PURIFICAZIONE Cromatografia Esplorando le proteine

Cromatografia

Flavia Frabetti Tecnici di laboratorio 2010/2011

Esplorando le proteine

Un passaggio indispensabile negli studi di biochimica che necessitano di conoscere la sequenza aa di una proteina per potere spiegare la sua struttura tridimensionale e dunque il suo funzionamento è la

PURIFICAZIONE della proteina di interesse

Tre metodi chiave: cromatografia elettroforesi

ultracentrifugazione

CROMATOGRAFIA

• metodo fisico di separazione dei componenti di una miscela complessa

• può essere analitica o preparativa

• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema cromatografico

fase stazionaria impaccata in un letto cromatografico fase mobile

sistema di distribuzione della fase mobile sistema di rilevazione

• di solito per arrivare alla purificazione completa di una sostanza si deve usare una sequenza di più metodi cromatografici

• il fondamento di tutte le tecniche cromatografiche è il coefficiente di ripartizione (o coefficiente di distribuzione) Kd che descrive come il composto si distribuisce tra due fasi immiscibili.

I singoli componenti di una miscela vengono separati sulla base di differenti CARATTERISTICHE FISICHE:

dimensione e forma carica

volatilità solubilità

affinità di legame per molecole specifiche la separazione dei singoli componenti di una miscela è resa possibile

Eluire = lavare via, staccare via, distaccare una sostanza dalla fase stazionaria alla quale ha aderito per una specifica affinità

Fase = componente del sistema caratterizzato da una uniforme composizione chimica e proprietà fisiche (densità, struttura cristallina, ecc.)

miscela

fase

stazionariafase mobile rilevatore

Si inietta una miscela da analizzare su una colonna I componenti avanzano a diverse velocità attraverso il mezzo di conduzione ovvero la fase mobile, a seconda del grado di affinità per la fase stazionaria, il tempo di uscita verrà registrato dal rilevatore

Tipologie dei sistemi cromatografici

forma del letto cromatografico

natura delle fasi mobile o stazionaria

metodo di separazione

Forma del letto cromatografico es. su strato sottile (es.carta) o su colonna

Tipologia-classificazione

aggiunta caricamento

Cromatografia

su CARTA Cromatografia

su STRATO

Metodo di separazione o ripartizione

• separazione sulla base della solubilità di molecole piccole

• ripartizione tra due fasi liquide: acqua che permea una matrice solida inerte + fase mobile organica non polare

• cromatografia a fase inversa (vedi HPLC): la fase stazionaria non polare

matrice inerte di supporto

fase stazionaria liquida

flusso della fase mobile

molecole non polari che si sciolgono nella fase

stazionaria

molecole polari che passano velocemente attraverso la colonna

Metodo di separazione 2) cromatografia per gel permeazione (o esclusione molecolare)

• separazione sulla base della dimensione

• fase stazionaria = granuli porosi di un polimero insolubile ma molto idratato

fase stazionaria gel microporoso

molecole piccole che hanno

accesso all’intera matrice molecole medie che hanno accesso solo ai pori più larghi

molecole grandi che sono totalmente escluse dai pori e passano rapidamente attraverso la colonna

Metodo di separazione 3) cromatografia a scambio ionico

• separazione sulla base della carica

• fase stazionaria = colonne con resine:

cariche + (es.dietilamminoetil-cellulosa o DEAE-cellulosa) oppure

cariche - (es.carbossimetil-cellulosa o CM-cellulosa)

flusso della fase mobile

cationi (+) del campione che vengono trattenuti dalla

colonna

+

+ +

_

_ _

_

_ _

_

_ _

+ +

- -

- - -

fase stazionaria resina a scambio cationico

Separazione di aa in una colonna a scambio cationico

Colonna a scambio cationico

• separazione sulla base ad una affinità chimica di legame

• fase stazionaria = colonne dove viene immobilizzato un ligando specifico per una certa molecola che ha una struttura complementare che specificamente riconosce quel ligando

flusso della fase mobile fase stazionaria:

matrice solida di supporto tratto spaziatore ligando

tutti gli altri soluti vengono eluiti

molecola complementare legata da interazioni specifiche

al ligando

Tipologia-classificazione

Natura delle fasi mobile o stazionaria

fase stazionaria: solido/gel o liquido fase mobile: liquido o gas

liquida solida

Cromatografia a

liquida solida

Cromatografia su strato sottile (TLC)

liquida liquida

Cromatografia liquida (LC)

gas Solida o

liquida Gascromatografia

Fase mobile Fase

stazionaria

Tipo es.

Tipologia-classificazione

Natura delle fasi mobile o stazionaria

cromatografia liquida-liquida:

HPLC cromatografia ad alta performance

o cromatografia liquida ad alta pressione

esempi:

cromatografia gas -liquida:

gas-cromatografia

fase stazionaria: solido/gel o liquido fase mobile: liquido o gas

carrier gas

pompa ^colonna

rilevatore

Fase stazionaria solida

Esempio di un cromatogramma

Deve avere una buona risoluzione

inizio

t’_R1 Δt t_M

picco di un soluto

non trattenuto t_R = tempo di ritenzione

t

= tempo di ritardo della fase mobile t’

= t

-t

Δt = distanza tra i 2 picchi

RISOLUZIONE R= Δt W_b1+W_b2

2 se R = 1.5 separazione completa

W_b1 W_b2