Capitolo 2
2 - MATERIALI E METODI
2.1. DESCRIZIONE DEL SITO DI STUDIO
I due esperimenti oggetto della tesi sono stati svolti lungo un tratto di costa rocciosa di circa 1,5 Km in località Calafuria (43° 30’N, 10° 20’E), a sud di Livorno (Fig. 2.1), nel Mar Ligure meridionale. La zona, che risulta particolarmente esposta al moto ondoso, è rivolta ad Ovest-Sud-Ovest, ed è battuta principalmente dai venti del III e del IV quadrante, anche se i venti più costanti risultano essere quelli provenienti dal I e dal II (Cinelli 1969). La roccia è costituita da arenaria che, notevolmente soggetta a fenomeni di erosione, fa si che il substrato risulti molto frastagliato e ricco di anfratti e fratture. La distribuzione spaziale degli organismi animali e vegetali sulla battigia della costa appare piuttosto discontinua, presentando in brevi tratti una evidente ripartizione verticale ed in altri una distribuzione apparentemente casuale.
I due esperimenti sono stati allestiti ad un’altezza variabile tra 0 e –0.3 m al di sotto del livello medio di bassa marea. A questa altezza sulla costa i popolamenti sono caratterizzati da diverse categorie morfologiche di alghe, quali corallinacee incrostanti (Lithophyllum orbiculatum (Foslie) Foslie e le
basi incrostanti di Corallina elongata Ellis et Solander e l’alga bruna
Nemoderma tingitanum Schousboe ex Bornet), corallinacee articolate
(Corallina elongata, Jania Rubens (Linné), Haliptylon virgatum (Zanardini) Garbari & Johansen), alghe a tallo carnoso (Chondria boryana (De Notarsi) De Toni, Gastroclonium clavatum (Roth) Ardissone, Laurencia spp., Hypnea
musciformis (Wulfen) J.V. Lamouroux ) e alghe a tallo laminare (Padina pavonica (Linnaeus), Dictyota dicotoma (Hudson) J.V. Lamouroux, Dictyopteris membranacea (Stackhouse) Batters). Un’altra categoria ben
rappresentata è quella delle alghe filamentose, che include alghe verdi quali
Chaetomorpha aerea (Dillwyn) Kützing e Cladophora spp., e le alghe rosse Polysiphonia sertularioides (Grateloup) J. Agardh, Ceramium spp. e Callithamnion granulatum (Ducluzeau) J. Agardh. A questo stesso livello si
trovano inoltre mitili (Mytilus galloprovincialis Lamark) frammisti all’alga bruna Cystoseira compressa (Esper) Gerloff & Nizamuddin. Frequenti sul substrato di tutta la fascia studiata si trovano colonie di cianobatteri appartenenti per lo più alle specie Rivularia atria Roth e Rivularia
mesenterica Thuret. Gli erbivori più comuni sono rappresentati da patelle
quali Patella aspera Roding e Patella coerulea Linnè e da altri gasteropodi quali Osilinus turbinatus (Van Bon). Altri invertebrati includono il cirripede
Balanus glandula Darwin ed il polichete cubicolo Vermetus triqueter
Fig. 2.1. E’ tracciato il profilo costiero del tratto di costa a sud di Livorno. La
2.2 ESPERIMENTO 1 – Disegno sperimentale e analisi dei dati.
Il primo studio testa l’ipotesi che variazioni nel numero, nell’identità e nella densità di Cystoseira compressa e Mytilus galloprovincialis comportino risposte differenziate da parte degli altri organismi che popolano la fascia intertidale di costa rocciosa, tramite un esperimento di rimozione iniziato nel Novembre 2003.
Nella fase iniziale dello studio sono stati scelti nella fascia bassa della battigia 33 quadrati di 30x30 cm, con una copertura percentuale di circa il 30% di C. compressa e di circa il 30% di M. galloprovincialis; i quadrati sono stati delimitati marcandone gli angoli con stucco epossidico bicomponente di colore blu (Subcoat S, Veneziani), così da poter essere facilmente individuati successivamente. La copertura percentuale di ciascuna delle due specie in esame è stata stimata tramite l’utilizzo di un campionatore costituito da un telaio di forma quadrata, in plastica, di 30x30 cm, suddiviso in 25 sottoquadrati di 6x6 cm. ciascuno. Per ciascuna specie la presenza in un sottoquadrato è stata indicata con un valore da 0 a 4 %, e la copertura totale è stata determinata sommando le coperture parziali ottenute dai vari sottoquadrati (Dethier et al. 1993; Benedetti-Cecchi et al. 1996). La stessa procedura è stata utilizzata per quantificare la copertura percentuale degli altri
organismi sessili presenti, mentre per quantificare l’abbondanza delle specie mobili o degli anemoni si è proceduto al conteggio dei singoli individui.
Alla prima fase di individuazione e campionamento dei quadrati è succeduta una seconda fase, in cui le densità delle due specie in esame sono state modificate allo scopo di ottenere i trattamenti desiderati.
Tre quadrati, successivamente indicati come “controlli” (Contr), sono stati selezionati in modo casuale tra i 33 disponibili e le densità relative di C.
compressa e M. galloprovincialis sono state mantenute nel tempo al 30% così
che la densità totale di specie a morfologia complessa fosse del 60%.
I rimanenti quadrati sono stati assegnati in modo casuale agli altri trattamenti (Altri), che includevano 4 diversi livelli di densità totale (D): 50%, 40%, 30%, 0%.
Con l’eccezione dello 0% (A=assenza), in cui le due specie considerate sono state rimosse completamente, in tutti gli altri livelli di densità era presente almeno una delle due SMC (P=presenza). Allo scopo di distinguere gli effetti imputabili alla densità da quelli dovuti all’identità della specie manipolata, ognuno dei livelli P è stato incrociato con tre livelli di identità di SMC manipolate (I=identità): solo C. compressa rimossa (-C), solo M.
galloprovincialis rimosso (-M), rimozione di entrambe (-C-M) (Fig. 2.2). Per
ogni tipologia di trattamento sono state effettuate tre repliche, per un totale di 33 quadrati. E’ da notare che alla densità del 30% la rimozione di una sola
delle due specie (trattamenti –C e –M) è risultato nella completa assenza dal quadrato della specie stessa. Questo ha permesso di testare l’effetto, a questa densità, del numero di SMC presenti (contrasto 2 vs 1) e dell’identità dell’unica SMC presente (Mp vs Cp).
La fase di rimozione è avvenuta utilizzando una spatola, tramite cui si è proceduto ad asportare sia le fronde che le basi della Cystoseira, e le valve ed i filamenti del bisso dei mitili. Durante queste operazioni è stata prestata attenzione sia a non danneggiare le altre specie presenti, sia a non alterare la morfologia del substrato. La densità delle specie è stata mantenuta attraverso frequenti visite al sito di studio.
I quadrati sono stati campionati in tre date (Marzo 2004, Dicembre 2004 e Settembre 2005), ed i dati raccolti sono stati analizzati mediante analisi della varianza sia univariata (ANOVA) che multivariata (PERMANOVA – Permutational Multivariate Analysis of Variance, Anderson 2001). Prima di ogni analisi univariata è stata valutata l’omogeneità delle varianze attraverso il test C di Cochran (Winer 1971; Underwood 1997). In caso di significatività del test le eterogeneità sono state eliminate trasformando i dati originali (Ln (x+1)). Nel caso di risultati significativi, si è compiuto un test per confronti multipli a posteriori utilizzando il test SNK (Student – Newman - Keuls). Nel caso delle analisi multivariate si è utilizzato il test t di Student come test a
C vs Altri P vs A D 60% 50% 40% 30% 0% (Contr) (Ass.) I -C-M -C -M -C-M -C -M -C-M -C -M -C-M densità 30C 25C 20C 30C 20C 10C 30C 15C 0C 30C 0C relative 30M 25M 30C 20M 20M 30M 10M 15M 30M 0M 0M 2 vs 1 (# specie presenti) Mp vs Cp (specie presenti)
Figura 2.2. Rappresentazione schematica dei tipi di trattamento presenti
nell’esperimento. C = Controlli, Altri = altri trattamenti, D = livelli di densità, A = assenza di specie, P = Presenza di almeno 1 CM, I = identità della specie manipolata. In figura sono mostrati anche i contrasti alla densità del 30%. 2 vs 1 = 2 specie presenti contro 1 specie presente, Mp vs Cp = solo
M. galloprovincialis presente vs solo C. compressa presente.
Allo scopo di testare l’influenza dei diversi fattori sulle caratteristiche del popolamento la variabilità totale è stata scomposta in numerosi contrasti, e tutti gli effetti sono stati testati sul Mean Square residuo (Tab. 2.1).
Tabella 2.1. Tabella relativa alla ripartizione della sorgente totale di
variabilità. Abbreviazioni come in Fig. 2.2.
Sorgente di g.l. Denominatore
variabilità
Tipologia di quadrato 10 Residuo Contr vs Altri 1 Residuo
Tra Altri 9 Residuo
Presenza vs Assenza =PvsA 1 Residuo
Tra P 8 Residuo
30 vs altre densità 1 Residuo A densità 30 2 Residuo
2 vs 1 1 Residuo
Mp vs Cp 1 Residuo
Ad altre densità 5 Residuo Identità =I 2 Residuo Densità =D 1 Residuo
IxD 2 Residuo
Residuo 22
I dati multivariati sono stati visualizzati attraverso l’analisi canonica (discriminante) delle coordinate principali (CAP) (Anderson and Willi 2003), un metodo di ordinamento in due dimensioni basato sull’indice di similarità di Bray-Curtis. Si tratta di un processo in due fasi, che combina due tecniche multivariate già esistenti: un classico scaling multidimensionale (PCO) seguito da un’analisi canonica discriminante (CDA) sugli assi calcolati dalla PCO.
Per identificare le specie o i gruppi morfologici maggiormente responsabili del pattern multivariato individuato dalla PERMANOVA è stato utilizzato il programma IndVal. Questo metodo combina l’abbondanza relativa e la frequenza delle specie nei vari gruppi di campioni per riconoscere le “specie indicatrici”. Queste ultime sono definite come le specie più caratteristiche di ciascun gruppo, presenti soprattutto in un singolo gruppo e nella maggioranza dei campioni di quel gruppo stesso (Dufrene e Legendre 1997). L’ “Indicator Value” (IndVal) è ottenuto come prodotto di una misura di “specificità” (l’abbondanza media di una specie in un gruppo di campioni rispetto a tutti i gruppi) per una misura di “fedeltà” (la frequenza relativa di occorrenza di una specie nei campioni appartenenti a quel gruppo).
2.3 ESPERIMENTO 2 – Disegno sperimentale e analisi dei dati.
Il secondo studio testa l’ipotesi che variazioni nel numero, identità e densità degli organismi che costituiscono i popolamenti precoci influenzino le caratteristiche dei popolamenti successivi tramite un esperimento di assemblaggio.
La necessità di creare popolamenti costituiti da un ridotto numero di taxa a densità controllata su substrato roccioso ha reso indispensabile la creazione di supporti artificiali. Sono quindi stati creati supporti costituiti da una base in acciaio inox con una parte centrale di 8x12 cm, in cui sono stati praticati 24 fori (4 file di 6) ed un bordo in corrispondenza dei lati minori, in cui sono stati praticati 2 fori per lato, necessari per il fissaggio del pannello al substrato. Si è quindi proceduto a fissare ai supporti (tramite rondelle dentate e bulloni) 24 cubetti di arenaria di 2x2x2 cm muniti di barre filettate. In questo modo si sono ottenuti 140 pannelli, ognuno costituito da una superficie rettangolare di 96 cm2, suddivisa in 24 subunità quadrate di 4 cm2 ciascuna, cosicché su ognuna di esse potesse crescere soltanto un esiguo numero di specie.
Nel Luglio 2004 i pannelli sono stati fissati nella fascia bassa della battigia. Nel Giugno 2005 si è proceduto alla rimozione dei singoli cubetti da
ciascun pannello, così da poter comporre le vere e proprie unità sperimentali, ciascuna composta da 16 cubetti (4x4).
Ad 11 mesi dalla messa in opera i pannelli sono risultati colonizzati da popolamenti piuttosto diversificati, ma è stata osservata una abbondante presenza di alghe corallinacee incrostanti, sia come uniche colonizzatrici di interi pannelli che come sottostrato in tutti i pannelli che contenevano altri taxa. Tra gli altri organismi più abbondanti, alcune categorie morfologiche sono state selezionate in modo casuale per essere manipolate nell’esperimento insieme alle corallinacee incrostanti: l’alga rossa filamentosa Polysiphonia
sertularioides (P) (particolarmente abbondante e ben distinguibile), batteri
incrostanti del genere Rivularia, alghe verdi filamentose (V) e le alghe rosse filamentose a tallo uniseriato Ceramium spp. e/o Callithamnion granulatum (CC).
Il disegno sperimentale utilizzato ha previsto un fattore densità (DE), con due livelli: Bassa (6 cubetti colonizzati) e Alta (12 cubetti colonizzati). Per ciascun livello di densità erano presenti 7 tipologie di popolamenti. Un primo popolamento era costituito da sole alghe corallinacee incrostanti (CI), quale unico trattamento realistico (cioè presente naturalmente sui pannelli) caratterizzato dalla presenza di una sola categoria morfologica (1 CM). Due popolamenti con due categorie morfologiche (2 CM) sono stati ottenuti selezionando in modo casuale due tipologie di organismi tra quelli presenti in
maggiore abbondanza, nel caso specifico cianobatteri del genere Rivularia (CI+Batt) e l’alga rossa Polysiphonia sertularioides (CI+P). Lo stesso procedimento è stato utilizzato per selezionare altre due categorie morfologiche per creare i popolamenti con 4 CM, da accoppiare alle corallinacee incrostanti, i cianobatteri e la P. sertularioides: le alghe verdi filamentose (CI+Batt+P+V) e Ceramium/C. granulatum (CI+Batt+P+CC). Allo scopo di poter discriminare gli eventuali effetti del numero di categorie morfologiche da quelli imputabili all’identità delle categorie presenti, si è reso necessario implementare il disegno sperimentale tramite l’inserimento di ulteriori due popolamenti caratterizzati da 2 categorie morfologiche (2a CM), e precisamente “CI+V” e “CI+CC”. Era infine presente un ulteriore trattamento che ha previsto l’assenza, ad occhio nudo, di qualsiasi specie dai pannelli (0 CM), ottenuto assemblando cubetti provenienti da pannelli gia colonizzati, dai quali sono state rimosse le specie presenti tramite spazzole di ferro e taglierino. Cubetti trattati con la medesima procedura sono stati utilizzati per completare la composizione dei pannelli ad alta e bassa densità. In figura 2.2 sono indicati i vari tipi di popolamenti ottenuti e l’abbondanza relativa (come numero di cubetti) delle varie CM presenti.
Nel settembre 2005, circa tre mesi dopo l’assemblaggio dei popolamenti sperimentali, si è proceduto al campionamento degli organismi presenti sui pannelli. I dati sono stati raccolti con metodi non distruttivi attraverso
l’utilizzo di campionatori in plastica di 8x8 cm, suddivisi in 16 subquadrati di 2x2 cm. I ricoprimenti dei taxa sono stati stimati come descritto per il I esperimento e successivamente riportati al 100%. I dati sono stati analizzati e visualizzati con le stesse procedure utilizzate per l’esperimento precedente. In questo caso la variabilità totale è stata scomposta come mostrato in Tab. 2.2, dove sono anche indicati i denominatori appropriati per ciascuna sorgente di variabilità. In particolare i pannelli “vuoti” (0 CM) sono stati inizialmente contrastati con gli altri trattamenti (0 vs Altri). Il Mean Square degli Altri è stato a sua volta diviso tra un fattore fisso “Densità” (DE) e la variabilità tra tipi di popolamento (tra loro ortogonali). Questi ultimi sono stati divisi in un contrasto tra popolamenti con 1 CM e gli altri (1CM vs >1CM) e, per i popolamenti con più di una CM, in un fattore fisso “Numero” di CM (tre livelli: 2, 2a e 4) e un fattore random “Composizione” (2 livelli), gerarchizzato in “Numero”. Il fattore Numero è stato infine diviso in due ulteriori contrasti, per separare l’effetto del numero di taxa (2 vs 4) dalla loro identità (2 vs 2a) (Benedetti-Cecchi 2004).
Tab 2.2 Tabella relativa alla ripartizione della sorgente totale di variabilità.
CM = Categorie morfologiche, DE = Densità, 1CM = una sola categoria morfologica, >1 CM = popolamenti con più di una categoria morfologica; 2, 2a, 4 come nel testo.
Sorgente di g.l. Denominatore variabilità Trattamento 14 0 vs Altri 1 Residuo Tra Altri 13 Densità 1 DExComposizione(Numero) 1CM vs >1CM 1 Composizione(Numero) Tra >1CM 5 Numero 2 Composizione(Numero) 2 vs 4 1 Composizione(Numero) 2 vs 2a 1 Composizione(Numero) Composizione (Num) 3 Residuo
DEx(1CM vs >1CM) 1 DExComposizione(Numero) DExTra >1CM 5
DExNum 2 DExComposizione(Numero)
DEx(2 vs 4) 1 DExComposizione(Numero) DEx(2 vs 2a) 1 DExComposizione(Numero)
DexComposizione(Num) 3 Residuo Residuo 45
