Messa a punto di un metodo cromatografico di purificazione del Fattore di von
Willebrand
Riassunto
Il Fattore di von Willebrand (vWF) è una glicoproteina plasmatica, presente con una concentrazione di 5-10µg/ml. Il vWF, oltre a promuovere l’adesione e l’aggregazione piastrinica, è indispensabile per la stabilizzazione e la sopravvivenza del Fattore VIII (FVIII), perché lo protegge dall’attacco delle proteasi plasmatiche. Una ridotta o alterata sintesi del vWF, porta alla patologia di von Willebrand, che ha un’incidenza di 1:5000 persone.
Proprio a causa della stretta correlazione tra FVIII e vWF le due proteine vengono di norma co-purificate ed in commercio si trovano soprattutto concentrati di FVIII/vWF per curare alcuni sottotipi della patologia di von Willebrand.
La purificazione del vWF è abbastanza difficoltosa, a causa della sua particolare struttura, (circola in forma di multimeri), del suo PM che varia tra i 500 e 20000 kDa e delle sue proprietà adesive. Attualmente in commercio esiste un solo farmaco contenente il vWF altamente purificato, senza il FVIII. L’oggetto di questo studio è la messa a punto di un processo cromatografico efficiente, scalabile a livello industriale, che permetta di ottenere una preparazione di vWF ad elevato grado di purezza.
Il materiale di partenza scelto è una frazione arricchita in vWF, ottenuta durante la purificazione cromatografica di FVIII, con una concentrazione ancora elevata di proteine contaminanti, in particolare di Fibronectina.
Sono state testate varie resine per questa purificazione e quella che ha dato migliori risultati è stata la resina Fractogel EMD-TMAE-(M).
Una volta purificato il vWF, il prodotto così ottenuto è stato caratterizzato in termini di contenuto di vWF presente mediante metodi Immunoturbinimetrici e visualizzazione dei multimeri effettuata tramite Western Blot. Inoltre il contenuto di Immunoglobuline, Fibrinogeno e Fibronectina è stato misurato mediante metodi Nefelometrici, e l’attività del FVIII è stata determinata mediante test cromogenici.
Le caratteristiche del vWF purificato e le concentrazioni di proteine inquinanti sono state messe a confronto con quelle del prodotto già in commercio.
