2.1 Cellule rese competenti mediante trattamento con RbCl
Questo protocollo permette il raggiungimento dello stato di competenza da parte delle cellule di E. coli (ceppo DH5α) per l'acquisizione di vettori plasmidici esogeni. Inizialmente una colonia cresciuta su terreno solido per una intera notte (“Over Night” o O/N) viene inoculata in 50 ml di terreno liquido contenuto in una beuta. La crescita viene fatta avvenire a 37 °C in agitazione fino al raggiungimento della densità ottica (OD) di 0,2 alla lunghezza d'onda di 600 nm. Successivamente la crescita viene arrestata ponendo la beuta in ghiaccio per 3 minuti. Utilizzando un tubo sterile già raffreddato a 4 °C, la crescita viene sedimentata (formando un “pellet”) centrifugandola per 10 minuti a 5000 giri per minuto (“revolution per minute, rpm) alla stessa temperatura. Il sovranatante viene scartato e il “pellet” ottenuto viene risospeso con metà del volume iniziale (25 ml) di RbCl 50 mM freddo. La sospensione viene mantenuta in ghiaccio per 30 minuti e nuovamente centrifugata in tubo sterile per 10 minuti a 5000 rpm alla temperatura di 4°C. Il sovranatante viene eliminato mentre il “pellet” viene risospeso in circa un cinquantesimo del volume iniziale (0,8 ml) di RlCl 50 mM freddo. Questa sospensione viene aliquotata in volumi di 400 µl e conservata a –80°C in glicerolo al 10%.
2.2 Trasformazione batterica delle cellule rese competenti con
RbCl
A 200 μl di sospensione cellulare vengono aggiunti 5-20 ng di plasmide. La soluzione viene miscelata con cura e incubata in ghiaccio per 30 minuti. Trascorso questo tempo si sottopone la sospensione a “shock” termico (“heat shock”) mantenendola per 45 secondi alla temperatura di 42 °C e riponendola nuovamente in ghiaccio per 5 minuti. A questo punto vengono aggiunti 800 µl di LB preriscaldato a 37°C e la soluzione viene posta in agitazione per 1 ora in stufa. Trascorso questo
maggior parte del sovranatante viene scartato, mentre il brodo rimanente viene utilizzato per risospendere il “pellet” e per piastrarlo su terreno solido selettivo, a causa della presenza di un antibiotico, in una piastra Petri. La selettività è conferita dalla sensibilità che il ceppo batterico utilizzato possiede nei confronti dell'antibiotico. La sopravvivenza è garantita alle sole cellule che hanno acquisito il plasmide che conferisce loro la resistenza all'antibiotico. Queste cellule, dopo un'incubazione a 37 °C O/N, formano delle colonie sulla superficie del terreno solido. La selettività dell'antibiotico e l'assenza di contaminazioni da parte di batteri resistenti vengono verificati in ogni esperimento di trasformazione utilizzando un'aliquota di cellule alle quali non è stato aggiunto il plasmide e che subiscono lo stesso trattamento in parallelo con il campione. Questo controllo non deve produrre alcuna crescita batterica.
Terreni di coltura:
Luria-Bertani Broth (LB):NaCl 1%
bacto tryptone 1% bacto yeast extract 0,5%
Bottom Agar:
agar 1,5% in LB
Antibiotico:
2.3 Plasmide pCS2+
Il plasmide pCS2+ è un vettore di espressione utilizzato per dirigere l'espressione di proteine in
Xenopus a partire dalla microiniezione dell'mRNA o del DNA. Esso contiene un promotore forte
proveniente da “simian citomegalo virus (CMV) IE94” seguito da una regione “polylinker” e dal sito di poliadenilazione proveniente da SV40. È presente un promotore per la RNA polimerasi SP6 nella regione 5' non tradotta dell'mRNA proveniente dal promotore “sCMV” che consente di trascrivere in vitro le sequenze clonate nella regione “polylinker”. Il promotore T7 presenta un orientamento inverso rispetto a SP6 ed è situato tra il sito di poliadenilazione di SV40 e la regione “polylinker” e consente la trascrizione in vitro di RNA antisenso. Inoltre è presente una seconda regione “polylinker” situata dopo il sito di poliadenilazione di SV40 che consente di linearizzare il plasmide per consentire la trascrizione in vitro dei costrutti clonati. Il vettore deriva dal “pBluescript II KS+” e include un gene di resistenza all'ampicillina “ampr” e un origine “f1” per il
DNA a singolo filamento.
I “cap”-mRNA ottenuti per trascrizione in vitro da questo plasmide, a partire dal promotore SP6 e linearizzato, in genere con Asp718 o NotI, sono molto più stabili e consentono un'efficienza di traduzione 10 volte maggiore rispetto agli altri mRNA a causa della forte efficienza di poliadenilazione guidata, all'interno delle cellule, dalla presenza del segnale di poliadenilazione proveniente da SV40.
2.4 Cloni
pCS2+.Xnoggin Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro per saggi
di sovraespressione. Contiene un inserto di circa 1 kb clonato EcoRI-StuI. Per la trascrizione del filamento senso il plasmide è stato linearizzato con NotI e trascritto mediante il promotore di SP6 (Smith e Harland, 1992) .
pCS2+.Otx2 Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro per saggi di sovraespressione. L'inserto è clonato EcoRI. Per la trascrizione del filamento senso il plasmide è stato linearizzato con NotI e trascritto mediante il promotore di SP6 (Viczian et al., 2003).
pCS2+.Rx1 Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro per saggi di sovraespressione. L'inserto di 995 bp è clonato BamHI-XbaI. Per la trascrizione del filamento senso il plasmide è stato linearizzato con NotI e trascritto mediante il promotore di SP6 [Casarosa et al., 2003].
pCS2+.Six3 Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro per saggi di sovraespressione. L'inserto di 873 bp è clonato ClaI-EcoRI. Per la trascrizione del filamento senso il plasmide è stato linearizzato con Asp718 e trascritto mediante il promotore di SP6 (Zuber et al., 2003).
pCS2+.Pax6 Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro per saggi di sovraespressione. Per la trascrizione del filamento senso il plasmide è stato linearizzato con NotI e trascritto mediante il promotore di SP6 (Altmann et al., 1997).
pCS2+.tll Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro per saggi di sovraespressione. L'inserto di 1155 bp è clonato EcoRI-XhoI. Per la
trascrizione del filamento senso il plasmide è stato linearizzato con NotI e trascritto mediante il promotore di SP6 (Hollemann et al., 1998).
pCS2R.XET Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro per saggi di sovraespressione. Per la trascrizione del filamento senso il plasmide è stato linearizzato con NotI e trascritto mediante il promotore di SP6 (Zuber et al., 2003).
pBSKSII.bB1-Crystallin Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro di
sonde marcate per esperimenti di ibridazione in situ “whole mount”. Il plasmide contiene un inserto di circa 265 bp codificante per la β-B1-Cristallina, clonato EcoRI-BamHI. Per la trascrizione del filamento antisenso il plasmide è stato linearizzato con HindIII e trascritto mediante il promotore di T7 (Altmann et al., 1997).
pBSTSK.XAG-1 Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro di sonde
marcate per esperimenti di ibridazione in situ “whole mount”. Il plasmide contiene un inserto di circa 2 Kb codificante per XAG-1, clonato NotI-EcoRI. Per la trascrizione del filamento antisenso il plasmide è stato linearizzato con NotI e trascritto mediante il promotore di T7 [Gammill e Sive, 1997].
pGEM3.Xrx1 Questo plasmide è stato utilizzato per la trascrizione in vitro di sonde marcate per esperimenti di ibridazione in situ “whole mount”. L'inserto di 1485 bp è clonato EcoRI. Per la trascrizione del filamento antisenso il plasmide è stato linearizzato con BamHI e trascritto mediante il promotore di T7 (Casarosa et al., 1997).
2.5 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi
alcalina (“mini-prep”)
Questo metodo permette di estrarre piccole quantità di DNA plasmidico (circa 2-20 µg) da cellule trasformate per il successivo sequenziamento o la digestione diagnostica. Da una piastra contenente colonie di E. coli recanti il plasmide di interesse o da uno stock di batteri in glicerolo al 10%, viene effettuato un inoculo di un clone batterico in 3 ml di brodo di coltura LB con ampicillina (100 µg/ml) posti in un tubo batteriologico da 10-15 ml. L'inoculo viene incubato per 12-16 ore (O/N) a 37°C in rotazione costante, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. Per verificare che non siano avvenute contaminazioni durante la procedura di inoculo, un altro tubo contenente solo il brodo LB e l'ampicillina viene sottoposto agli stessi passaggi che subisce l'inoculo (bianco). Se dopo l'incubazione a 37 °C non è avvenuta crescita all'interno del nostro bianco possiamo essere sicuri che le soluzioni da noi utilizzate non contenevano contaminanti.
La coltura viene trasferita in singoli tubi Eppendorf e quindi centrifugata a 12000 rpm per 1-3’ allo scopo di ottenere un “pellet” di cellule batteriche. Il sovranatante viene eliminato e il pellet viene risospeso in 400 µl di “soluzione 1”. Vengono poi aggiunti 400 µl di “soluzione 2”, si inverte il tubo delicatamente 4-5 volte e si incuba la sospensione per non più di 5 minuti. Infine vengono aggiunti 400 µl di “soluzione 3” che serve per arrestare la reazione di lisi e a far precipitare le pareti e le membrane delle cellule alle quali sono associati il DNA cromosomico e l’RNA ad alto peso molecolare. Dopo una centrifugazione di 15 minuti a 12000 rpm viene recuperato il sovranatante e il suo volume viene misurato. In questa sospensione sono contenuti il DNA plasmidico, l’RNA a basso peso molecolare e le proteine batteriche. Vengono poi aggiunti 0,6 volumi (V) di isopropanolo e la miscela viene incubata a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti, dopo aver capovolto delicatamente il tubo Eppendorf per 3-4 volte. In questo modo il DNA plasmidico e l’RNA a basso peso molecolare precipitano e vengono recuperati mediante centrifugazione (20’ a
14000 rpm). Il sovranatante viene poi sostituito con 400 μl di etanolo al 70% ghiacciato per eliminare ulteriori sali presenti nel “pellet” e nuovamente centrifugato. Una volta eliminato l'etanolo il “pellet” viene fatto asciugare all'aria e risospeso in 20 μl di TE o (H2O mQ) contenente RNAsi A
alla concentrazione di 100 µg/ml, per eliminare l’RNA a basso peso molecolare.
Soluzioni
Soluzione 1 Tris-HCl 25 mM pH 8 EDTA 10 mM Glucosio 50 mM Lisozima 10 mg/ml Soluzione 2 NaOH 0,2 M SDS 1% Soluzione 3 CH3COOH 5 M KCl 3 M TE Tris 10mM pH 8,0 EDTA 1 mM pH 8,02.6 Estrazione di DNA plasmidico su media scala mediante
colonne NUCLEOBOND AX-100 (“midi-prep”)
Tale metodo consente di recuperare di discrete quantità di DNA plasmidico (50-150 μg) da colture di 100 ml di cellule batteriche trasformate, mediante l'utilizzo di colonnine cromatografiche “NUCLEOBOND” a scambio anionico che sono disponibili in commercio insieme alle soluzioni necessarie per il loro impiego. In questo caso una volta raggiunta la fase stazionaria di crescita dell'inoculo esso viene aggiunto ad una beuta contenente 100 ml di brodo di coltura LB sterile e ampicillina (100 µg/ml). La sospensione viene incubata O/N a 37°C fino al raggiungimento della fase di crescita stazionaria. Anche in questo caso come bianco viene utilizzata parte del brodo LB contenente ampicillina contenuto nella beuta e prelevato prima dell'aggiunta dell'inoculo.
Dopo una centrifugazione a 4°C per 20 minuti a 4500 rcf, il sovranatante viene eliminato e il “pellet” viene risospeso in 4 ml di soluzione S1 contenente RNasi A. Vengono inoltre aggiunti 4 ml di soluzione di lisi S2, la sospensione viene invertita per 6-8 volte e incubata a RT per non più di 5 minuti. Trascorso questo tempo si aggiungono 4 ml di “stop-solution” S3 si inverte delicatamente per 6-8 volte e si incuba in ghiaccio per 5 minuti. La sospensione viene filtrata attraverso della carta “Whatmann” 3MM per eliminare i detriti più grossolani che renderebbero più difficoltoso il recupero del DNA plasmidico. Intanto la colonna cromatografica AX-100 viene equilibrata mediante il passaggio per gravità di 2,5 ml di soluzione N2 attraverso la resina. Il lisato viene quindi caricato nella colonna e durante il suo passaggio attraverso la resina, il DNA plasmidico viene trattenuto. Per allontanare residui di sali e di RNA la resina viene sottoposta a due lavaggi di 5 ml ciascuno con la soluzione N3. Il DNA plasmidico viene eluito all'interno di un tubo poliallomero da centrifuga aggiungendo 5 ml di soluzione N5. All'eluato vengono aggiunti 0,7 volumi di isopropanolo e la miscela viene capovolta per 4-5 volte e centrifugata a 4°C per 30 minuti a 15000 rpm. Il “pellet” viene allontanato dal sovranatante e lavato con 1 ml di etanolo al 70%
ghiaccio. Una volta asciugato all'aria il pellet viene risospeso in 50 µl di TE pH 8,0 (o in H2O mQ) e trasferito in un tubo Eppendorf.
Soluzioni
S1
RNAsi A 100 µg/ml Tris-HCl 50 mM EDTA 10 mM pH 8,0S2
NaOH 200 mM SDS 1%S3
Acido acetico2,8 M pH 5,1N2
Tris 100 mM EtOH 15% KCl 900 mM Triton X-100 0,15%N3
Tris 100 mM EtOH 15% KCl 1,15 M
Equilibrato a pH 6,3 con H3PO4
N5
Tris 100 mM EtOH 15% KCl 1 M
Equilibrato a pH 8,5 con H3PO4
2.7 Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione
Attraverso la restrizione enzimatica è possibile linearizzare o frammentare il DNA plasmidico. Questa metodica permette di operare delle digestioni diagnostiche e costituisce un passaggio necessario per la trascrizione in vitro. Per quest'ultima applicazione si utilizzano enzimi che lasciano estremità 5’ protrudenti oppure piatte. In caso contrario la RNA-polimerasi utilizzata per la trascrizione in vitro potrebbe usare l'estremità protrudente al 3' come “primer” per la polimerizzazione dell'mRNA utilizzando il filamento complementare a quello desiderato come stampo.
La miscela di reazione contiene un enzima di restrizione, un tampone che ne garantisce il livello ottimale di attività e il DNA plasmidico, in un volume di reazione di 20-40 μl. Per allestire una reazione di restrizione è necessario utilizzare un volume di enzima non superiore a 1/10 del
volume totale di reazione. Questo perché l'enzima è conservato in una miscela di glicerolo che ne ostacola l'attività catalitica. Si usano 2-3 Unità Enzimatiche (UE) per µg di plasmide in reazioni che vengono condotte a 37°C e variano in durata tra 1 e 12 ore dipendentemente dalla quantità di DNA da digerire.
Nelle digestioni con enzimi di restrizione si sottopone il plasmide all'azione di uno o più enzimi. Alla fine della reazione i diversi frammenti di DNA vengono separati per elettroforesi su gel di agarosio e identificati mediante l'uso di marcatori di lunghezza caricati in pozzi adiacenti ai prodotti digeriti. Il DNA viene visualizzato mediante l'incorporazione di un intercalante fluorescente presente all'interno del gel, il bromuro di etidio, attraverso l'esposizione ad una fonte di luce UV.
Per le reazioni di trascrizione in vitro il plasmide viene ristretto mediante un solo enzima capace di tagliare unicamente nella regione posta a valle dell'inserto. Al fine di verificare il completamento della digestione una piccola aliquota della reazione viene controllata per gel elettroforesi accanto ad un’aliquota di plasmide non digerito. Quando tutto il plasmide è stato digerito nel gel è visualizzabile un'unica banda di dimensioni intermedie rispetto alle comuni forme di DNA circolare superavvolto, che migra più velocemente, e quella circolare rilassata, che migra più lentamente.
2.8 Purificazione degli acidi nucleici
La purificazione degli acidi nucleici è necessaria ogni volta che si vuole allontanare dal DNA o dall'RNA componenti di una miscela di reazione che possono interferire con la resa di altri protocolli o che non costituiscono l'ambiente ideale nel quale conservare gli acidi nucleici stessi.
2.8.1 Estrazione in Fenolo-Cloroformio-alcool isoamilico
Questa tecnica sfrutta la capacità delle proteine denaturate di essere più solubili in fase organica. Il fenolo e il cloroformio denaturano le proteine, il cloroformio facilita la separazione delle fasi, mentre l’alcool isoamilico riduce la formazione di schiuma durante l’estrazione. Nella seconda parte si procede con la normale precipitazione alcolica per gli acidi nucleici.
Il campione viene portato ad un volume di 200 µl con H2O mQ ai quali vengono aggiunti 200
µl di fenolo-cloroformio-isoamil alcool 25:24:1 pH 8. La miscela viene agitata energicamente fino all'ottenimento di un'emulsione che viene poi centrifugata per 5 minuti a 13000 rpm. Si recupera poi il sovranatante lasciando l'interfaccia e misurando il volume di liquido prelevato. Vengono aggiunti 0,1 volumi di NaAc pH 4,8 3 M e 2,5 volumi di etanolo assoluto e si lascia precipitare per 30 minuti a -80 °C. Trascorso questo tempo si centrifuga il campione a 4 °C per 15 minuti a 13000 rpm e si scarta il sovranatante. Il “pellet” viene lavato con 200 µl di etanolo al 70% ghiacciato, si centrifuga a 4 °C per 10 minuti a 13000 rpm. L'etanolo viene infine eliminato e il “pellet” viene risospeso in 10 µl di H2O mQ o TE a pH 8,0.
2.8.2 Purificazione da gel di agarosio di plasmidi linearizzati (GenElute™
Gel Extraction Kit)
Il “kit” commerciale GenElute™ Gel Extraction Kit (Sigma) permette di purificare da gel
frammenti di DNA, compresi tra le 50 bp e 10 Kb, precedentemente sottoposto a corsa elettroforetica in gel di agarosio. Il kit prevede l’utilizzo di colonne “GenElute Binding Column G” (Sigma) munite di resina silicea in grado di intrappolare il DNA; con la successiva eluizione è possibile arrivare a purificare fino a 10 µg di DNA contenuto in 3,5 g di agarosio con una resa tra il 50% e l’80%.
Il gel contenente il plasmide linearizzato viene esposto a luce UV per il breve periodo di tempo necessario per ritagliare la banda da eluire. Il gel recuperato viene pesato e disciolto in un tubo Eppendorf con 3 volumi di “Gel Solubilization Solution”, cioè 300 µl di soluzione ogni 100 mg di gel. La sospensione viene incubata a 50-60°C per 10’, agitando con il vortex ogni 2-3’ per facilitare la solubilizzazione dell’agarosio. Intanto le colonne “GenElute Binding Column G” vengono poste all'interno di tubi Eppendorf da 2 ml e equilibrate con 500µl di “Column Preparation Solution”. Le colonne così assemblate vengono centrifugare a 13000 rpm per 1 minuto e l'eluato viene scartato. Alla soluzione contenente il gel solubilizzato viene aggiunta una quantità di isopropanolo al 100% pari al volume iniziale del gel. Una volta scartata la “Column Preparation Solution” la colonna viene caricata con la soluzione contenente il gel solubilizzato che deve mostrare una corretta colorazione gialla, in base alla presenza di un indicatore di pH che vira al rosso quando il pH non è ottimale. Il alternativa bisogna aggiungere 10 μl di sodio acetato 3 M a pH 5,2 per volta fino al viraggio corretto. La colonna così caricata viene centrifugata per 1 minuto a 13000 rpm, l'eluato viene scartato. A questo punto il DNA plasmidico si trova intrappolato nella resina e viene sottoposto a due lavaggi da 700 μl ciascuno di “Wash Solution” (contenente etanolo) attraverso due centrifugazioni da 1 minuto a 13000 rpm. Gli eluati vengono scartati e dopo l'ultimo lavaggio si centrifuga nuovamente la colonnina per 1 minuto per eliminare quanto più etanolo possibile. La colonna viene trasferita poi in un tubo Eppendorf nuovo e il DNA plasmidico viene eluito mediante l'aggiunta di 50 µl di “Eluition Solution” preriscaldata a 65 °C e una centrifugazione a 13000 rpm per 1 minuto.
Mediante l'uso di appositi marcatori di quantità, dopo il recupero del DNA plasmidico si procede con una corsa elettroforetica su gel di agarosio per controllare che non ci sia stata perdita di materiale durante il protocollo.
2.9 Elettroforesi su gel di agarosio
L'elettroforesi su gel di agarosio è stata utilizzata per visualizzare i prodotti di PCR (gel 1,5% peso/volume), per isolare le bande prodotte dalla digestione enzimatica dei plasmidi o per stimare la concentrazione o la bontà delle varie preparazioni (gel all'1% peso/volume). I gel sono stati preparati sciogliendo il quantitativo richiesto di agarosio in TBE a pH 8 a temperatura di ebollizione. Una volta aggiunta una quantità di bromuro di etidio fino alla concentrazione finale di 10 µg/ml, il gel viene colato in un lettino da elettroforesi contenente un pettine per la formazione dei pozzetti e lasciato raffreddare sotto cappa chimica. Una volta avvenuta la polimerizzazione il gel viene immerso in TBE a pH 8 all'interno di un apparato orizzontale per elettroforesi.
L'operazione di caricamento dei campioni sul gel è consentita dall'uso di un “loading buffer” contenente glicerolo, che appesantisce il campione ostacolandone la diffusione nel TBE, e un colorante che permette di controllare il fronte di migrazione durante la corsa elettroforetica. Si applica poi una differenza di potenziale di 80-130 V per un tempo variabile compreso tra i 5 minuti e le 2 ore. I risultati della corsa elettroforetica sono visualizzabili mediante la luce UV che rileva la fluorescenza emessa dal bromuro di etidio che si è intercalato tra gli acidi nucleici.
Le dimensioni dei frammenti sono stimate in presenza di marcatori molecolari di peso molecolare noto (Invitrogen 1kb DNA ladder).
Soluzioni
TBE pH 8,0:
Tris base 0,089 M Acido borico 0,089 M EDTA 0,002 M
“Loading buffer” 6x di tipo III (solo Xilene cianolo) per DNA:
Glicerolo 5%
Xilene cianolo 0,025%
“Gel Loading buffer II” (Ambion) 2x denaturante per RNA:
EDTA 18 mM Formammide 95 % SDS 0,025 % Blu di bromofenolo 0,025% Xilene cianolo 0,025%
Gel di agarosio:
Agarosio 1-1,5% (peso/vol) Et-Br 10 µg/ml TBE 1X“Marker” molecolare:
Invitrogen 1 kb DNA ladder
2.10 Stima della concentrazione di acidi nucleici
Questo saggio risulta essere preparativo nei confronti di altre tecniche che richiedono la conoscenza della quantità degli acidi nucleici.
2.10.1 Stima della concentrazione di acidi nucleici mediante elettroforesi su
gel di agarosio
Questa metodica permette di ottenere una stima indicativa della quantità di acidi nucleici contenuti nel nostro campione mediante l'uso di sue diluizioni e di quantità note di acidi nucleici di riferimento. Questi vengono fatti correre parallelamente su gel di agarosio e la stima viene effettuata mediante rilevazione della fluorescenza emessa dal bromuro di etidio.
2.10.2 Stima della concentrazione di acidi nucleici mediante
spettrofotometria UV
Questa metodologia si basa sulla capacità degli acidi nucleici di assorbire alcune lunghezze d'onda della luce. Lo spettrofotometro (Beckman DU-60) viene inizialmente tarato effettuando una misurazione alla lunghezza d'onda di 260 nm su 600 µl di acqua mQ contenuti all'interno di una cuvetta di quarzo. Una volta tarato il bianco viene misurata l'assorbanza di 2 µl di campione diluiti in 598 µl di acqua mQ. Il rapporto tra le misurazioni di assorbanza effettuate alle lunghezze d'onda di 260 nm e 280 nm è un parametro che indica il grado di purezza del campione. Un valore maggiore o uguale a 1,8 indica l'assenza di sali e proteine.
2.11 Trascrizione in vitro dell'mRNA da microiniettare
(mMessage mMachine
®Ambion)
Gli mRNA da microiniettare devono contenere sequenze che ne aumentano la stabilità e l’efficienza di traduzione all’interno della cellula. Per questo si inserisce il cDNA dei geni di interesse all’interno di plasmidi che contengono elementi stabilizzanti l’RNA. Inoltre per aumentare l’efficienza di traduzione, si aggiunge alla miscela di trascrizione una “terminal cap structure“
(“cap”) all’estremità 5’. In questo modo si possono ottenere trascritti stabili, in grado di sopravvivere all’interno della cellula. Il “cap”, tipico di molti RNA cellulari, consiste di una [m7G(5')ppp(5')G] che rallenta la degradazione dell'mRNA in ambiente cellulare.
Il “kit mMessage mMachine® Ambion” consente di ottenere una elevata efficienza di
“cap”-mRNA grazie alla presenza di un eccesso di un analogo del [m7G(5')ppp(5')G]. La miscela di
reazione contiene un rapporto equilibrato di tutti i quattro ribonucleotidi necessasi per la sintesi dell'mRNA e un eccesso dell'analogo del [m7G(5')ppp(5')G] in un rapporto di 4:1 con il GTP. Per
motivi sterici l'analogo del “cap” può essere incorporato solo al 5' dell'mRNA e non in altre posizioni. Inoltre la miscela di reazione contiene anche un ampio spettro di inibitori della RNasi (Superase·In™).
I templati vengono di norma preparati digerendo 5-10µg di DNA plasmidico, usando un sito di restrizione a valle del sito di poliadenilazione virale di SV40. La reazione di trascrizione viene generalmente condotta in 20 µl.
Tutti i reagenti necessari per la sintesi in vitro dell'mRNA sono conservati a -20°C, ma prima dell'inizio del protocollo è necessario portare a RT il “10X Reaction Buffer” perchè contiene spermidina che co-precipita con il DNA se la reazione viene assemblata in ghiaccio. In una Eppendorf si pone una quantità d'acqua mQ necessaria per arrivare al volume finale di 20 µl, vengono poi aggiunti nel seguente ordine 10 µl di “2X NTP/CAP”, 2 µl di “10X Reaction Buffer”, 1-1,2 µg di DNA plasmidico linearizzato e 2 µl di SP6 “Enzime Mix”. La soluzione viene miscelata delicatamente, brevemente centrifugata per raccogliere tutto il liquido sul fondo e incubata a 37°C per 2 ore. Trascorso questo tempo 1 μl della soluzione viene raccolto e conservato a -20 °C. Dopo l'incubazione di 2 ore viene aggiunto 1 μl di “Dnase 1” e la soluzione viene nuovamente incubata per 15 minuti a 37 °C per degradare il DNA plasmidico. Viene quindi effettuata una corsa elettroforetica di controllo, caricando parallelamente su gel 1 μl della reazione
I due campioni vengono miscelati in acqua mQ e “Gel Loading buffer II” 2X denaturante e caricati in un gel di agarosio all'1%. La corsa elettroforetica viene effettuata con un'alta differenza di potenziale (130V) e per breve tempo (5 minuti) in un apparato precedentemente trattato con NAOH 0,1 M al fine di inattivare l'eventuale RNasi presente sulle sue superfici. In presenza di marcatori quantitativi (tRNA a concentrazione nota) è possibile dare una prima stima dell'efficienza della trascrizione e dell'azione della DNasi. Il campione non sottoposto a questo ultimo trattamento, infatti presenterà una banda molto alta proveniente dal DNA plasmidico che non deve essere presente all'interno del campione sottoposto a DNasi.
Una volta verificata l'avvenuta reazione di trascrizione viene eseguita una estrazione fenolica ed una precipitazione alcolica che servono per liberare l'mRNA dalla miscela contenente i componenti della reazione. Alla soluzione vengono aggiunti 115 μl di “Nuclease-free Water” e 15 μl di “Ammonium Acetate Stop Solution” e mescolata delicatamente. Si aggiungono 150 μl di fenolo/cloroformio a pH 7,5 e si miscela energicamente. Dopo una centrifugazione a 13000 rpm per 10 minuti si recupera la fase acquosa che viene misurata e trasferita in una nuova Eppendorf. Viene aggiunto uno stesso volume di isopropanolo e dopo una breve miscelazione si lascia la soluzione per 15 minuti a -20 °C. Trascorso questo tempo segue una centrifugazione a 4 °C per 15 minuti a 12000 rpm. Il “pellet” prodotto viene separato dal sovranatante che viene scartato e sostituito con 100 μl di etanolo al 75% ghiacciato. Infine l'mRNA viene asciugato all'aria e risospeso in 20 μl di “Nuclease-free Water”, quantificato per spettrofotometria UV, aliquotato e conservato a -80 °C.
2.12 Trascrizione in vitro di RNA marcato con DIG-11-UTP
Questo protocollo è stato utilizzato nella trascrizione di RNA antisenso marcati con DIG-11-UTP (digossigenina-DIG-11-UTP) da usare come sonda negli esperimenti di ibridazione in situ “whole
reperibile in commercio. La sintesi dell'mRNA viene effettuata mediante una RNA-polimerasi (SP6, T3 o T7) scelta in base all’orientamento di clonaggio della sequenza di interesse all'interno del vettore che è stato opportunamente linearizzato.
La reazione viene assemblata aggiungendo a 1-1,2 µg di DNA linearizzato, 2 µl DTT 100 mM, 4 µl di “Transcription buffer 5X” (Roche), 2 µl DIG-labeling mix (Roche), 1 µl “RNase OUT” (Invitrogen), 2 µl RNA polimerasi e H2O mQ fino ad un volume totale di 20 µl. La miscela viene
incubata per 2 ore a 37°C. Trascorso questo tempo si preleva 1 µl del volume di reazione e si conserva in ghiaccio per la successiva corsa elettroforetica di controllo. Vengono aggiunti 2 µl di “DNase/RNase free” (Invitrogen) e la soluzione viene incubata per ulteriori 15 minuti a 37°C.
Successivamente vengono aggiunti 1 µl di EDTA 0,5 M pH 8,0, 1/10 del volume di NH4Ac 5M e 1 volume di isopropanolo. Il tutto viene mescolato delicatamente e posto a -20 °C per 1 ora. Trascorso questo tempo viene eseguita una centrifugazione a 4 °C per 15 minuti a 13000 rpm. Il sovranatante prodotto viene eleminato e il “pellet” viene lavato con 100-150 µl di EtOH 75% ghiacciato. Si esegue una ulteriore centrifugazione a 13000 rpm per 3’ a 4°C, si elimina il sovranatante e si lascia asciugare il “pellet” all'aria. Infine si risospende il precipitato in 22 µl H2O mQ e 1 µl viene utilizzato per essere confrontato per corsa elettroforetica, in gel di agarosio all'1%, con il campione prelevato prima della precipitazione.
Entrambi sono caricati su gel con “Loading buffer II” (Ambion) 2X per RNA e in parallelo a soluzioni di tRNA a concentrazione nota usate come marcatori di quantità. L’RNA da utilizzare come sonda negli esperimenti di ibridazione in situ “whole mount” deve essere diluito nel mix di ibridazione (“Hybridization mix”) alla concentrazione di 10 μg/ml e conservato a –20°C.
Soluzioni
“Hybridization mix”
Formammide 50% SSC 5X RNA di Torula 1mg/ml Eparina 100µg/ml Denhart’s 1X Tween-20 0.1% CHAPS 0.1% EDTA10mM2.13 Estrazione di RNA con “TRIzol
®Reagent”
Il TRIzol® Reagent (Invitrogen, 15596-026) è stato utilizzato per estrarre l'RNA totale dagli
espianti ectodermici (o calotte animali o “animal cap”) o da embrioni interi. Questa metodologia permette di ottenere un’estrazione con minore contaminazione da DNA genomico e proteine.
Il TRIzol® Reagent, conservato a 4 °C, viene equilibrato a RT. Ai campioni ancora congelati,
conservati a -80 °C, vengono aggiunti 200 µl di TRIzol e vengono omogeneizzati mediante l'ausilio di un pestello per tubi Eppendorf, precedentemente trattato con NaOH 0,1 M. Con ulteriori 800 µl di TRIzol si cerca di recuperare la maggior parte del materiale che potrebbe essere rimasto adeso al pestello. L'omogenato viene incubato per 5 minuti a RT per permettere la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici. Si aggiungono 200 µl di cloroformio, si agita energicamente per 15 secondi e si incuba per 2-3 minuti a RT. La miscela viene poi centrifugata a 4 °C per 15 minuti a 12000 rcf. A questo punto si trasferisce la fase acquosa, contenente l'RNA, in un nuovo tubo
Eppendorf e si aggiungono 0,5 ml di isopropanolo. La miscela viene incubata per 10 minuti a RT e centrifugata a 4 °C per 10 minuti a 12000 rcf. Al termine della centrifugazione l'RNA è visibile sul fondo del tubo Eppendorf sotto forma di un precipitato opalescente. Si scarta il sovranatante e si lava il “pellet” con 1 ml di etanolo al 75%. Dopo una centrifugazione a 4 °C per 5 minuti a 7500 rcf si scarta l'etanolo e l'RNA viene lasciato asciugare all'aria. A questo punto si risospende l'RNA aggiungendo 25 µl di acqua mQ e miscelando in modo accurato. Il campione viene quantificato per spettrofotometria UV e conservato a – 80 °C. Viene effettuato anche un controllo sulla qualità dell'RNA estratto, mediate una corsa elettroforetica su gel di agarosio all'1%. Se l'estrazione è avvenuta correttamente saranno visibili due bande principali che si riferiscono all'RNA ribosomale (rRNA) 28S di intensità doppia rispetto a quella dell'rRNA 18S che migra più velocemente.
2.14 Trattamento con DNasi sull'RNA estratto
Questa metodica permette di degradare il DNA genomico eventualmente presente negli RNA estratti con il TRIzol. All'RNA vengono aggiunti 10 µl di “Red Taq 10X Buffer” (Sigma), 2 µl di “Rnasi OUT” (Invitrogen), 4 µl di “Dnase-RNase free” (Invitrogen) e acqua mQ fino al raggiungimento del volume di 100 µl. La miscela di reazione viene incubata a 37 °C per 30 minuti. Vengono poi aggiunti 0,5 volumi di isopropanolo e 0,5 volumi di fenolo acido. Si miscela energicamente e si centrifuga a 12000 rpm per 5 minuti. La fase acquosa viene recuperata, misurata e trasferita in un tubo Eppendorf nuovo. Vengono aggiunti 2,5 volumi di etanolo assoluto e 1µl di glicogeno. La miscela viene incubata in ghiaccio secco o a -80 °C per 30 minuti. Trascorso questo tempo si procede con una centrifugazione a 12000 rpm per 15 minuti, si elimina il sovranatante e si lava il “pellet” con 150 µl di etanolo al 70%. Dopo una centrifugazione di 5 minuti a 14000 rpm si elemina l'etanolo e si lascia asciugare l'RNA all'aria. Il campione viene poi risospeso in 15 µl di
Una diluizione viene inoltre sottoposta a elettroforesi su gel di agarosio all'1% per controllare che l'RNA non si sia degradato durante il procedimento e che non sia stato perso del materiale.
2.15 RT-PCR (“Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction”)
La tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi (o PCR) permette di amplificare un frammento di DNA utilizzando una coppia di “primer” specifici, grazie alla proprietà di sintesi della Taq DNA-polimerasi. I “primer” sono oligonucleotidi sintetici lunghi circa 20 nucleotidi (nt) e complementari, su eliche diverse, alle estremità del frammento di DNA da amplificare. In opportune condizioni, essi si appaiano alle sequenze complementari sul DNA e fungono da inneschi per la DNA-polimerasi. Questa tecnica prevede un numero variabile di cicli di amplificazione (25-35), ciascuno dei quali composto da più fasi a temperature diverse, dipendenti dalla composizione nucleotidica dei “primer” e dal tipo di Taq DNA-polimerasi utilizzata. Il passaggio da una temperatura all’altra è permesso dall’uso di un “cycler” termico Bio-Rad iCycler. Durante ogni ciclo, i due filamenti di DNA vengono denaturati per permettere il successivo appaiamento dei “primer” (“annealing”), necessario per la fase di allungamento catalizzata dalla Taq polimerasi (“elongation”). Terminati i cicli di amplificazione si ha un ultimo “step” di circa 7-10 minuti per consentire alla Taq polimerasi di allungare i filamenti di DNA rimasti incompleti.
La reazione di PCR viene effettuata su molecole di cDNA (a singolo filamento); la reazione di retrotrascrizione (RT) avviene grazie all’enzima “SuperScript™ III Reverse Trascriptase”
(Invitrogen) che sintetizza una molecola di cDNA a partire dallo stampo di mRNA estratto. Le reazioni di RT sono state assemblate utilizzando degli “oligo(dT)” che sono in grado di appaiarsi sulle code di “poly-(A)” presenti all’estremità 3’ dell’mRNA estratto fungendo da “primer” per l’avvio della retrotrascrizione.
“oligo-(dT)” (500 µg/ml), 1 µl di “dNTP MIX 10 mM” e un volume d'acqua necessaria al raggiungimento del volume di 13 μl. La miscela viene riscaldata a 65 °C per 10 minuti e riposta in ghiaccio per almeno 1 minuto. Vengono poi aggiunti 4 µl di “First-Strand Buffer 5X”, 2 µl di “DTT 0,1M”, 1 μl di “Rnase OUT™” e 1 μl di “ SuperScript™ III Reverse Trascriptase”. La miscela
viene incubata a 50 °C per 50-60 minuti e la reazione viene inattivata mediante riscaldamento a 70 °C per 15 minuti.
Per ogni campione sono stati fatti dei controlli –RT dove al posto della trascrittasi inversa è stata aggiuntaH2O mQ.
Le reazioni di PCR sono state eseguite utilizzando come DNA-polimerasi “AccuTaq LA™ DNA
POLYMERASE MIX” (Sigma) in un volume finale di 25 µl. A 1 µl di cDNA vengono aggiunti 18,5
µl di acqua mQ, 2,5 µl di “10X ACCUTaq PCR Buffer”, 1,25 µl di dNTP mix 10 mM, 0,5 µl DMSO, 1 µl Primer-mix 10 µM e 0,25 µl di “AccuTaq LA™ DNA POLYMERASE MIX” (5 U/µl).
Considerando che le dimensioni dei prodotti di amplificazione attesi erano di 300 bp abbiamo utilizzato la seguente sequenza di cicli:
1X 98,0 °C 2 min 94,0 °C 30 sec 30X 57,5-61,0 °C 30 sec 68,0 °C 30 sec 1X 68,0 °C 5 min
Per ogni reazione sono stati allestiti dei controlli negativi, facendo avvenire la reazione in assenza di DNA stampo, sostituito con H2O mQ. I controlli –RT servono per verificare l'assenza di
DNA nel campione.
Di seguito sono riportate le sequenze dei “primer” utilizzati per RT-PCR:
Gene Nome Primer Sequenza (5'--->3') Tm (°C)
Sox2 XLAO2FOR ccagaggatggacacttatgc XLAO2REV agaggtgactacaggtggactg
60,0
XBf1 BFHF tcaacagcctaatgcctgaagc BFHR gccgtccactttcttatcgtcg
63,4
Hoxb9 BOX6F tacttacgggcttggctgga BOX6R agcgtgtaaccagttggctg
63,4
Opsina Xopsia2FOR gccaatcacttcatggtcct Xopsia2REV ccctctgggatgtatctgga
60,0
Istone H4 XhisH4FOR ggcaaaggaggaaaaggact XhisH4REV gccgaagccgtagagagtg
60,0
2.16 “Multiplex-PCR”
Questa tecnica permette di utilizzare piccole quantità di un campione di cDNA retrotrascritto, per l'analisi di espressione di molti geni. Un'aliquota del campione retrotrascritto subisce inizialmente un passaggio di amplificazioni che avvengono in presenza di più coppie di “primer” contenuti nella stessa miscela di reazione. Tali coppie devono essere disegnate in modo tale da produrre per ciascun gene di interesse, un amplificato di dimensioni simili. Devono inoltre possedere una stessa temperatura di fusione. Queste caratteristiche fanno si che l'amplificazione di un particolare cDNA non sia avvantaggiata rispetto alle altre, e quindi permettono di lasciare inalterata la rappresentatività relativa di ciascun templato all'interno del campione.
Successivamente il prodotto proveniente dal primo passaggio di amplificazioni viene frazionato e utilizzato come templato per reazioni PCR tradizionale.
Rispetto ai controlli sulle singole reazioni di PCR, il protocollo di “Multiplex-PCR” prevede l'aggiunta di un controllo di specificità. Questo consiste nell'utilizzo del prodotto del primo
passaggio in una reazione di PCR in assenza di “primer”. In questo modo è possibile verificare che le coppie utilizzate inizialmente non siano in grado di produrre un amplificato nel passaggio successivo.
Il seguente protocollo è stato ottenuto modificando il procedimento messo appunto dal Dott. Yuri Bozzi e dal Dott. Federico Madeddu, presso l'Istituto di Neurofisiologia del C.N.R. di Pisa, e ideato da Klink e al. [Klink et al., 2001].Il “kit” di PCR utilizzato è l'”HotStarTaq® DNA
Polymerase” (Quiagen).
Questa polimerasi necessita di un riscaldamento di 15 minuti a 95 °C perchè venga attivata. In questo modo previene la formazione di dimeri di “primer” a temperatura ambiente. Inoltre, per la composizione delle soluzioni di reazione, garantisce una elevata resa di produzione di amplificati specifici e parallelamente una diminuzione di prodotti non corretti.
Il primo passaggio di amplificazioni (20 cicli) viene effettuato in un volume finale di 100 µl. A 2 µl di cDNA vengono aggiunti 10 µl di Multiplex oligo mix 1 μM, 8 µl di “10X PCR Buffer”, 0,5 µl di dNTPs mix 10 mM, 20 µl di “Buffer Q”, 0,5 µl di “HotStarTaq®” e 59 μl di acqua mQ.
1X 95,0 °C 15 min 94,0 °C 1 min 20X 58,0 °C 1 min 72,0 °C 1 min 1X 72,0 °C 7 min
Il secondo passaggio di amplificazioni (20-25 cicli) viene effettuato in un volume finale di 50 µl. A 2 µl di templato proveniente dal primo passaggio vengono aggiunti 1 µl di “primer specific mix” 10 μM, 5 µl di “10X PCR Buffer”, 0,25 µl di dNTPs mix 10 mM, 10 µl di “Buffer Q”, 0,4 µl di “HotStarTaq®” e 30,35 μl di acqua mQ.
1X 95,0 °C 15 min 94,0 °C 1 min 20-25X 58,0 °C 1 min 72,0 °C 1 min 1X 72,0 °C 7 min
Di seguito sono riportate le sequenze dei “primer” utilizzati per le “Multiplex-PCR”:
Gene Nome Primer Sequenza (5'--->3') Tm (°C)
Pax6 Xpax6FOR ccacagcctaccacaccagt Xpax6REV actccaggggaaatgagacc
60,0
Rx1-utr RX1UTR_FOR tgccatgacgagttgaagtt RX1UTR_REV aaaggctgtctcccatagcc
60,0
Six3-utr SIX3UTR_FOR ttggttttcgtgttcatcaga SIX3UTR_REV tgaaaggttagggggatgtg
60,0
Optx2 Xoptx2FOR ggtcgcttcttgtggtcatt Xoptx2REV tgttccccgtcccaaatagt
60,0
tll-utr T11UTR_FOR ttgtgccgaaaagttacacg T11UTR_REV ggggcatttgtgtcttccta
60,0
Xotch XOTCH FOR atggcttcaccccacttatg XOTCH REV gaatctggaatacgccctga
60,0
Xash1 Xash1FOR tacagccccattgcttcttc Xash1REV agcgctctccactttgctcat
60,0
Xath5a XATH59 FOR2 agtcaccatgcccactaagg XATH59 REV2 cactgctcctcctcaatgtg
60,0
Xath5b XATH56 FOR2 acctgccccagactttttct XATH56 REV2 ataccagcgcactttgcttt
60,0
NeuroD XneuroDFOR gagcccaccccttagtgtta XneuroDREV cgtgtctgcccttggtaaac
60,0
Pax2 XPAX2 FOR cagacccctacctgatgtgg XPAX2 REV actgggaaccgtgtcattgt
60,0
Vax2 Xvax2FOR gggacatcgggaagcac Xvax2REV caggaagccaacacatcaga
60,0
Zic2 XZIC2 FOR caccccattcagcctactct XZIC2 REV cgtcctaccgaacacctctc
cycD1 XcycD1FOR caaaatgccactgactgagg XcycD1REV gttgtgttgctgctgtgctt 60,0 nrl NRL FOR aaaccagaagactccacctca NRL REV gcaggattgaccaccataaca 60,0
Prox1 XPROX1 FOR gctccaacatgctgaaaacc XPROX1 REV ctgcgataatggcattgaaa
60,0 Vsx1 VSX1FOR cattcctctaccggaatcca VSX1REV tgtctcccgctagattggtt 60,0 Brn3d BM3D FOR tggttttgatgagactttgctt BM3D REV atgtggatgggagggtgtt 60,0 Xbh1 XBH1 FOR2 gaacaggaggaccaagtgga XBH1 REV2 gtacctgggattgggtttcc 60,0
Istone H4 XhisH4FOR ggcaaaggaggaaaaggact XhisH4REV gccgaagccgtagagagtg
60,0
2.17 Raccolta degli embrioni di Xenopus laevis
Gli embrioni di Xenopus laevis sono stati ottenuti mediante fecondazione in vitro. Prima di essere operato per la rimozione dei testicoli, il maschio viene anestetizzato immergendolo in una soluzione 0,1% di MS (metansulfonato dell’acido 3-aminobenzoico-etil-estere) posta in ghiaccio per abbassare rapidamente il metabolismo dell’animale. I testicoli possono essere conservati per 3-5 giorni a 4°C immersi nell'apposita soluzione. Dopo l’operazione il maschio viene sacrificato. La conservazione ed eliminazione avvengono secondo la vigente normativa veterinaria. Le femmine di
Xenopus laevis sono pre-stimolate con 100 UI di Folligon Intervet per uso veterinario da 4 a 11
giorni prima della deposizione e con 1000 UI di Profasi HP 5000 Serono (gonadotropina corionica) 10-12 ore prima della deposizione: entrambi gli ormoni sono stati somministrati mediante iniezione nel sacco perilinfatico. Le uova da fecondare vengono ottenute esercitando una leggera pressione sull’addome degli animali e raccolte in piastre Petri: questa operazione può essere ripetuta a
ottenuta sminuzzando un frammento di testicolo in MMR 1X dopodichè le uova vengono lasciate in un piccolo volume di MMR 0,1X. Alla fecondazione segue la digestione delle proteine che legano l’uovo al gel di rivestimento; gli embrioni, liberi di ruotare, si dispongono con il polo vegetativo, più pesante perché ricco di vitello, verso il basso. Dopo almeno 30 minuti, quando è ben visibile questa rotazione, effetto dell’avvenuta fecondazione, gli embrioni vengono privati del loro rivestimento gelatinoso sostituendo l’MMR 0,1X con la soluzione degellificante e lasciandoveli per circa 5 minuti o comunque fino a che non sia evidente la perdita del suddetto rivestimento. La soluzione degellificante viene eliminata mediante 3-4 lavaggi con MMR 0,1X. Gli embrioni vengono fatti sviluppare in MMR 0,1X fino allo stadio desiderato, valutato secondo i criteri di Nieuwkoop e Faber [Nieuwkoop e Faber, 1967].
Soluzioni
MMR 10X
NaCl 0,1 M KCl 2 mM MgSO4 1 mM CaCl2 2 mM HEPES 5 mM pH 7,8 EDTA 0,1 MSoluzione per il testicolo
MMR 1X
Lamb Serum 10% Gentamicina 20 µg/µl
Soluzione degellificante
DTT 3,2 mM
Tris-HCl 0,2 M pH 8,8
2.18 Microiniezione di embrioni di Xenopus laevis
Per gli esperimenti di microiniezione sono stati utilizzati embrioni pigmentati, in cui è possibile distinguere, allo stadio di 4-8 cellule, il polo animale da quello vegetativo e i blastomeri dorsali da quelli ventrali. Al momento della microiniezione, gli embrioni degellificati vengono trasferiti in una piccola piastra Petri, sul fondo della quale è fissata una reticella di plastica, con maglie di circa 1mm, al fine di limitarne gli spostamenti durante la microiniezione.
Gli embrioni sono immersi in una soluzione di Ficoll al 4% (peso/volume) sciolto in 0.1X MMR. Il Ficoll è piuttosto viscoso e permette agli embrioni di mantenere la forma sferica durante la fase di iniezione, limitando inoltre la perdita di citoplasma dal sito dell’iniezione. Gli embrioni microiniettati sono lasciati sviluppare in 0.1X MMR-4% Ficoll nelle prime 12-16 ore dopo l’iniezione e poi trasferiti in 0.1X MMR.
Le microiniezioni sono state eseguite con un microiniettore “Drummond Nanoject”, che consente l’iniezione di volumi tra 4.6 nl e 73.6 nl ad incrementi discreti. L’iniettore è dotato di un micromanipolatore che ne permette lo spostamento macrometrico nelle tre dimensioni e di un movimento micrometrico controllato idraulicamente lungo una direzione predefinita.
Gli aghi utilizzati per la microiniezione sono ottenuti da sottili capillari di vetro mefiante tiratura a caldo e sono forniti dalla “Drummond”. Prima di essere montato sul microiniettore, l’ago deve essere riempito di olio minerale. Il caricamento dell’RNA da microiniettare è eseguito dal
microiniettore stesso.
Raggiunto il corretto stadio di sviluppo gli embrioni iniettati e quelli di controllo vengono utilizzati per ulteriori metodiche oppure posti in “vial” e fissati in oscillazione orizzontale per 2 ore in MEMFA e conservati in etanolo o metanolo assoluto a -20 °C.
Soluzioni
MEMFA MOPS 0.1 M pH 7.4 EGTA 2mM MgSO4 1mM Formaldeide 3.7%2.19 Espianti ectodermici (“animal cap”) ed esperimenti di
trapianto
Gli esperimenti di microchirurgia sono stati eseguiti mediante l'utilizzo di un strumento denominato “Gastromaster”. Questo apparecchio è dotato di un bisturi di platino della larghezza di 0,4 mm che genera delle turbolenze micro-controllate all'interno del mezzo nel quale sono immersi gli embrioni. Mediante queste turbolenze è possibile tagliare con estrema precisione i tessuti poveri in collagene senza la necessità di rimuovere la membrana vitellina che avvolge l'embrione. Tale strumento consente di ottenere campioni biologici con un elevato grado di precisione in poco tempo. La pulizia del bisturi viene ottenuta mediante l'utilizzo di sapone concentrato e acqua deionizzata per allontanare eventuali tessuti che possono rimanere attaccati alla punta di platino.
Sia gli espianti ectodermici o “animal cap” che gli esperimenti di trapianto sono stati effettuati in piastre Petri ricoperte con gel di agarosio all'1%, contenenti MMR 0,7X-Gentamicina (50 μg/ml).
Il gel di agarosio non permette ai tessuti embrionali, che risultano essere molto appiccicosi, di rimanere adesi al fondo della piastra.
Gli “animal cap” sono stati eseguiti a stadio di blastula tardiva (stadio 9) ) e coltivati fino allo stadio utile per il loro ulteriore utilizzo in MMR 0,7X-Gentamicina (50 μg/ml).
Per gli esperimenti di trapianto, gli embrioni a stadio 12 sono stati manualmente privati della membrana vitellina mediante l'uso di pinzette Dumont n°5. A stadio 15 sono stati privati della metà sinistra del campo morfogenetico dell'occhio mediante l'utilizzo del Gastromaster e trapiantati con metà “animal cap” opportunamente trattati e selezionati. Gli embrioni sono stati lasciati sviluppare fino allo stadio voluto in MMR 0,7X-Gentamicina (50 μg/ml).
2.20 Istologia
2.20.1 Fissazione e disidratazione
La fissazione è un trattamento atto a preservare il tessuto da fenomeni degenerativi, mantenendone stabile la struttura originaria. Essa prevede la formazione di legami crociati tra le proteine presenti nel campione e la disidratazione dei tessuti. Quest'ultima è necessaria affinché non si formino microcristalli di ghiaccio i quali causerebbero la rottura delle cellule e quindi l'alterazione dell’istologia stessa nel successivo passaggio di congelamento. Gli embrioni vengono posti in “vial” di vetro da 4-7 ml contenenti paraformaldeide 4% in PBS 1X per 2 ore in agitazione orizzontale a temperatura ambiente. Trascorso questo tempo la soluzione del fissativo viene sostituita con saccarosio 20% in PBS 1X e incubata a 4°C O/N.
2.20.2 Inclusione in resina OCT o “Tissue-Tek”
Per facilitare il taglio, gli embrioni vengono inclusi in una resina a base acquosa, liquida a temperatura ambiente e a basso punto di congelamento: OCT o “Tissue-Tek”.
Gli embrioni fissati vengono adagiati sul fondo di una vaschetta di plastica, e privati della maggior parte del saccarosio residuo. I campioni vengono ricoperti con la resina che viene fatta solidificare in un bagnetto di etanolo a -80°C per circa 15 minuti oppure in ghiaccio secco. Le vaschette vengono poi conservate a -80°C fino al giorno del taglio.
2.20.3 Sezioni al criostato
Gli embrioni inclusi in OCT vengono tagliati utilizzando un criostato Leica C1850, in modo da ottenere sezioni trasversali dello spessore di 12 µm. Le sezioni sono raccolte su vetrini del tipo SuperFrost, la cui superficie è attivata elettrostaticamente per permettere una adesione immediata delle sezioni ottenute, e mantenuti a -80°C fino al momento dell’uso. Le sezioni, prima di essere sottoposte ai protocolli successivi, devono essere lasciate asciugare all’aria per almeno un’ora in modo da consentire una migliore aderenza al vetrino.
Soluzioni
PBS 1X (1 lt.)
NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2PO4 .16H2O 1,44 g KH2PO4 0,24 g pH 7,4Paraformaldeide 20%
A 400 ml di H2O mQ alla temperatura di 50°C vengono aggiunti 100 µl di NaOH 10 N e lentamente 100 gr di paraformaldeide. La soluzione viene mescolata per 30-60 minuti, finché non si
chiarifica. Essa viene poi filtrata con carta 3MM e portata al volume di 500 ml con H2O mQ. Viene infine conservata in aliquote da 50 ml a –20°C.
2.21 Colorazione istologica mediante Ematossilina-Eosina
La colorazione con Ematossilina-Eosina (“H&E stain”) permette di osservare l'istologia dei preparati ottenuti al criostato. L'ematossilina è un colorante basico che viene trattenuto da molecole basofile come il DNA e l'RNA, per questo motivo conferisce una colorazione blu-porpora ai nuclei presenti nelle sezioni istologiche o alle regioni citoplasmatiche ricche di RNA. L'ematossilina, invece conferisce colorazioni comprese tra il rosso e il rosa a varie componenti proteiche citoplasmatiche e extracellulari.
Le sezioni istologiche vengono inizialmente re-idratate mediante lavaggio in PBS 1X per 3 minuti e in acqua distillata per 1 minuto. Successivamente si procede con la colorazione mediante Ematossilina in soluzione acquosa al 20% per 10 minuti. Dopo un lavaggio di 1 minuto in acqua distillata i vetrini vengono posti in un flusso d'aqua corrente per 12-13 minuti e nuovamente immersi per 1 minuto in acqua distillata. Segue la colorazione mediante Eosina in soluzione acquosa allo 0,5% per 5 minuti. Dopo un lavaggio in acqua distillata per 1 minuto, segue il procedimento di disidratazione.
I vetrini vengono posti in bagno di etanolo all'80% per 1 minuto, al 90% per 1 minuto, al 96% per 1,5 minuti e due bagni in etanolo assoluto di 2 minuti ciascuno. Seguono due lavaggi di 2 minuti ciascuno in Xilene.
Infine vengono montati i vetrini copri oggetto mediante “Eukitt”. Ciascun vetrino viene lasciato sotto cappa chimica per almeno 30 minuti dopo di che vengono mantenuti in posizione orizzontale per qualche giorno.
2.22 Ibridazione in situ “whole mount”
L’ibridazione in situ su embrioni interi permette di studiare il “pattern” di espressione dei geni durante lo sviluppo embrionale di Xenopus laevis mediante l’ibridazione delle sonde, marcate con DIG-11-UTP, agli mRNA presenti nei tessuti.
Gli embrioni, che sono conservati in etanolo assoluto in “vial” di vetro da 4 ml, vengono gradatamente reidratati, effettuando lavaggi di 5 min ciascuno, in una serie graduale di alcoli a concentrazione decrescente:
etanolo 75%, PBTw 25% etanolo 50%, PBTw 50% etanolo 25%, PBTw 75%
Vengono poi effettuati 2 lavaggi da 5 minuti in PBTw 100%. Dopo l’ultimo lavaggio in PBTw gli embrioni vengono incubati per 5 minuti in verticale a RT in 1ml di PBTw-Proteinasi K (10µg/ml). Questo passaggio è molto delicato e la sua durata deve essere controllata con precisione in quanto una permanenza troppo lunga in questa soluzione potrebbe danneggiare gli embrioni. Si lava 2 volte per 1 minuto con PBTw, sull’agitatore in posizione verticale, sempre a RT.
Si procede con un passaggio di fissazione in paraformaldeide 4% in PBS a RT per 20 minuti esatti, ruotando delicatamente le “vial” ogni 5 minuti. Gli embrioni vengono poi lavati brevemente 2 volte con PBTw, seguono 4 lavaggi di 5 minuti ciascuno in oscillazione orizzontale. Si rimuove quindi il PBTw da ogni provetta e lo si sostituisce con una soluzione costituita dal 50% da miscela di ibridazione e dal 50% da PBS, disponendo le “vial” sull’agitatore verticalmente per 3 minuti: questo passaggio è necessario per equilibrare gli embrioni alla nuova densità della miscela di ibridazione. Si ripete il passaggio utilizzando una soluzione composta al 100% da miscela di ibridazione, trascorsi i 3 minuti, si sostituisce con della nuova miscela di ibridazione, e si trattano gli embrioni per 2-3 ore a 60°C (questo passaggio è definito pre-ibridazione).
Intanto una quantità di 50 ng di sonda ad RNA viene portata al volume di 10µl con H2O mQ,
denaturata per 2 minuti a 95°C e posta subito in ghiaccio per 2 minuti. Alla sonda così preparata vengono aggiunti 600 μl di miscela di ibridazione.
Segue la fase di ibridazione in cui il tampone di preibridazione viene sostituito con la sonda diluita in miscela di ibridazione. L’ibridazione dura 12-16 ore a 60 °C. Una volta rimosso, il tampone di ibridazione contenente la sonda può essere conservato e riutilizzato fino a due/tre volte.
A questo punto è necessario lavare l’eccesso di sonda non ibridata o ibridata in maniera aspecifica; a tale scopo si effettuano lavaggi a forza ionica decrescente, per aumentarne la stringenza.
Si sostituisce la miscela di ibridazione contenente la sonda con 1 ml di una soluzione composta per il 50% da miscela di ibridazione e per l’altro 50% da 2X SSC/0,1X CHAPS preriscaldato a 37°C. Questo passaggio prevede due incubazioni da 5 minuti ciascuna in oscillazione verticale. Seguono due lavaggi da 30 minuti a 37°C con 2X SSC/0,1X CHAPS, un lavaggio di 5 minuti con 0,2X SSC/0,1X CHAPS a 60 °C preriscaldato e due incubazioni da 30 minuti ciascuna a 60°C con 0,2X SSC/0,1X CHAPS. Infine viene effettuato un lavaggio di 5 minuti con 1 ml di una soluzione composta per il 50% da 0,2X SSC/0,1X CHAPS e dal 50% da TBS 1X. Prima di iniziare la procedura di incubazione con anticorpo, si lava con 1 ml di TBSX per 5 minuti a RT in agitazione verticale.
Segue una preincubazione di 2 ore a 4°C in agitazione verticale, in 1 ml di “blocking buffer”. Si incuba poi per 4 ore a RT o a 4°C O/N con anticorpo policlonale anti-DIG coniugato con la fosfatasi alcalina e diluito 1/3500 in “blocking buffer” anch'esso preincubato precedentemente per 2 ore a 4 °C. Il “blocking buffer” è una soluzione contenente un estratto di uova al 5% che serve a ridurre il segnale aspecifico.
O/N a 4 °C.
Per rimuovere l’eccesso di anticorpo si procede con ulteriori 5 lavaggi in TBSX a temperatura ambiente di 1 ora ciascuno.
Seguono quindi 2 lavaggi di 10 minuti a temperatura ambiente in 2 ml di un tampone per la fosfatasi alcalina (“AP buffer”) a cui si aggiunge levamisol (inibitore delle fosfatasi endogene).
A questo punto si aggiungono 500 μl di “BM-purple”, il substrato cromogenico della fosfatasi alcalina. Questa sostanza conferisce una colorazione blu intenso alle cellule contenenti la fosfatasi alcalina e che quindi esprimono il gene di nostro interesse. La reazione colorimetrica viene protratta per un tempo variabile (da 1 ora a 7 giorni) a RT, fino al raggiungimento di un segnale soddisfacente. Questa deve avvenire al buio, per questo motivo le “vial” devono essere coperte da un foglio di alluminio. Una volta che la reazione cromogenica è terminata si rimuove il tampone per la fosfatasi alcalina e si fissano gli embrioni per almeno 1 ora con MEMFA (oppure O/N a 4°C) per stabilizzare la colorazione. Gli embrioni così fissati possono essere conservati in metanolo o etanolo a -20°C.
Soluzioni
PBS (per 1 litro)
NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 15.56g KH2PO4 2 g“Hybridization mix”
Formammide 50% SSC 5X RNA di Torula 1mg/ml Eparina 100µg/ml Denhart’s 1X Tween-20 0.1% CHAPS 0.1% EDTA10mMPBTw
PBS 1X Tween 20 0,1%TBS (per 1 litro)
NaCl 80 g KCl 2 g Tris base 30 gTBSX
TBS 1X Triton X-100 0,1%AP-Buffer (“Alkaline phosphatase buffer”)
Tris HCl 100 mM pH 9,5 MgCl250 mM NaCl 100 mM Tween 20 0,1% Tetramisole 2 mM“Egg extract”
Per questa preparazione vengono omogenizzati embrioni/uova conservati a -20°C in 1 volume di PBS 1X. Si procede con una centrifugazione di 10 minuti a 4 °C a 12000 rpm, e con il recupero della fase acquosa che viene sottoposta altre 5 volte alla stessa procedura. Si denatura a 56°C per 15 minuti la soluzione ottenuta e si centrifuga a 12000 rpm per 10 minuti a 4°C, viene aliquotata e conservata a -20°C.
Blocking solution
TBSX 1X 1,6 ml
Heat inactivated lamb serum 300 µl Egg extract 100 µl
Roche blocking reagent 400µl
2.23 Depigmentazione (“bleaching”)
Questa tecnica si utilizza per evidenziare il segnale proveniente dalla reazione colorimetrica mediante la depigmentazione gli embrioni con perdita minima di segnale.
100%, segue un lavaggio di 5 minuti con etanolo 70% e infine si lava con una soluzione composta al 50% di etanolo e al 50% di SSC 1X.
Si passano quindi gli embrioni nella soluzione depigmentante, contenente SSC 0.5X, H2O2 1%,
Formammide 5%, lasciando i tubi sull’agitatore e sotto una lampada per circa 1-2 ore. A questo punto gli embrioni vengono lavati per 5 minuti con etanolo 70% e poi conservati in etanolo assoluto a -20°C.
2.24 Fotografie
Le fotografie degli embrioni interi sono state realizzate mediante una fotocamera digitale Roper Coolsnap CF montata in asse focale ad uno stereoscopio Nikon SNZ 1500 con l’ausilio di una coppia di fibre ottiche Glli/136P. Il trattamento delle immagini è stato realizzato con l’ausilio del Software Gimp 2.
2.25 Microfotografie
I preparati istologici sono stati analizzati utilizzando un microscopio Nikon Eclipse 600, dotato di obiettivi 4X, 10X, 20X e 40X. Le osservazioni in luce bianca state effettuate contrastando i preparati con il dicroismo circolare (DIC). Le immagini sono state acquisite con una fotocamera digitale Photometrix, modello ”Cool Snap”, dotata di sensore CCD a colori con dinamica di 12 bit per canale e risoluzione 1,3 Mpixels. Le immagini sono state trattate mediante il programma di elaborazione Gimp 2.
