la principale fonte energetica delle piastrine. La zona degli organuli contiene 2 tipi di granuli piastrina-specifici, gli α-granuli e i β-granuli conosciuti anche come corpi densi. Accanto a questi esistono altri organuli comuni come i mitocondri, i perossisomi e i lisosomi (Boudreaux & Catalfamo, 2010). Si pensa che α-granuli e β-granuli derivino da un corpo comune multivescicolare e per questo le loro membrane abbiano molti elementi in comune (Boudreaux & Catalfamo, 2010). Le proteine degli α-granuli sono secrete durante la reazione di rilascio e partecipano sia alla reazione piastrinica sia alla formazione della fibrina. I corpi densi sono invece gli elementi di stoccaggio della quota non metabolica dell’adenosina trifosfato(ATP), dell’adenosina difosfato(ADP), della serotonina e del calcio. Le piastrine contengono due importanti sistemi di membrana: il sistema canalicolare aperto connesso alla superficie e il sistema tubulare denso. Il sistema canalicolare aperto, prodotto da invaginamenti della membrana piastrinica, mantiene un contatto diretto con il plasma ed è il probabile sito di endocitosi delle proteine plasmatiche delle piastrine. I contenuti sia degli α-granuli sia dei corpi densi, durante la reazione di rilascio, sono riversati all’interno del sistema canalicolare aperto. Il sistema tubulare denso sequestra attivamente il calcio, attraverso una pompa del calcio stesso. Il rilascio del calcio dal sistema tubulare denso θ fondamentale per l’attivazione, la reazione di rilascio e l’aggregazione delle piastrine (Stokol, 2004). Quando le piastrine invecchiano vengono rimosse dal circolo dai macrofagi presenti nel fegato e nella milza. La fosfatidilserina gioca un ruolo fondamentale in questo processo. Essa può indurre fagocitosi dei macrofagi direttamente o mediata da proteine che si legano ai macrofagi. Una percentuale minore di piastrine viene continuamente rimossa

dalla circolazione a causa del loro ruolo nella manutenzione dell'integrità endoteliale (Boudreaux & Catalfamo, 2010).

1.2.2 Funzionalità piastrinica

Le piastrine sono la prima linea di difesa contro i sanguinamenti nei siti di lesione vascolare e sono gli elementi che maggiormente contribuiscono alla trombosi, all'infiammazione e alla neoplasia. Le piastrine hanno recettori di superficie cellulare che riconoscono i segnali dal loro ambiente e comunicano tali segnali ad una complessa rete di biomolecole che includono ioni, proteine, nucleotidi e fosfolipidi. Le piastrine agiscono mediante adesione, aggregazione, rilascio di granuli e attività procoagulante (Boudreaux & Catalfamo, 2010). Sebbene questi processi siano affrontati separatamente, essi avvengono contemporaneamente nel sistema vascolare e la distinzione è solo artificiale (Stokol, 2004). Quando le molecole specificatamente riconosciute dalle piastrine si legano ai recettori delle piastrine, inducono il segnalamento, che determina cambiamenti strutturali nelle glicoproteine sulla superficie della membrana piastrinica, che consentono quindi il legame delle proteine che mediano l'adesione e l'aggregazione delle piastrine. A sua volta il legame delle proteine adesive ai recettori provoca un cambiamento di conformazione sulla membrana esterna che promuove e migliora il rilascio dei granuli piastrinici, l'aggregato piastrinico, la formazione di fibrina e la retrazione del coagulo. L’interazione tra i recettori piastrinici e le molecole di segnalazione è una componente chiave dell'attivazione delle piastrine, e ancora molto è da scoprire riguardo gli elementi coinvolti in questi eventi (Boudreaux & Catalfamo, 2010). Si aggiunge poi alla complessità della comprensione degli eventi delle piastrine il fatto che le piastrine siano in grado di sintetizzare le proteine (Zimmermann & Weyrich, 2008) . Questa funzionalità, chiamata traduzione-dipendente, probabilmente cambierà gli attuali punti di vista sul coinvolgimento delle piastrine in molti eventi, tra cui emostasi, trombosi, infiammazione e neoplasie metastatiche (Boudreaux & Catalfamo, 2010).

1.2.3 Emostasi Primaria

Il meccanismo emostatico coinvolge complesse interazioni tra elementi cellulari, proteine, fosfolipidi, mediatori chimici e catalizzatori, e consiste in una sequenza di variazioni biochimiche e fisiche che iniziano con un danno vasale e che terminano con la formazione di un coagulo solido e la riparazione del tessuto leso. Gli elementi fondamentali dell’emostasi (il vaso ematico danneggiato, le piastrine, i fattori plasmatici della coagulazione e della fibrinolisi), devono essere in equilibrio tra di loro altrimenti possono presentarsi sanguinamenti o formazioni di trombi (Lubas, 2011). Normalmente, la coagulazione non si verifica all'interno della rete vascolare perché le parti cellulari in gioco sono rese inattive e perché la maggior parte delle proteine protagoniste dell’emostasi circola sotto forma di zimogeni, una forma inerte. L'inizio della coagulazione in risposta al danno dipende dall'esposizione di componenti extravascolari che non sono presenti nel flusso sanguigno in condizioni fisiologiche. L'esposizione di questi fattori extravascolari da inizio ad una cascata esplosiva di attivazione cellulare, cambiamenti nelle proprietà della superficie cellulare e generazione di enzimi attivi che producono un coagulo stabile (Smith, 2010). Le piastrine si aggregano e formano il tappo emostatico primario, che è di breve durata, instabile e serve come substrato per l’inizio della cosiddetta emostasi secondaria, in quanto la maggior parte dei fattori della coagulazione assembla il trombo o il coagulo sul tappo piastrinico (Couto & Nelson, 2015). Alcune cellule e enzimi innescano anche risposte vascolari, infiammatorie e meccanismi di difesa immunitaria. Con la coagulazione inizia anche la fibrinolisi, il processo attraverso il quale il coagulo viene rimosso per ripristinare il flusso sanguigno. In definitiva, la coagulazione innesca la migrazione e la proliferazione delle cellule che promuovono la guarigione (Smith, 2010). La funzione delle piastrine nell’emostasi può essere distinta in varie fasi: adesione, aggregazione, reazione di rilascio e attività piastrinica procoagulante, sebbene in realtà questa sia solo una divisione artificiale perché questi processi avvengono contemporaneamente nel sistema vascolare. Il tipo di recettori e leganti varia a seconda del sito del danno vascolare e, più specificatamente, in base al grado di alterazione del flusso ematico in quell’area (Stokol, 2004). Quando un vaso ematico è danneggiato, la barriera cellulare endoteliale si rompe e rimane il tessuto subendoteliale esposto. Ciò comporta una diminuzione localizzata dei fattori che normalmente impediscono l’adesione piastrinica come anche l’esposizione delle piastrine alle sostanze endoteliali, tra cui il collagene, che promuovono l’adesione

piastrinica. Contemporaneamente vi è una vasocostrizione locale, che riduce il flusso ematico (Stokol, 2004). Le piastrine aderiscono al collagene subendoteliale inzialmente grazie ai recettori glicoproteici (GP) IaIIa e VI (Hoffman & Monroe, 2001). Le piastrine attivate cambiano forma, da lisce e discoidi a rotonde, con numerosi pseudopodi, che aumentano enormemente l’area di superficie piastrinica. L’attivazione espone i recettori del fibrinogeno sulla membrana piastrinica e permette l’aggregazione tra le piastrine, mediata dal fibrinogeno (McConnell, 2004). L’aggregazione è potenziata da altri mediatori tra cui la trombina, l’ADP, la serotonina, il fattore attivante le piastrine e il trombossano A2 (Stokol, 2004). Il contenuto dei granuli densi e degli alfa granuli è rilasciato localmente e promuove il richiamo di altre piastrine nel luogo del danneggiamento che vanno ad attaccarsi alle piastrine adese al collagene subendoteliale. L’esposizione dei tessuti subendoteliali comporta, inoltre, un cambiamento di conformazione del Fattore di von Willebrand (vWF), per cui le piastrine lo riconoscono e vi aderiscono, portando ad un ulteriore adesione piastrinica al subendotelio e anche promuovendo un’ulteriore attivazione piastrinica. Il coagulo emostatico primario nel punto del danno vascolare è formato dalla combinazione delle piastrine adese al tessuto subendoteliale e dalle piastrine legate tra loro (McConnell, 2004). Il coagulo piastrinico cosi formato necessità di un’ulteriore stabilizzazione per resistere al flusso sanguigno. Tale stabilizzazione avviene mediante l’attivazione di proteine procoagulanti inattive che portano alla formazione di un reticolo di fibrina (Davie & Ratnoff, 1964). La produzione di attività procoagulante piastrinica richiede un afflusso di calcio ed è associata alla redistribuzione della fosfatidilserina nello strato esterno della membrana e allo svuotamento delle vescicole di membrana dalla superficie piastrinica (Stokol, 2004). La rimozione del trombo una volta formatosi è di primaria importanza per il mantenimento della pervietà del sistema vasale. Il sistema fibrinolitico ha considerevoli parallelismi con il sistema procoagulante, anche se sono coinvolte un numero minore di proteine. L’enzima protelitico chiave nella degradazione della fibrina è la plasmina. Il precursore inattivo della plasmina è il plasminogeno, una proteina che ha affinità sia per il fibrinogeno che per la fibrina. Uno dei maggiori attivatori del plasminogeno è l’attivatore tissutale del plasminogeno (t-PA). Il legame del t-PA alla fibrina fornisce una certa attività proteolitica attraverso il plasminogeno e si genera quindi un po’ di plasmina. Questa plasmina, non è solo capace di iniziare la degradazione della fibrina, ma attiva anche il t-PA ad una forma più attiva che incrementa la formazione di plasmina (Lubas, 2011). Una volta che il plasminogeno è attivato a plasmina, degrada la

fibrina insolubile all’interno del coagulo rilasciando i prodotti di degradazione della fibrina (Hawiger, 1995).

1.2.4 Alterazioni morfologiche delle piastrine

La lettura dello striscio ematico colorato al microscopio elettronico è di fondamentale importanza per andare a valutare la morfologia delle piastrine. Qui vengono riportate le principali alterazioni piastriniche che comunemente vengono osservate:

1. Macropiastrine: sono anche dette macrotrombociti e vengono definite cosi quando sono grandi o più voluminose di un globulo rosso nel cane. Nel Cavalier King Charles Spaniel è stata riscontrata una macrotrombocitosi asintomatica ereditaria (Tvedten, 2012).

2. Piastrine attivate:Le piastrine parzialmente attivate, presentano dei processi citoplasmatici che protundono dal corpo sferico della cellula. Quando le piastrine sono completamente attivate, i granuli vengono circondati da una rete di microtubuli e microfilamenti, si forma,così, un aggregato centrale di granuli che può essere scambiato con un nucleo. Se avviene la degranulazione, gli aggregati possono essere difficili da distinguere e appaiono come materiale azzurofilo. La presenza di

aggregati piastrinici dovrebbe essere utilizzata per formulare un’adeguata conta piastrinica che risulterebbe, in caso contrario, erroneamente ridotta.

3.

strumento che possono determinare una pseudotrombocitopenia. Generalmente sono dovuti a difficoltà nel prelievo del campione, raramente alle agglutinine a freddo od al legame delle piastrine con i neutrofili (il cosiddetto satellismo piastrinico) (Lubas, 2011)

CAPITOLO 2

DISORDINI DEL

NUMERO DELLE

2.1 Le trombocitopenie

La trombocitopenia è definita come riduzione del numero di piastrine circolanti. Essa è la causa più comune di sanguinamento nel cane (Tvedten, 2012). La diminuzione del numero di piastrine può essere il risultato di una delle seguenti alterazioni:

• Ridotta produzione • Aumentato sequestro • Aumentato consumo

• Aumentata distruzione (Couto & Nelson, 2015)

2.1.1 Trombocitopenia da ridotta produzione

La trombocitopenia da ridotta o assente produzione è un risultato coerente con midollo osseo ipoplastico e aplastico (Harvey, 2012). Le piastrine originano da megacariociti presenti nel midollo osseo e in misura minore nel polmone (Russell, 2010). I megacariociti possono essere anormali a causa di una malattia generalizzata al midollo osseo oppure a causa di una specifica patologia a carico dei megacariociti che impedisce la normale trombopoiesi (Stockham & Scott, 2008). Le cause generiche di questo tipo di trombocitopenia sono: ipoplasia, aplasia o mielofibrosi midollare prodotte da farmaci (estrogeni, diuretici tiazidici, fenilbutazone, ciclofosfamide), agenti infettivi (erlichia canis e virus in genere), immunomediata, tossici chimichi endogeni e/o esogeni, ematopoiesi ciclica e irradiazione (Lubas, 2011). La causa infettiva più comune di trombocitopenia nei cani è l'ehrlichiosi. L’Infezione con Ehrlichia canis e, meno comunemente, E. ewingii e E. chaffeensis provocano trombocitopenia. Si pensa che inizialmente Ehrlichia canis causi distruzione di piastrine mediante meccanismi immuno-mediati. Poi, col progredire della malattia, l'agente causa l'aplasia del midollo osseo, con una conseguente diminuzione della produzione di piastrine (Baker, 2012). In genere questo tipo di trombocitopenia è preceduta da linfopenia e granulocitopenia (Lubas, 2011). La trombocitopenia dovuta a patologie del midollo osseo è costantemente caratterizzata da pancitopenia, bicitopenia o presenza di cellule ematiche anormali o di morfologia cellulare anormale, evidenziata con l’osservazione dello striscio di sangue periferico (Lewis, 2004). Altri esempi includono neoplasie mieloide, neoplasie linfoidi e mieloma multiplo. La Trombocitopenia può anche essere talvolta

secondaria all'estensione di metastasi dei linfomi, dei carcinomi e dei tumori delle cellule del tessuto mammario. Una diminuzione delle piastrine si vede anche in Cani Gray Collie con ematopoiesi ciclica ereditaria a causa della diminuzione intermittente della produzione di piastrine. Tuttavia, la trombocitopenia è minima, se presente, perché la diminuzione della produzione è breve rispetto alla durata della vita delle piastrine (circa 7-10 gg) (Hammond & Dale, 1980). Nel levriero sano, invece, la conta piastrinica risulta diminuita poiché ha un numero minore di piastrine rispetto ad altre razze (Zaldivar-Lopez, et al., 2011). Quindi nel levriero sano con una riduzione moderata della conta piastrinica (minore di 100.000/µl) non sono necessarie indagini appofondite per la ricerca di possibili cause di trombocitopenia (Couto & Nelson, 2015).

2.1.2 Trombocitopenia da sequestro o perdita

Circa un terzo delle piastrine circolanti è sequestrato nella milza (Jain, 1993). Non appena il volume splenico aumenta, si ha un incremento del sequestro piastrinico e la splenomegalia può causare trombocitopenia in relazione al sequestro. La trombocitopenia dovuta a splenomegalia è solitamente moderata e di nessuna importanza clinica. Non in tutti i casi la splenomegalia si associa alla trombocitopenia. Il grado di diminuzione delle piastrine nei cani con splenomegalia dipende dall’iniziale conta piastrinica, dalla gravità e dalla causa della splenomegalia. La trombocitopenia può comparire più facilmente nei casi di splenomegalia simmetrica (che coinvolge tutto l’organo), dovuta a congestione o a iperplasia piuttosto che nelle splenomegalie asimmetriche dovute a ematomi, iperplasia nodulare o neoplasia ematopoietica (Lewis, 2004). La trombocitopenia è comunque frequente nei cani con emangiosarcoma splenico (Grindem, et al., 1994). Il comparto piastrinico può essere assente nei casi di splenomegalia dovuta a infiltrazione cellulare diffusa, in seguito alla distruzione della componente vascolare da parte delle cellule neoplastiche. Altre cause di sequestro piastrinico comprendono la sespi e l’ipotermia (Lewis, 2004). Le cause delle trombocitopenie da perdita si riconoscono invece nell’emorragia grave, nella coagulazione intravasale disseminata (CID), nella formazione di trombi secondaria a danno vascolare e nell’aggregazione piastrinica secondaria ad infezioni (Lubas, 2011).

2.1.3 Trombocitopenia da aumentato consumo

La trombocitopenia da aumentato consumo di piastrine è stato rilevato in corso di CID, tromboembolismo, emangiosarcoma con o senza CID (Hammer , et al., 1991) e con lesioni vascolari comprese le vasculiti (Chisholm-Chait, 2000). Oltre al danno vascolare associato a determinate condizioni infiammatorie, alcune citochine infiammatorie, in particolare la PAF (platelet activating factor), promuovono l'aggregazione delle piastrine (Noguchi, et al., 1996). La trombocitopenia può essere presente a seguito di morso da parte di serpenti velenosi, in particolare della vipera (Willey & Schaer, 2005). I componenti del veleno possono indurre direttamente l'attivazione e l'aggregazione delle piastrine. L’attivazione e l’aggregazione piastrinica può avvenire anche in seguito ad un danno vasale indotto dal veleno (Rojnuckarin, 2008). Il veleno della vipera contiene vari componenti che possono promuovere o inibire i meccanismi emostatici, tra cui la coagulazione, la fibrinolisi, la funzione piastrinica e l'integrità vascolare. Alcuni serpenti, come la vipera presentano un veleno che causa inizialmente CID e successivamente sanguinamento (Harvey, 2012). La CID è la causa più comune di trombocitopenia da aumentato utilizzo. Essa è definita come un disordine trombo-emorragico sistemico associato a situazioni cliniche ben definite, con rilievi di laboratorio di attivazione dei fattori procoagulanti, di attivazione fibrinolitica e di consumo degli inibitori e con reperti biochimici di danno organico terminale (Bick, 1994). Il meccanismo coagulativo è innescato dal danneggiamento dei vasi ematici ed è costituito da una serie di proteine che intervengono nella cascata coagulativa. Il risultato finale di questo processo è la produzione di trombina attiva e la formazione di fibrina. Il danno alla parete vasale causa l’aggregazione piastrinica e fornisce una superficie specifica che inizia e stabilizza il processo coagulativo. La limitazione del processo coagulativo al sito del danno è importante per quanto riguarda la prevenzione della CID. Una volta prodotta, la trombina ha potenti proprietà proteolitiche che accelerano la formazione di fattori della coagulazione attivi come la protrombina. Quando si è formata una certa quantità di trombina s’innesca un meccanismo a feed-back positivo che stimola ulteriormente la coagulazione e la cascata coagulativa. Questo processo sfocerebbe in una CID se non fossero presenti anticoagulanti intravascolari in circolo. La CID si manifesta in conseguenza a numerosi stati eziologici (neoplasie, infiammazioni, infezioni, avvelenamenti, malattie immuno-mediate, colpi di calore, shock, ecc…) e in base all’interazione tra processo coagulativo e fibrinolisi. La CID può

presentare segni clinici variabili che vanno dal processo acuto fulminante al processo cronico di bassa intensità. La CID grave fulminante è caratterizzata da un sanguinamento generalizzato dagli orifici dell’organismo, petecchie o ecchimosi sulle mucose ed ematuria. Al contrario la CID cronica può essere accompagnata da segni clinici minimi oppure possono presentarsi segni collegati alle trombosi microcircolatorie o può essere osservata una tendenza al sanguinamento (Holloway, 2004)

2.1.4 Trombocitopenia da aumentata distruzione

La trombocitopenia dovuta ad un’aumentata distruzione di piastrine può essere divisa in base all’eziologia come immunomediata e non.

Tra le cause della trombocitopenia da aumentata distruzione non immunologica si riconoscono:

• Azione diretta lesiva sulle piastrine da parte di farmaci o di agenti infettivi in combinazione con un danno vascolare; ciò determina l’aggregazione e la frammentazione delle piastrine o una contemporanea lesione endoteliale da parte degli agenti infettivi patogeni;

• Vaccinazione con virus vivi attenuati, che provoca aggregazione delle piastrine e il loro allontanamento da parte del sistema macrofagico-monocitario (Lubas, 2011) Moltissimi sono i farmaci che possono interferire con la funzione piastrinica. Tra questi il più comune è sicuramente l’acido acetilsalicilico che in alcuni casi è prescritto per la sua azione antitrombotica (Stokol, 2004). L’infusione intravenosa di eparina non frazionata nel cavallo causa una severa trombocitopenia (Harvey, 2012). È stato osservato come un sovradosaggio di ciclofosfamide possa portare ad una importante (Wells, et al., 2014). Esistono altri farmaci chemioterapici che possono indurre trombocitopenia come la lomustina o la doxorubicina (Harvey, 2012). Un trattamento prolungato con azatioprina può determinare anch’esso trombocitopenia (Wallisch & Trepanier, 2015). Farmaci antielmintici come l’albendazolo, antinfiammatori non steroidei come il carprofen possono essere responsabili di trombocitopenia. Moltissimi inoltre sono gli agenti infettivi che causano una riduzione delle piastrine. La trombocitopenia è presente spesso durante infezioni protozoarie acute degli eritrociti

quali Babesia, Theileria, Cytauxzoon e durante infezioni da rickettsie dei leucociti quali Erlichia, Rickettisia o Anaplasma. Rickettsia rickettsii invade e replica all'interno delle cellule endoteliali, con conseguente danno vasale e vasculite, seguito da attivazione delle piastrine e coagulazione. L’Anaplasma Platys è l’unico agente patogeno studiato sia nell’uomo che negli animali che invade e infetta direttamente le piastrine. Esso può apparire come un’inclusione blu nelle piastrine se lo striscio è stato colorato con Wright-Giemsa o Nuovo Blu di Metilene. Il periodo prepatente varia da 1 a 2 settimane dopo l'iniezione sperimentale con sangue infetto. La parassitemia ciclica e trombocitopenia concomitante si verificano a intervalli da 1 a 2 settimane. Le piastrine infettate si trovano facilmente durante l’iniziale parassitemia, ma le parassitemie successive hanno percentuali decrescenti di piastrine infettate, rendendo difficile il riconoscimento delle morule all'interno delle piastrine (Harvey, et al., 1978). La conta delle piastrine di solito rimane inferiore a 20.000 / μL solo per 1 o 2 giorni, prima di aumentare rapidamente. La trombocitopenia è stata osservata anche in infezioni virali come il parvovirus (Yilmaz & Senturk, 2007). Le infezioni batteriche, come le salmonelle, le leptospirosi, Escherichia coli e cause varie di endotossiemia e sepsi, possono indurre piastrinopenia, come risultato di una DIC. Le trombocitopenie sono indotte anche da malattie fungine quali istoplasmosi e candidosi disseminata (Ettinger & Feldman, 2007).

Tra le cause di questa forma di piastrinopenia possiamo distinguere:

• Forme primarie o autoimmuni con formazione di autoanticorpi antipiastrina diretti e aderenti alla superficie dei trombociti (ITP).

• Forme secondarie ad infezioni (virali), immunocomplessi (Ehrlichia canis), neoplasie (linfoma), somministrazione di farmaci(Fenilbutazone). In questi casi non vi è l’azione di anticorpi antipiastrine ma si ha l’unione tra l’aptene patogeno e la membrana piastrinica (per affinità o per assorbimento). Di conseguenza l’organismo produce anticorpi specifici che si legano alla piastrina determinando un aumento della fagocitosi da parte dei macrofagi.

• Lupus eritematoso sistemico o in correlazione con anemia emolitica immunomediata (IMHA) (Lubas, 2011)

La diagnosi di trombocitopenia immuno-mediata idiopatica o primaria viene fatta dopo che tutte le altre cause potenziali sono state eliminate. La distruzione immunitaria delle

piastrine si verifica quando le piastrine circolanti sono attaccate dagli anticorpi del soggetto e vengono fagocitate da macrofagi nella milza, nel fegato e nel midollo osseo. La milza è il più grande organo linfoide, il principale sito di produzione di anticorpi e di rimozione delle piastrine. L'aggregazione delle piastrine, la fagocitosi o la lisi che provocano la distruzione di piastrine e la trombocitopenia possono verificarsi indipendentemente dagli eventi immuno-mediati. La distruzione di piastrine mediata da meccanismi immuno-mediati si verifica in alcune infezioni batteriche e virali acute e nelle malattie cardiovascolari. La trombocitopenia che si verifica successivamente al morso di vipera può essere secondaria a DIC o può derivare dall'aggregazione diretta delle piastrine. L'attivazione piastrinica con trombocitopenia è riportata durante ustioni gravi ed estese. La distruzione di piastrine nelle infezioni batteriche può verificarsi a seguito di aderenza o aggregazione delle piastrine a monociti o neutrofili attivati (Russell, 2010). Nelle infezioni da Gram-negativi, i monociti stimolati dalle endotossine esprimono il fattore tissutale sulla loro superficie e generano trombina (Schwartz & Monroe, 1986). La trombina, potente attivatore piastrinico, provoca l'attivazione e l'aggregazione delle piastrine. Le piastrine aderiscono ai monociti e sono fagocitate. La stimolazione dei neutrofili non è ritenuta una principale causa di rimozione delle piastrine e probabilmente è più importante per quanto riguarda la funzionalità piastrinica e la formazione di trombi (Henson, 1990). Le esotossine rilasciate dai batteri Gram-positivi possono danneggiare direttamente le piastrine e contribuire alla trombocitopenia. Nell'uomo, le piastrine possono essere danneggiate e distrutte con mezzi meccanici in patologie dei vasi arteriosi con superfici endoteliali danneggiate e microcircolazione ridotta, valvole cardiache stenotiche o durante la chirurgia di impianto di by-pass cardiaci (Russell, 2010).

CAPITOLO 3:

TROMBOCITOPENIA

IMMUNO-MEDIATA

3.1. Eziopatogenesi della IMT

La Trombocitopenia immuno-mediata è una malattia in cui gli anticorpi si legano alla superficie delle piastrine causandone una prematura distruzione da parte dei macrofagi (Lewis, 2004). Esiste una chiara predisposizione genetica alle malattie autoimmuni in un certo numero di specie. Alcune malattie autoimmuni hanno una maggiore prevalenza in alcune razze umane e sono ereditate all'interno delle famiglie. Allo stesso modo, particolari razze di cani sono suscettibili alle malattie autoimmuni e queste si verificano spesso nelle linee di cani con pedigree. Le malattie autoimmuni canine sono spesso perpetuate all'interno di gruppi genealogici a causa dell'allevamento di determinate linee. La stessa suscettibilità di razza è spesso riconosciuta a livello internazionale a causa dell'effetto "fondatore" in base al quale gli allevamenti correlati sono diffusi in diversi paesi per formare la base di un gruppo di razza in quell'area geografica. Questo stock potrebbe essere stato selezionato per un fenotipo di razza ottimale, ma potrebbe portarsi dietro anche geni associati alla malattia che vengono poi perpetuati nella popolazione. Un esempio classico di una razza predisposta è il Cocker Spaniel che è riconosciuta a livello internazionale come suscettibile alle citopenie autoimmuni (Day & Schultz, 2014). È riconosciuta una predisposizione del sesso femminile per molte malattie autoimmuni e l’IMT primaria si manifesta nelle femmine circa il doppio delle volte rispetto al maschio (Lewis, 2004). Sia nei cani che nell’uomo le malattie autoimmuni si sviluppano in età avanzata. I cani anziani mantengono la capacità di produrre risposte immunitarie umorali e spesso hanno una produzione di IgG elevata. Al contrario, vi è una riduzione della funzione immunitaria mediata dalle cellule e uno spostamento dell'equilibrio delle cellule T del sangue, con un numero relativamente maggiore di cellule T CD8 + e un numero inferiore di cellule T CD4 +. Se la popolazione in declino delle cellule CD4 + include Linfociti T soppressori (che sono una sottopopolazione di cellule T deputate a modulare il sistema immunitario) ciò potrebbe chiaramente spiegare un aumento della reattività autoimmune (Day & Schultz, 2014). Nonostante le cause della ITP siano varie la maggior parte dei casi hanno in comune lo stesso meccanismo che porta ad una diminuzione delle piastrine circolanti. Infatti, in caso di IMT, si rilevano alti livelli di anticorpi che portano ad un aumento della distruzione delle piastrine da parte del sistema reticolo-endoteliale. Tale distruzione avviene principalmente nella milza, la quale, anche in condizioni fisiologiche rappresenta il sito in cui le piastrine senescenti vengono eliminate; è anche

un organo di sequestro/deposito nel quale si trovano, nel cane, circa 1/3 delle piastrine circolanti (McMillan, et al., 1974). L'IMT può essere primaria (autoimmune) o può verificarsi secondariamente a infezioni batteriche, virali, da protozoi o da elminti, neoplasia o somministrazione di farmaci. Nell'IMT primaria, gli autoanticorpi reagiscono ai normali antigeni piastrinici (Harvey, 2012). Le glicoproteine(GP) IIb e / o IIIa sono state riconosciute come antigeni bersaglio in alcuni cani (Lewis & Meyers, 1996). Il complesso GP IIb / IIIa è il recettore del fibrinogeno essenziale per la normale aggregazione piastrinica. Questo può aiutare a spiegare la disfunzione piastrinica che è stata valutata nei cani con IMT primaria. L’IMT secondaria può verificarsi se gli anticorpi sono prodotti contro un antigene estraneo legato alle piastrine, o se gli anticorpi stanno reagendo agli antigeni piastrinici alterati nel corso di una patologia (Putsche & Kohn, 2008). Normalmente in cani sani il numero di piastrine varia tra 200.000 ed i 500.000/µl, con l’eccezione di alcune razze in cui il numero risulta ridotto (es. Cavalier King Charles Spaniel e Greyhounds); la loro vita media è di 8-12 giorni. In campo umano si è visto che in condizioni fisiologiche le piastrine hanno una vita media di 6-8 giorni che si riduce ad 1 giorno in corso di IMT (Zoia, 2013). A seguito di IMT nuove piastrine vengono messe in circolo da parte del midollo per compensare l’aumentata distruzione. Nonostante nell’uomo e nel cane la trombopoiesi risulti aumentata in molti casi, in 1/3 dei pazienti umani con IMT la trombopoiesi rimane a livelli submassimali. Tale osservazione trova riscontro anche nei cani con IMT dove spesso le biopsie midollari mostrano un numero diminuito di megacariociti (Lewis, 2004). Questo fenomeno può essere in parte dovuto, almeno in alcuni casi, ad una contemporanea distruzione, su base immuno-mediata, non solo delle piastrine ma anche dei loro precursori midollari (Zoia, 2013).

3.2 Caratteristiche clinico-patologiche della IMT

3.2.1 Segnalamento e Anamnesi

L’ IMT primaria può verificarsi nei cani di tutte le età ma più frequente nei cani di mezz’età, con una media dai 4 agli 8 anni (Scott & Jutkowitz, 2010). Le femmine intere o castrate sono colpite il doppio rispetto ai maschi. Un’alta incidenza di IMT primaria è stata riscontrata nel Cocker Spaniel, nel Pastore Tedesco, nel Barboncino standard, nano e toy e nel Bobtail anche se è bene ricordare che può colpire qualsiasi razza compresi i

meticci. Gli episodi di IMT primaria sono preceduti da eventi stressanti come il ricovero in canili, le temperature ambientali estreme, i cambiamenti ormonali (estro, pseudogravidanza, parto) e gli interventi chirurgici. Non è stata evidenziata invece un’incidenza stagionale (Lewis, 2004) ne un collegamento con l’ambiente: in medicina umana esiste una correlazione tra malattie immuno-mediate e la vita in aree urbane. Questa correlazione non è stata osservata in uno studio del 2017 nei cani (Jeffery, 2017).

3.2.2 Esame Fisico

La maggior parte dei cani con IMT primaria viene presentata a causa di petecchie che coinvolgono la cute e le superfici delle mucose. Potrebbero avere anche emorragie che possono sorgere spontaneamente o potrebbero essere un prolungamento patologico del sanguinamento a seguito di vari eventi come estro, parto o un semplice prelievo venoso. Altri segni non specifici includono letargia, anoressia, rigidità, collasso o debolezza. La trombocitopenia può anche essere scoperta casualmente durante i controlli sanitari di routine come gli screening preoperatori o la valutazione medica di problemi non correlati. Perfino i cani con concentrazioni piastriniche inferiori a 10.000 / μ L possono essere attivi e vigili senza segni clinici di malattia. L'esame fisico dei cani più colpiti rivela petecchie, ecchimosi, epistassi, emorragia gastrointestinale (melena, ematemesi, ematochezia), emorragia orale, sanguinamento vaginale, emottisi e / o ematuria. Le petecchie sono particolarmente comuni sulle mucose orali, addome, arti interni e padiglioni auricolari, dove possono essere scambiati per un'eruzione cutanea. Anche le lesioni oculari sono comuni e variano da una lieve emorragia congiuntivale, sclerale, iridea o retinica a ifema, grave emorragia retinica, distacco retinico e cecità. Quando l'emorragia è abbastanza grave da causare anemia, sono visibili altri segni come pallore, intolleranza all'esercizio, tachicardia, soffio sistolico fino ad arrivare nei casi gravissimi a shock ipovolemico (Scott & Jutkowitz, 2010). Non è possibile prevedere la gravità dell’emorragia sulla base del conteggio piastrinico (Lewis, 2004). L'emorragia intracranica e del midollo spinale sono rare ma possono portare a prognosi infauste e possono essere sospettate quando vediamo segni clinici neurologici (Scott & Jutkowitz, 2010).

3.3 Diagnosi della IMT

Una diagnosi di IMT primaria viene effettuata dopo aver escluso altre potenziali cause di IMT (Harvey, 2012). I tipi di test diagnostici variano a seconda delle informazioni cliniche e della localizzazione delle lesioni, ma tipicamente includono: CBC, profilo chimico, analisi delle urine, profilo emostatico, radiografia addominale e toracica, ecoaddome per valutare un eventuale splenomegalia e neoplasie occulte, valutazione per agenti infettivi mediante emocoltura, sierologia o test molecolari, come indicato. Può essere indicato l'esame del midollo osseo, nonché i test per gli anticorpi antipiastrine. Gli strisci di sangue dovrebbero essere valutati per confermare le concentrazioni piastriniche che vengono valutate con macchine laser automatizzate ed escludere la pseudotrombocitopenia. Quest’ultima può verificarsi nel caso in cui ci siano degli aggregati piastrinici dovuti ad un prelievo traumatico oppure perché ci sono piastrine più grandi della normale soglia alla quale è impostato l’analizzatore automatico (Scott & Jutkowitz, 2010). In assenza di un test anticorpale antipiastrinico, una diagnosi presuntiva di IMT primaria è spesso confermata da una risposta positiva alla terapia con glucocorticoidi da solo o in combinazione con farmaci immunosoppressori (tra cui vincristina, azatioprina, ciclofosfamide) o dopo splenectomia. L'IMT primaria può verificarsi in associazione con l'IMHA (Immune-Mediated Hemolytic Anemia) primario in quella che è stata definita la sindrome di Evans nella letteratura scientifica umana. Tuttavia, è importante riconoscere che gli animali con IMHA possono avere trombosi o DIC, che possono spiegare la concomitante trombocitopenia (Harvey, 2012). Sicuramente è importante effettuare un’accurata anamnesi del paziente che deve includere l'esposizione a sostanze tossiche, vaccinazioni recenti, viaggi recenti, recenti contatti con altri cani, precedenti trasfusioni, condizioni mediche precedenti ed attuali ed esposizione alle zecche (Scott & Jutkowitz, 2010).

Per confermare la diagnosi di IMT nel cane possono essere utilizzati diversi criteri tra cui:

a) gravità della trombocitopenia b) presenza di microtrombocitosi

c) numero normale o aumentato di megacariociti nel midollo osseo

d) conta piastrinica aumentata in seguito a trattamento con glucocorticoidi a dose immunosoppressive

e) rilevamento di autoanticorpi antipiastrine

f) esclusione di altre cause di trombocitopenia (Lewis, 2004)

a)

Nel complesso, le concentrazioni piastriniche nei cani con IMT sono state segnalate in vari studi significativamente inferiori rispetto a quelle dei cani con presunte trombocitopenie non immuni (Scott & Jutkowitz, 2010). Tuttavia il grado della trombocitopenia da sola non può essere considerato un sicuro indicatore diagnostico di IMT primaria o secondaria (Lewis, 2004).

b) Presenza di microtrombocitosi

La presenza di una popolazione predominante di piccole piastrine detta microtrombocitosi, con MPV (Volume Piastrinico Medio) basso è riportato essere un fattore specifico della IMT nel cane (Northern jr & Tvedten, 1992). In questo studio si evince come sia stata riscontrata solo nel 50% dei casi che sono stati analizzati. Tuttavia valori di MPV molto bassi non sono stati visti in cani con trombocitopenie non immuno-mediate (Scott & Jutkowitz, 2010). Sebbene nel cane la microtrombocitosi possa aumentare il sospetto diagnostico di IMT, è improbabile invece che sia di aiuto per differenziare le cause di IMT primaria da quelle secondarie di IMT.

c) Numero normale o aumentato di megacariociti nel midollo osseo

La valutazione del midollo osseo non è necessaria nella maggior parte dei cani sospettati di avere IMT primaria. I riscontri di anomalie dei megacariociti non sono specifici per IMT primaria e le anomalie non megacariocitiche sono rare nei cani nei quali la IMT primaria è la principale ipotesi diagnostica. La valutazione del midollo osseo può essere indicata inizialmente per rilevare altre cause di trombocitopenia o dopo il trattamento in quei cani che non rispondono bene alla terapia di routine. La stima dei megacariociti midollari è soggettiva e dipende dalla qualità del campione. Stime affidabili dovrebbero essere ottenute con campioni rappresentativi o campioni di aspirato contenenti molte particelle di midollo. Tuttavia, i numeri dei megacariociti possono essere sottostimati nei campioni di aspirato con poche o nessuna particella perché i megacariociti tendono ad aggregarsi nelle spicule oppure perché sono attaccati immunologicamente. Rispetto agli aghi aspirati, le sezioni centrali consentono una

migliore differenziazione dei numeri dei megacariociti. Nell'IMT primaria, i megacariociti sono solitamente presenti in numero normale o aumentato (Scott & Jutkowitz, 2010). La trombocitopenia non è una controindicazione per un agoaspirato midollare o una biopsia “a core”, poiché è raro che si provochi un’emorragia importante e, di solito, può essere controllata con una compressione locale (Lewis, 2004)

d) Conta piastrinica aumentata in seguito alla terapia con glucocorticoidi a dose

immunosoppressiva

La maggior parte dei cani con ITP avrà una conta piastrinica superiore a 100 x 109/L entro 7 giorni dall’inizio del trattamento con glucocorticoidi a dosi immunosoppressive. Tuttavia, poiché la principale azione dei glucocorticoidi è quella di impedire la fagocitosi delle piastrine sensibilizzate dagli anticorpi da parte dei macrofagi, l’IMT primaria e quella secondaria rispondono analogamente. (Lewis, 2004)

e) Rilevamento di autoanticorpi antipiastrine

L’esame del fattore piastrinico 3(platlet factor 3 PF3) è basato sul principio che in un campione di plasma da saggiare, le piastrine normali del cane verranno danneggiate da IgG legate alle piastrine e rilasceranno PF3 (Lewis, 2004) .Era uno dei primi test, un test funzionale indiretto non sensibile e non specifico che non può essere raccomandato. (Scott & Jutkowitz, 2010)

L’esame di immunofluorescenza diretta sui megacariociti rileva le IgG legate ai megacariociti e ha una sensibilità variabile nei cani con IMT primaria. Il principale svantaggio è che è necessario un prelievo di midollo osseo. Inoltre è stato dimostrato che la sensibilità di questo test per la diagnosi di IMT è circa del 50%, il che lo rende un esame poco affidabile (Kristensen, et al., 1994). Il metodo più usato, invece, è il rilevamento di un’aumentata concentrazione di IgG( ma anche IgM) legate alle piastrine. È una metodica estremamente sensibile (90% circa) per l’IMT (Lewis, et al., 1995). Sono stati progettati come test diretti che valutano gli anticorpi sulle piastrine dei pazienti o come test indiretti che valutano gli anticorpi nel plasma o nel siero del paziente che si legano alle piastrine da individui sani. Le analisi dirette sono generalmente migliori alle analisi indirette nella valutazione dell'IMT (Scott & Jutkowitz, 2010). Infatti gli esami per le IgG leganti le piastrine sono meno sensibili delle analisi per le IgG legate alle piastrine, probabilmente perché molte IgG leganti le piastrine sono adese alle piastrine e sono poche quelle che rimangono libere in circolo

(Lewis, 2004). I test diretti che utilizzano la citometria a flusso per rilevare le IgG e IgM legate alle piastrine sono i metodi più comuni attualmente in uso per i campioni di sangue di cane.

La letteratura umana più recente suggerisce che il test per le IgG legate alle piastrine otrebbe essere utile come test di screening per IMT a causa della sua alta sensibilità. Un risultato negativo, infatti, esclude un meccanismo immuno-mediato come base per la distruzione delle piastrine (Hézard, et al., 2008). Uno studio di ematologia umana suggerisce come la positività al test per la ricerca diretta delle IgG legate alle piastrine effettuato tramite citometria a flusso sia molto utile per lo screening di IMT, in particolare per la sua specificità (Nishioka, et al., 2005). In Italia il laboratorio San Marco di Padova da anni utilizza la citometria a flusso per la ricerca diretta di anticorpi IgG e IgM legati alle piastrine. (Sito web Laboratorio San Marco, Dicembre 2017). L’impiego della citometria a flusso consente di rilevare l’eventuale presenza di anticorpi(IgG/IgM) sulla superficie delle piastrine. La determinazione diretta delle immunoglobuline legate alla superficie piastrinica mediante citometria a flusso può distinguere alcuni casi di trombocitopenia immuno-mediata da alcuni di trombocitopenia non immuno-mediata (Latimer, 2011). NeI campioni conservati per più di 24 ore aumentano le immunoglobuline (soprattutto igG) legate alla superficie piastrinica; tuttavia l'interpretazione dei valori del test è valida se basata su intervalli di riferimento di 24 ore, che devono essere stabiliti nel singolo laboratorio (Wilkerson, et al., 2001). Uno dei limiti di questo test è che un contatto prolungato con i leucociti prima della separazione del plasma, può determinare un’attivazione piastrinica (Tarnow, et al., 2008). Per questo il test deve essere effettuato al massimo entro 24 ore dal prelievo. Quello che sicuramente si evince dalla letteratura è che non esiste un metodo per differenziare l’IMT primaria da una IMT secondaria se non grazie all’anamnesi, alla clinica, agli esami di laboratorio e all’esclusione di altre cause. (Stockham & Scott, 2008).