Capitolo 2: Inibitori del TACE e di ADAMTS-5.
2.1. Inibitori sintetici del TACE.
La maggior parte degli inibitori selettivi sul TACE deriva dall’ottimizzazione degli inibitori delle MMPs a largo spettro, dai quali spesso riprendono lo scaffold, e come questi vanno ad esplorare quasi esclusivamente il primed site a destra dello zinco catalitico. Difatti, come gli inibitori delle MMPs, gli inibitori del TACE sono costituiti da un gruppo funzionale ZBG (Zn Binding Group), per lo più un idrossammato, da uno scaffold peptidico o peptidomimetico che interagisce con l’enzima e da un sostituente P1’ lipofilico che si introduce nella tasca S1’. I primi inibitori del TACE sono stati
studiati mediante un approccio di tipo structure-based, in quanto non era nota la struttura cristallizzata dell’enzima, apportando delle modifiche prima ai succinil idrossamati, come il Marimastat, poi agli idrossammati solfonammidici, e l’attività delle molecole ottenute veniva valutata per analogia con la struttura della MMP-3. Tra le molecole sviluppate negli ultimi anni soltanto poche di esse si sono affacciate alla fase clinica, perché oltre ad esservi problemi di selettività, spesso i dati dell’attività sull’enzima in vitro sono discordanti da quelli ottenuti sulle cellule. Un esempio di questo fallimento è proprio il Marimastat che in vitro ha un IC50 < 100 nM ma sulle
cellule ha un IC50 di almeno 2µM.
Studi di docking con il succinilidrossammato Marimastat hanno illustrato che l’isobutile P1’ si inserisce nella tasca S1’ ma non la riempe, il che ha suggerito che per
aumentare l’affinità potevano essere utili sostituenti più ingombranti o che sfruttavano anche la tasca S3’ (Fig. 2.1).
N H H N N H HO O OH O O Marimastat
Fig. 2.1: Docking del Marimastat nel TACE 7.
Molecole più attive sono state ottenute ramificando la posizione in α all’idrossammato degli inibitori di tipo succinico, fino ad ottenere molecole capaci di inibire il rilascio di TNFα nel sangue con un IC50 inferiore al micromolare. Il composto 2 ha una Ki di 0,57 nM in vitro e 280 nM nel sangue.
N H H N N H HO O NH O O O2S N NH O Composto 2
Come gruppi funzionali sono stati anche testati le N-idrossiformammidi o idrossammati inversi. Il composto 3 è un potente inibitore del TACE e delle MMPs (Ki=4 nM) e inibisce il rilascio di TNFα con IC50 di 34 nM nel sangue. In seguito, al fine di
migliorare la stabilità e la biodisponibilità, sono stati sintetizzati derivati dove è stato introdotto un metile in posizione P2’ dell’arginina che ne ha aumentato la
H N OH O O H N N H O N Composto 4 Composto 3
Inizialmente furono sintetizzati anche dei macrocicli, ovvero molecole che univano le porzioni P1 e P2’. Un esempio è il composto 5 che in vitro ha sul TACE una Ki di 2.8 nM, sulle cellule ha un IC50 di 70 nM ed è circa 1000 volte più selettivo su questo che
non sulle MMP-1, -2, -9; ma in vivo, a causa dell’elevato peso molecolare, non è biodisponibile. CF3 HOHNOC O N H O H N O N O O O H N Composto 5
Per migliorare le proprietà biofarmacologiche e migliorare la selettività degli inibitori del TACE, un approccio che è stato seguito è quello di introdurre la struttura di succinil idrossammati in sistemi ciclici semirigidi. Questo metodo conferisce un’appropriata orientazione tra lo ZBG e il sostituente in P1’. Su queste basi Xue e coll. hanno
H N OH O O H N NH NH NO2 HN N H O S N
sviluppato una classe di inibitori di tipo piperidincarbossammidico, partendo dal composto 6. N O H N HO O Composto 6
Il composto 6 è un potente inibitore del TACE, con un IC50 di 6.2 nM, selettivo
nell’ordine del µM nei confronti delle MMP-1, -2 e -9 ed è risultato attivo in vivo sull’inibizione del rilascio del TNF-α con un IC50 = 20 nM 33. Il composto 7, sintetizzato
in seguito, incorpora nella struttura un gruppo chinolinico che si inserisce nella tipica forma ad L dei domini S1’-S3’ dell’enzima. Questo composto ha una Ki= 2pM e risulta molto selettivo sul TACE. La struttura cristallizzata del TACE in presenza del composto
7 mostra come il gruppo chinolinico si inserisce perfettamente nella tasca tra S1’ e
S3’conferendo un’eccezionale affinità e selettività a questo inibitore (Fig. 2.2) 34.
N O H N HO O O N Composto 7
Fig. 2.2: Rappresentazione del dominio catalitico del TACE in presenza del composto 7 34.
Un altro approccio è stato quello di bloccare l’orientamento della molecola facendo una ciclizzazione tra i sostituenti in α e in β all’ idrossammato ottenendo sia derivati pentaciclici che esaciclici dove è necessario che i due gruppi carbonilici siano in configurazione trans. Il composto più attivo della serie è il derivato esaciclico 8 che ha in P1’ il sostituente 4-chinolinmetossi-fenilico, che è stato riconosciuto uno tra i gruppi
più selettivi per il TACE. Nonostante questa molecola abbia un IC50 di 8 nM sul TACE
e abbia un’eccellente selettività su questo rispetto alle MMP-1, -2, -9, e alle aggrecanasi è inefficace quando testata sulle cellule indotte da TNFα perché probabilmente l’anello cicloesilico è troppo lipofilo e tende a legarsi alle proteine plasmatiche35. Dalla procedura di ottimizzazione è stato ottenuto il composto 9 che ha un IC50 di 6.2 nM sul
TACE, 20 nM sulle cellule indotte da TNFα ed ha una buona biodisponibilità (43%) 35.
N H O HOHNOC O N N CONHOH N H O O N Composto 8 Composto 9
È, tuttavia, congiungendo alcuni gruppi eterociclici P1' con scaffold idrossammici ß-amino ciclici che si sono ottenuti inibitori potenti ed estremamente selettivi sul TACE. Tra questi il nucleo pirazolpiridinico si è dimostrato essere il migliore, quando combinato con lo scaffold idrossammico ß-amino tetraidropiranilico. Il composto 10 ha inoltre dimostrato una eccellente selettività verso il TACE rispetto a molte MMPs e una buonissima biodisponibilità (F% > 90%) in studi sul modello animale. È, infatti, giocando sul sostituente P1' dell’inibitore, e quindi sulla tasca S1' del TACE, che si acquisisce selettività 36. HO H N O O HN O N N F3C Composto 10
Uno degli approcci maggiormente seguiti resta tuttavia quello di basarsi sullo scaffold solfonammidico. Levin e coll. basandosi sulla struttura del composto 11 (avente un profilo simile al Marimastat), hanno sintetizzato il composto 12, che è risultato molto attivo sul TACE, (IC50= 2nM) abbastanza selettivo in vitro e attivo nei saggi cellulari 37.
N H HO O N S O O O N N H HO O OH O2S O Composto 11 Composto 12
In parallelo sono stati sintetizzati analoghi ciclici, come la tiomorfolino solfonammide
13 che è risultata attiva ma poco selettiva38. Invece il composto 14, ha un nuovo
scaffold semirigido in posizione P1-P3’, di tipo solfonico-piperidinico, che permette di discriminare tra MMPs e TACE sfruttando le differenze dei sottositi S3-S1’ 39 .
N H HO O O2S O N S N O2 S HO O O Cl Composto 13 Composto 14
Queste due nuove classi di inibitori, hanno portato all’ottenimento di idrossammati attivi come il composto 15 che ha un IC50= 50 nM ed è selettivo nell’ordine del µM nei
confronti delle MMP-1, MMP-9, MMP-13, e il composto 16 che è ancora più potente e selettivo sul TACE (IC50= 2.2 nM). Alcuni degli inibitori appartenenti a questa classe
sono risultati molto attivi in vivo sull’inibizione del rilascio del TNFα nel modello animale 40.
HO H N O O O O N N O2 S N H HO O O Cl S O2 O N N H HO O O N Composto 15 Composto 16
Nel 2008 Zhu e coll. hanno individuato un nuovo modello farmacoforico capace di interagire in modo selettivo con il TACE. In questi studi, sono stati sintetizzati acidi idrossammici benzilciclopropilici tra i quali, i composti maggiormente attivi sono il composto 17 e il composto 18. HO N H O O O O N Composto 17 Composto 18
Il composto 17 proietta il gruppo chinolinico verso il sottosito S3’ attraverso la tasca S1’, mentre il composto 18 si estende in direzione opposta con i gruppi carbossimetossilico e chinolinico diretti rispettivamente verso i sottositi S1 e S3 (Fig. 2.3).
Questi due tipi di legame diversi sono attribuibili al differente profilo di selettività verso il TACE ed hanno illustrato come lo studio dei vari sottositi sia fondamentale per la ricerca di inibitori selettivi. Infatti il primo tipo di legame risulta più selettivo sul TACE
rispetto alle altre MMPs, probabilmente per la forma della tasca S3’ che nel TACE è molto diversa 41.
Fig.2.3: (a) Sovrapposizione delle strutture a raggi-X dei composti 17 e 18 nel TACE.
Fig. 2.3:(b) Interazioni chiave di 17(verde) con il TACE. (c) Interazioni chiave di 18(giallo) con il TACE 41.
Composti che risultano essere ottimi inibitori, non sfruttando una porzione idrossammica, sono costituiti dalla serie delle triptofan solfonammidi non idrossammati, che contengono un motivo butinilossi come P1'. La relazione struttura-attività di questa serie è stata studiata mediante la sostituzione dell’anello triptofanindolico. Di tutta la serie sintetizzata i migliori composti si sono dimostrati essere il composto 19 (IC50 su
TACE di 0,14 nM) e il composto 20 (IC50 su TACE di 0,08 nM); il primo ottenuto dalla
sostituzione in -5 dell’indolo con un metile ed il secondo modificato sull’azoto indolico con un gruppo p-metossi-benzilico.
N H O HO H N S O O O N O HO H N S O O O OCH3 Composto 19 Composto 20
In particolare, il composto 19 chela lo zinco catalico grazie all’acido carbossilico e tende a disporre il gruppo butinilossi P1' tra le tasca S1' e S3' del TACE (Fig. 2.2) 42.
Fig.2.4: Complesso a raggi-X di 19 legato al TACE (risoluzione di 2.1 Å). Tre istidine e il carbossilato
coordinano lo zinco del sito attivo (sfera gialla)42.
Alcuni derivati ureici ciclici invece sono stati sintetizzati considerando che diversi studi
di molecular modeling hanno evidenziato che questo tipo di ZBG chela in maniera monodentata lo Zn, e partecipa a nuove interazioni nelle vicinanze del sito catalitico43.
Su queste basi è stato sintetizzato il composto idantoinico 21 che è risultato un buon inibitore selettivo del TACE (IC50 = 9nM).
Sempre nel caso di inibitori non-idrossammati il composto 24 è stato sintetizzato considerando il modello “classico” sulphonamido-based del composto 22 passando
attraverso la struttura ciclica del composto 23 arrivando ad avere una struttura tiolica,
sulfone- based . Il composto 24, è risultato molto attivo (IC50= 10 nM) e selettivo se
confrontato con MMP-2, MMP-7, MMP-8,MMP-9 e MMP-13 44 . N H O O N HN N H O O Composto 21 O SO2 N N H HO O O SO2 N HS O SO2 HS
Composto 22 Composto 23 Composto 24
Un'altra serie di inibitori è quella di tipo fosfonammidico, che è stata sintetizzata a partire dal presupposto che un altro Zn-Binding-Group possibile è quello di tipo fosfinico , come illustrato in Fig. 2.5 34.
Fig. 2.5: Rappresentazione schematica dei sottositi dell’enzima e il legame con una sequeza peptidica di
Su queste basi sono stati sintetizzati diversi composti tra cui il composto 25 e il composto 26. Basandosi su studi cristallografici, utilizzando la struttura X-ray del TACE si è visto che la funzione esterea del composto 25 non può orientarsi in maniera corretta nella tasca S1’ dell’enzima a causa della restrizione conformazionale indotta del sistema bicilico. È stato quindi dedotto che un aumento di flessibilità nella struttura avrebbe favorito l’interazione con l’enzima, e questo ha portato alla sintesi del composto aciclico 26 che è infatti risultato attivo sul TACE (Fig. 2.6) 45.
CONHOH P O O CF3 O HN CONHOH P O O O Composto 25 Composto 26
2.2. Inibitori sintetici di ADAMTS-5.
I primi inibitori sintetici dell’aggrecanasi-2, come quelli del TACE, sono stati sintetizzati mediante un approccio structured-based, utilizzando un gruppo che andasse a chelare lo Zn (ZBG), uno scaffold peptidico o peptidomimetico e un sostituente P1’
lipofilico tale da introdursi nella tasca S1’. Tuttavia, alcuni studi hanno rivelato che
l’inibizione di ADAMTS-5 non è guidata solo da interazioni specifiche, come l’interazione con lo Zn e i legami a H ma da una complessa rete di fattori indiretti, come la rigidità degli anelli, la forma e la dimensione della tasca S1’, e la flessibilità conformazionale della proteina stessa 46.
I primi studi sono stati condotti mediante homology model basandosi sul sito attivo di altre due peptidasi, l’atrolisina-C e l’adamalisina-2 cercando di predire il docking di alcuni inibitori delle MMPs con le aggrecanasi.
In particolare sono stati presi in esame il Marimastat, il composto 27 e il composto 28. Il composto 27 inibisce, con un profilo simile al Marimastat, la ADAMTS-5 con un IC50=93 nM e la ADAMTS-4 con un IC50= 65 nM. Il composto 27 comunque ha un
profilo di selettività simile sulle altre MMPs, cosi come il composto 28, che risulta però più potente sulle aggrecanasi (IC50= 17nM su ADAMTS-5 e IC50=3 nM sulla -4) 46.
N H H N NH HO O O O OH N H NH HO O OH O OH H N H NH HO O OH O OH H NH
Per valutare la loro attività, le strutture sono state studiate in complesso con l’enzima e, come illustrato in figura 2.7 (a,b,c) la funzione idrossammica dei composti va a chelare lo Zn catalitico e a instaurare un legame a H con il residuo di Glu411. Inoltre i gruppi – OH dei composti 27 e 28 instaurano altri legami a H con il backbone della proteina.
Fig. 2.7: Interazioni tra (a) Marimastat (b) composto 27 (c) composto 28 con il sito attivo di
Sono proprio quei legami a H che conferiscono rigidità alle molecole e impediscono l’interazione con altri enzimi che hanno una tasca S1’ diversa. Questo quindi è un importante elemento di selettività dei composti 27 e 28 verso l’ADAMTS-5. L’unica differenza tra il composto 27 e il composto 28 è la catena ciclopropil-N-metimetanamminica in α al gruppo idrossammico. L’anello ciclopropilico non sembra avere un ruolo specifico, ma la funzione amminica forma un legame a H con una molecola d’acqua adiacente che a sua volta lega il residuo di Thr 378 del sito catalitico. Questa interazione addizionale spiega l’incremento di affinità del composto 28 rispetto al composto 27 46.
Questo residuo oltretutto è specifico della aggrecanasi-2 e rappresenta quindi un elemento di selettività importante.
Il composto 28 inoltre interagisce con la tasca S1’ dell’enzima tramite il suo gruppo fenolico in P1’ come illustra la Fig. 2.8.
Fig. 2.8: Interazione del composto 28 con la tasca S1’ dell’enzima 46.
Da qui, è stata sintetizzata una serie di inibitori tiossotiazolidin-4-oni che rappresenta una nuova serie di possibili inibitori selettivi della ADAMTS-5 47.
Il composto 29, appartenente a questa classe di inibitori, è risultato il composto più attivo con un IC50= 900 nM.
Gilbert e coll. hanno portato avanti questa linea e introducendo un nucleo pirazolico invece dell’anello fenilico legato alla catena metilenica extraciclica, hanno ottenuto dei composti più potenti. Il composto 30 infatti ha un IC50= 1.1µM verso la ADAMTS-5 48.
L’ulteriore analisi di questi composti ha portato alla scoperta di una classe di inibitori ancora più potenti e selettivi verso l’aggrecanasi-2. Infatti, i composti 5’-fenil-3’H-spiro[indolin-3,2’-[1,3,4]tiadiazol]-2-oni come il composto 31 sono molto attivi sulla ADAMTS-5 con un IC50=640 nM e selettivi se confrontati con l’attività su
ADAMTS-4, MMP-12 e MMP-13 49. N S S O COOH O O Composto 29 N S S O COOH N N CF3 S Cl N O NH N S O Composto 30 Composto 31
Anche un recente studio del 2010 ha indagato sui diversi ZBGs degli inibitori, soffermandosi su quello idrossammico e su quello carbossilico ma stavolta utilizzando uno scaffold planare di tipo pirrolo[3,4-c]-chinolin-1-one o ossoisoindolinico 50. Il
gruppo idrossammico è un gruppo molto potente sullo Zn catalitico, ma spesso attribuisce alla molecola scarse proprietà farmacocinetiche e una bassa selettività nei confronti delle MMPs. Ecco che il gruppo carbossilico può rappresentare una favorevole alternativa come ZBG dato che mostra effetti migliori dal punto di vista dell’assorbimento e delle clearance.
Basandosi sul composto 32, che oltre a chelare lo Zn con la funzione idrossammica si dispone perfettamente nella cavità idrofobica S1’, sono stati sintetizzati il composto 33 e il composto 34 che presentano una struttura appropriata per interagire con la caratteristica forma ad imbuto del sito catalitico della ADAMTS-5 (Fig. 2.9) 50.
S O O H N HO O O O F F F Composto 32 O N O N O O O N O N O N O H H H
Composto 33 Composto 34 Fig. 2.9: Sovrapposizione dei composti
32 (verde) e 34 (grigio) nel sito catalitico
Per valutare l’affinità di questi composti verso l’enzima è stato effettuato il docking dei composti nel sito catalitico. Entrambi sottolineano come la polarità dello ZBG sia fondamentale per l’attività, ma il composto 34 compie un interazione in più rispetto al composto 33 ed è quella con il residuo Glu 411 (avendo la funzione idrossammica). Il composto 33 è capace di inibire l’ADAMTS-5 con un IC50 nell’ordine del micromolare
ma il composto 34 risulta più attivo e selettivo se confrontato con l’attività nei confronti di ADAMTS-4. La funzione idrossammica quindi si è confermata lo ZBG più potente ad oggi conosciuto 50.
Fig. 2.10: Docking dei composti (a) 33 e (b) 34 nel sito attivo di ADAMTS-5 50.
Parallelamente, sono stati sintetizzati i composti ossoisoindolinici 35 e 36 che rappresentano degli analoghi semplificati dei composti precedenti. Il docking di questi due composti ha mostrato come il composto 35 sia in grado di chelare lo Zn catalitico mediante l’ossigeno del carbonile lattamico e di instaurare l’interazione col Glu 411 attraverso il gruppo OH della funzione acida (Fig. 2.11). Il composto 36 risulta comunque più attivo del composto 35, probabilmente grazie alla formazione di legami a H intramolecolari che conferiscono una maggiore rigidità alla molecola. Infine, rispetto
ai precedenti composti 33 e 34 questi ultimi due perdono l’attività sulla ADAMTS-4 restando attivi nell’ordine del micromolare verso l’ ADAMTS-5 50.
O N O O H O O N O N O H H O Composto 35 Composto 36
Fig. 2.11: Docking dei composti (a) 35 e (b) 36 nel sito catalitico di ADAMTS-5 50.
Un altro approccio utilizzato per la sintesi di inibitori selettivi verso la ADAMTS-5 è stato quello di usare la funzione di acido carbossilico come ZBG, ma su di uno scaffold diverso, di derivazione amminoacidica 51. Il primo composto sintetizzato è il composto
ADAMTS-5. Come si vede dal docking del composto nel sito catalitico dell’enzima, la molecola esibisce diverse interazioni, come quella della funzione acida con lo Zn del sito attivo, quella della catena bifenilica che si inserisce correttamente nella tasca S1’ e quella dell’anello benzilico con l’His 414 51.
S HN O O Cl HO O Composto 37
Fig. 2.12: Docking del composto 37 nel sito catalitico di ADAMTS-5 51.
Cercando di ottimizzare questo composto, sono stati sintetizzati una serie di 2-fenil-1-solfonammino-ciclopropano carbossilati N-sostituiti. Studi SAR hanno evidenziato infatti che la modificazione del core aminoacidico con una funzione ciclopropanica si traduce in un incremento di attività dell’inibitore, probabilmente perché rende la molecola rigida in una conformazione favorevole per il legame. L’altro punto di modificazione è stato la sostituzione sull’azoto della solfonammide. Tra i vari composti ottenuti, il più attivo si è rivelato il composto 38, con un IC50= 73 nM. Il docking del
composto 38 nel sito catalitico dell’enzima mostra infatti che riesce a inserirsi correttamente nella tasca S1’ e forma un’ interazione addizionale con il residuo di Leu 443 (Fig. 2. 13) 51. S N O O Cl HO O N N O O Composto 38
Fig. 2.13: Docking del composto 38 nel sito attivo dell’enzima 51.
Un approccio alternativo, è stato quello adottato da Noe e coll., che hanno mantenuto come ZBG il gruppo idrossammico, ma viste le scarse proprietà farmacocinetiche di questo, soprattutto per quando riguarda la biodisponibilità orale, hanno cercato di ridurre l’instabilità metabolica con opportune modificazioni52. La prima serie di composti infatti è quella rappresentata dal composto 39. Studi SAR hanno individuato che l’introduzione di una funzione polare in posizione 3 dell’anello piperidinico si
traduce in un incremento di attività verso l’aggrecanasi-2 e può ridurre l’instabilità in
vivo. Da qui è stata sintetizzata una serie di analoghi a partire dal composto 40 52.
S O O N O R HO O H N OH S O O N O R HO O H N OH OH R' Composto 39 Composto 40
In particolare i composti più attivi sono risultati quelli aventi un gruppo alchilico in R’. Un altro elemento importante è stata poi la sostituzione sul gruppo benzilico, e l’incorporazione di sostituenti lipofilici garantiva un incremento di attività. Da qui è stato sintetizzato il composto 41, che ha un’eccellente attività sulle aggrecanasi e sulla MMP-13 (collagenasi responsabile della rimozione del collagene di tipo 2 e quindi implicata anch’essa nella patologia artritica) e una potente selettività se confrontata con altre MMPs 52. S O O N O HO O H N OH OH CH3 F Cl Composto 41
Il composto 41 è stato testato in vivo in modelli animali ed è risultato metabolicamente più resistente del composto 39. Probabilmente la funzione polare ossidrilica introdotta vicino al gruppo idrossammico, e il possibile legame a H intramolecolare che si instaura tra queste due funzioni, influenzano l’assorbimento e la clearance. Il composto è stato somministrato per via orale, ed ha esibito una buona attività. Queste osservazioni hanno portato quindi alla scoperta di una nuova serie di inibitori 3-alchil-3idrossi pipecolic idrossammati, attivi e selettivi verso le aggrecanasi 52.
Una valida alternativa agli inibitori sito-diretti come quelli precedentemente descritti, è stata proposta da Troemberg e coll. che hanno evidenziato come i Calcio Pentosan Polisolfati siano degli inibitori selettivi delle aggrecanasi 53. I CaPPs sono sali naturali di calcio isolati dal Fagus silvatica, che hanno la struttura lineare dello xilano contenente diversi siti di glucoronidazione e legati in posizione 2 a anelli di Xilosio, di massa molecolare compresa tra 4000-6000 Da (Fig. 2.14) 54.
I CaPPs sono degli inibitori delle aggrecanasi, ma si legano in domini diversi dal sito catalitico. Infatti, questi legano la porzione Cys-rich della ADAMTS-5 e la regione dello spaziatore della ADAMTS-4. Essendo questi domini fondamentali per il riconoscimento e l’idrolisi dell’aggrecano, queste molecole possono rappresentare una nuova serie di inibitori da usare nella patologia osteoatritica.
Inoltre questo tipo di riconoscimento garantisce la selettività di queste molecole verso le aggrecanasi, e potrebbe rivelarsi molto utile in vivo andando a bloccare esclusivamente la capacità dell’enzima di riconoscere e idrolizzare il suo target naturale.
Oltre a inibire direttamente l’enzima, è stato visto che queste molecole compiono anche due diversi tipi di inibizione indiretta sulle aggrecanasi.
In primo luogo i CaPPs incrementano la produzione dell’inibitore endogeno delle aggrecanasi, il TIMP-3. L’aumento della concentrazione dei TIMP-3 però non va attribuita ad un incremento nella biosintesi a livello trascrizionale. I CaPPs infatti intervengono sul processo di endocitosi, mediato dal recettore delle low-density lipoprotein (LRP). A livello tissultale il TIMP-3 è rapidamente internalizzato per endocitosi e i livelli ridotti di questo inibitore sono in relazione alla eccessiva attività litica delle aggrecanasi. I CaPPs si legano al TIMP-3 e impediscono che questo sia riconosciuto e quindi internalizzato dalle cellule LPR.
In secondo luogo poi i CaPPs incrementano l’affinità del TIMP-3 verso le aggrecanasi favorendo la formazione di interazioni aggiuntive che potenziano il legame tra l’enzima e l’inibitore endogeno.
La Fig. 2.15 mostra i tre diversi meccanismi di inibizione dei CaPPs sulla aggrecanasi-2 53.
Fig. 2.15: i) Inibizione diretta dei CaPPs sull’enzima, riconoscendo i domini non catalitici C-terminali. ii)
Incremento dei livelli del TIMP-3 da parte dei CaPPs, che blocca la sua interazione con la superficie delle cellule HSPGs e la conseguente internalizzazione attraverso il LPR. iii) Aumento dell’affinità del TIMP-3
nel legame con la aggrecanasi-2 53.
Tutte queste caratteristiche dimostrano che questi sali hanno un’attività protettiva nei confronti della cartilagine nella patologia osteoatritica e che rappresentano una nuova classe di inibitori delle aggrecanasi.
