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Materiali e metodi
Soggetti sperimentali e condizioni di stabulazione
I soggetti utilizzati sono individui di entrambi generi appartenenti alla specie Mus Musculus e al ceppo C57BL (fig.3-1), nati nel laboratorio di Neurofisiologia del CNR di Pisa; utilizzati in età adulta a ~ 60 giorni di vita.
I topi sono stati suddivisi in due gruppi sperimentali rispettivamente composti da 15 soggetti: il primo stabulato in condizioni standard (che chiameremo gruppo Standard Condition SC) e il secondo stabulato in ambiente arricchito (chiamato gruppo Ambiente Arricchito AA) (fig. 3-2), è stato utilizzato anche un terzo gruppo come controllo (che chiameremo Home Cage HC) formato da topi di entrambi i generi e della stessa età dei gruppi sperimentali, stabulato in gabbie standard e non sottoposto ad alcun tipo di apprendimento.
Le gabbie standard utilizzate dai soggetti sono di plastica trasparente di dimensioni 22x29x13 cm, rivestite da uno spesso strato di lettiera (trucioli di legno e segatura) e munite di una griglia sovrastane di acciaio inox che funge sia da ingresso dei roditori che da veicolo per cibo ed acqua, il primo, adagiato in un apposito vano nella griglia e la seconda, erogata da adeguate bottiglie di plastica. I soggetti sono stati suddivisi in piccoli gruppi con un massimo di 3 o 4 animali per gabbia, per agevolare le condizioni abitative. Come criterio di smistamento dei soggetti nelle gabbie sono state tenute di conto alcune caratteristiche del campione, come il sesso, ed i legami di parentela prediligendo la convivenza tra soggetti con legami di fratellanza per evitare eventuali scontri, prevalentemente tra i maschi.
Le gabbie “arricchite”, consistono in habitat di maggior ampiezza 37x55x20 cm, contenente una serie di oggetti come giocattoli, blocchi, costruzioni lego, tunnel in plexiglas, scale, ruote, ecc. I vari stimoli sono stati sostituiti una volta a settimana, in corrispondenza del giorno della pulizia delle gabbie, con altri mai visti dagli
animali, in modo da mantenere il fattore “novità”
l’esplorazione, a metà settimana sono stati cambiati di locazione gli oggetti senza l’introduzione di altri nuovi.
Gli animali sono stati stabulati in una stanza termoregolata in cui è stato riprodotto un ciclo di luce buio di 12
accesso ad acqua e cibo per tutto il periodo. Tutte le fasi dell’esperimento descritto in questa sede, sono state condotte in accordo con le leggi italiane sull’utilizzo degli animali nella ricerca e in conformità
dalla comunità scientifica internazionale.
Figura
3-Figura 3-2 Le figure mostrano a sinistra un esempio di gabbia standard e a destra un esempio di gabbia arricchita.
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animali, in modo da mantenere il fattore “novità”. Inoltre per incentivare l’esplorazione, a metà settimana sono stati cambiati di locazione gli oggetti senza l’introduzione di altri nuovi.
Gli animali sono stati stabulati in una stanza termoregolata in cui è stato riprodotto un ciclo di luce buio di 12 ore per fase, inoltre hanno avuto libero accesso ad acqua e cibo per tutto il periodo. Tutte le fasi dell’esperimento descritto in questa sede, sono state condotte in accordo con le leggi italiane sull’utilizzo degli animali nella ricerca e in conformità con protocolli sperimentali approvato dalla comunità scientifica internazionale.
-1 Foto rappresentativa di un soggetto, roditore C57BL
mostrano a sinistra un esempio di gabbia standard e a destra un esempio di gabbia
. Inoltre per incentivare l’esplorazione, a metà settimana sono stati cambiati di locazione gli oggetti senza
Gli animali sono stati stabulati in una stanza termoregolata in cui è stato ore per fase, inoltre hanno avuto libero accesso ad acqua e cibo per tutto il periodo. Tutte le fasi dell’esperimento descritto in questa sede, sono state condotte in accordo con le leggi italiane sull’utilizzo con protocolli sperimentali approvato
Apparato comportamentale : Morris Water Maze
Il Morris water maze (MWM) permette di indagare la memoria spaziale attraverso l’apprendimento della posizione di
ambiente avverso, come una vasca d’acqua.
Il task sfrutta la naturale avversione di roditori per l'acqua, in modo tale da fornire una spinta a trovare il più velocemente possibile la piattaforma, che appunto rappresenta l'unica via di uscita. La performance dell’animale al test è indice dei processi di memoria spaziale; infatti, è importante che il roditore operi un continuo monitoraggio della sua posizione rispetto i punti di riferimento esterni e questo implica la costruzione di una mappa cognitiva. L'animale nuoterà verso la piattaforma nascost
presenti sulle pareti che circondano la vasca.
Gli animali inizialmente nuoteranno seguendo il perimetro della vasca (comportamento tigmotattico), ma successivamente, esplorando anche il centro della vasca, si imbatteranno casualmente nella piattaforma o vi verranno posti sopra dallo sperimentatore. Con il susseguirsi delle prove, grazie al formarsi di una mappa spaziale, dimostreranno di memorizzare la posizione della piattaforma, seguendo una traiettor
osservano, infatti, percorsi e tempi sempre minori per il suo ritrovamento.
Figura 3-3 Esemplificazione del comportamento tipico in soggetti normali durante il periodo i
Morris water maze test. La figura a sinistra mostra il tracciato di nuoto che si osserva nei primi giorni di training. Nei giorni successivi il tipo di tracciato diventa più breve e più indirizzato verso la piattaforma, negli ultimi giorni osserveremo un tracciato ben finalizzato mostrato nella figura a destra.
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Apparato comportamentale : Morris Water Maze
(MWM) permette di indagare la memoria spaziale attraverso l’apprendimento della posizione di una via di fuga (piattaforma) all'interno di un ambiente avverso, come una vasca d’acqua.
Il task sfrutta la naturale avversione di roditori per l'acqua, in modo tale da fornire una spinta a trovare il più velocemente possibile la piattaforma, che appunto rappresenta l'unica via di uscita. La performance dell’animale al test è ssi di memoria spaziale; infatti, è importante che il roditore operi un continuo monitoraggio della sua posizione rispetto i punti di riferimento esterni e questo implica la costruzione di una mappa cognitiva. L'animale nuoterà verso la piattaforma nascosta se riuscirà a correlare i diversi indizi spaziali presenti sulle pareti che circondano la vasca.
Gli animali inizialmente nuoteranno seguendo il perimetro della vasca (comportamento tigmotattico), ma successivamente, esplorando anche il centro sca, si imbatteranno casualmente nella piattaforma o vi verranno posti sopra dallo sperimentatore. Con il susseguirsi delle prove, grazie al formarsi di una mappa spaziale, dimostreranno di memorizzare la posizione della piattaforma, seguendo una traiettoria sempre più diretta verso questa (fig.3 osservano, infatti, percorsi e tempi sempre minori per il suo ritrovamento.
Esemplificazione del comportamento tipico in soggetti normali durante il periodo i
Morris water maze test. La figura a sinistra mostra il tracciato di nuoto che si osserva nei primi giorni di training. Nei giorni successivi il tipo di tracciato diventa più breve e più indirizzato verso la piattaforma, negli
rveremo un tracciato ben finalizzato mostrato nella figura a destra.
Apparato comportamentale : Morris Water Maze
(MWM) permette di indagare la memoria spaziale attraverso una via di fuga (piattaforma) all'interno di un
Il task sfrutta la naturale avversione di roditori per l'acqua, in modo tale da fornire una spinta a trovare il più velocemente possibile la piattaforma, che appunto rappresenta l'unica via di uscita. La performance dell’animale al test è ssi di memoria spaziale; infatti, è importante che il roditore operi un continuo monitoraggio della sua posizione rispetto i punti di riferimento esterni e questo implica la costruzione di una mappa cognitiva. L'animale nuoterà a se riuscirà a correlare i diversi indizi spaziali
Gli animali inizialmente nuoteranno seguendo il perimetro della vasca (comportamento tigmotattico), ma successivamente, esplorando anche il centro sca, si imbatteranno casualmente nella piattaforma o vi verranno posti sopra dallo sperimentatore. Con il susseguirsi delle prove, grazie al formarsi di una mappa spaziale, dimostreranno di memorizzare la posizione della ia sempre più diretta verso questa (fig.3-3). Si osservano, infatti, percorsi e tempi sempre minori per il suo ritrovamento.
Esemplificazione del comportamento tipico in soggetti normali durante il periodo i training al Morris water maze test. La figura a sinistra mostra il tracciato di nuoto che si osserva nei primi giorni di training. Nei giorni successivi il tipo di tracciato diventa più breve e più indirizzato verso la piattaforma, negli
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L’apparato sperimentale (fig. 3-4) consiste in una vasca in polipropilene bianco di diametro di 120 cm e di 50 cm di profondità, riempita fino a 40 cm di altezza da acqua a 22°C circa, opacizzata dall'aggiunta di tinta bianca atossica. La vasca è posta in un ambiente uniformemente illuminato delimitato da una struttura formata da tende di colore neutro uniforme, sulle quali sono applicati una serie di stimoli, come poster e oggetti vari, di dimensione e collocazione ben visibile dall’animale che si trova nella vasca. Queste permettono di isolare la condizione sperimentale dal resto dell’ambiente, ma anche di potere scegliere le caratteristiche degli stimoli distali che devono essere usati dal topo come riferimenti spaziali, per questo motivo la sede di tali indizi rimangono invariati per tutto il periodo dell’esperimento. La vasca viene divisa idealmente in quattro quadranti a partire da quattro posizioni intorno al bordo della vasca, designati arbitrariamente: nord (N), sud (S), est (E), e ad ovest (O). Questi riferimenti saranno le quattro posizioni di partenza da cui verrà rilasciato l’animale per l’inizio della prova e anche i punti attraverso i quali passeranno le rette che divideranno la vasca in quattro quadranti: NE, SE, SO e NO. Nel quadrante SO, abbiamo posto una piattaforma quadrata con 10 cm di lato posta 0,5 cm sotto la superficie dell'acqua in modo che roditore possa salirci sopra, riposarsi e bagnarsi il meno possibile. Questa non è visibile dall'animale, grazie alla sua collocazione e grazie al suo colore bianco mimetizzato dall'opacità dell'acqua. Sopra il centro della vasca è posta una telecamera che è connessa ad un videoregistratore e ad un computer, che analizza i vari parametri di interesse attraverso il sistema di videotracking EthoVision.
Figura 3-4 Morris water maze. A sinistra, foto dell’apparato presente nel laboratorio di neuroscienze presso il CNR di Pisa con il quale abbiamo
stanza e dell’apparato, con la messa in evidenza della suddivisione ideale delle aree della vasca.
Il protocollo utilizzato si compone di due parti: un
La prima parte consiste in 7 giorni di allenamento con 4 prove al giorno separate tra loro da un intervallo di 30 minuti, durante il quale gli animali vengono riposti nelle loro gabbie di appartenenza a riposare. Ogni prova prevede che il topo venga messo nella piscina con il muso rivolto verso il bordo della vasca e che venga lasciato da solo nell'ambiente sperimentale, la performance può essere controllata dal monitor del computer senza interferire nello svolgimento della prova con la presenza dello sperimentatore
nell’arena ogni volta da un punto cardinale differente seguendo una sequenza
pseudorandom, precedentemente decisa, in modo da bilanciare il numero di partenze dalle diverse locazioni. La durata massima di ogni prova è di 6
se l'animale non trova la piattaforma entro 60 sec, lo sperimentatore lo guida e lo lascia riposare sulla stessa per 10
d’appartenenza. La sosta permette al topo di osservare l’ambiente circostante favorendo la formazione di una mappa spaziale. Nel caso in cui l’animale trovi indipendentemente la piattaforma prima dei 60 sec, viene lasciato ugualmente per lo stesso tempo sopra di essa e poi riposto nella gabbia d’appartenenza.
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Morris water maze. A sinistra, foto dell’apparato presente nel laboratorio di neuroscienze presso il CNR di Pisa con il quale abbiamo effettuato gli esperimenti. A destra una riproduzione schematica della stanza e dell’apparato, con la messa in evidenza della suddivisione ideale delle aree della vasca.
Il protocollo utilizzato si compone di due parti: un training e un probe
parte consiste in 7 giorni di allenamento con 4 prove al giorno separate tra loro da un intervallo di 30 minuti, durante il quale gli animali vengono riposti nelle loro gabbie di appartenenza a riposare. Ogni prova prevede che il topo cina con il muso rivolto verso il bordo della vasca e che venga lasciato da solo nell'ambiente sperimentale, la performance può essere controllata dal monitor del computer senza interferire nello svolgimento della prova con la presenza dello sperimentatore (fig.3-5). Il topo viene messo nell’arena ogni volta da un punto cardinale differente seguendo una sequenza
, precedentemente decisa, in modo da bilanciare il numero di partenze dalle diverse locazioni. La durata massima di ogni prova è di 6
se l'animale non trova la piattaforma entro 60 sec, lo sperimentatore lo guida e lo lascia riposare sulla stessa per 10-15 sec prima di riporlo nella gabbia d’appartenenza. La sosta permette al topo di osservare l’ambiente circostante la formazione di una mappa spaziale. Nel caso in cui l’animale trovi indipendentemente la piattaforma prima dei 60 sec, viene lasciato ugualmente per lo stesso tempo sopra di essa e poi riposto nella gabbia d’appartenenza.
Morris water maze. A sinistra, foto dell’apparato presente nel laboratorio di neuroscienze presso il effettuato gli esperimenti. A destra una riproduzione schematica della stanza e dell’apparato, con la messa in evidenza della suddivisione ideale delle aree della vasca.
probe.
parte consiste in 7 giorni di allenamento con 4 prove al giorno separate tra loro da un intervallo di 30 minuti, durante il quale gli animali vengono riposti nelle loro gabbie di appartenenza a riposare. Ogni prova prevede che il topo cina con il muso rivolto verso il bordo della vasca e che venga lasciato da solo nell'ambiente sperimentale, la performance può essere controllata dal monitor del computer senza interferire nello svolgimento della 5). Il topo viene messo nell’arena ogni volta da un punto cardinale differente seguendo una sequenza
, precedentemente decisa, in modo da bilanciare il numero di partenze dalle diverse locazioni. La durata massima di ogni prova è di 60 secondi, se l'animale non trova la piattaforma entro 60 sec, lo sperimentatore lo guida e lo 15 sec prima di riporlo nella gabbia d’appartenenza. La sosta permette al topo di osservare l’ambiente circostante la formazione di una mappa spaziale. Nel caso in cui l’animale trovi indipendentemente la piattaforma prima dei 60 sec, viene lasciato ugualmente per lo stesso tempo sopra di essa e poi riposto nella gabbia d’appartenenza.
Figura 3-5 Esempi di momenti durante lo svolgimento del Morris water maze test.
Il sistema di videotracking
dell’animale ogni 100 msec nelle varie prove, permettendo di analizzare i seguenti parametri: la latenza di uscita (sec), il percorso di navigazione (cm) e la velocità di nuoto (cm/sec). La latenza di uscita rappresent
raggiungere la piattaforma una volta messo in acqua. Questo parametro ci fornisce un fondamentale indice di apprendimento: infatti, nei primi giorni, la latenza risulterà molto alta, poiché l'animale non ha ancora formato
mentre nei giorni di training successivi questa diminuirà pian piano. Legato all'apprendimento, c’è anche il tipo di percorso che i topi effettueranno nuotando nella vasca: inizialmente si osserverà un comportamento tigmotattico, ovve lungo le pareti della vasca, successivamente, una volta appresa la posizione della piattaforma, il percorso tenderà ad essere più diretto verso questa. La velocità di moto è importante poiché una diversa latenza di uscita potrebbe essere falciata da
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Esempi di momenti durante lo svolgimento del Morris water maze test.
Il sistema di videotracking Etovision, rileva automaticamente la posizione dell’animale ogni 100 msec nelle varie prove, permettendo di analizzare i seguenti parametri: la latenza di uscita (sec), il percorso di navigazione (cm) e la velocità di nuoto (cm/sec). La latenza di uscita rappresenta il tempo che l'animale impiega a raggiungere la piattaforma una volta messo in acqua. Questo parametro ci fornisce un fondamentale indice di apprendimento: infatti, nei primi giorni, la latenza risulterà molto alta, poiché l'animale non ha ancora formato una mappa spaziale, mentre nei giorni di training successivi questa diminuirà pian piano. Legato all'apprendimento, c’è anche il tipo di percorso che i topi effettueranno nuotando nella vasca: inizialmente si osserverà un comportamento tigmotattico, ovve lungo le pareti della vasca, successivamente, una volta appresa la posizione della piattaforma, il percorso tenderà ad essere più diretto verso questa. La velocità di moto è importante poiché una diversa latenza di uscita potrebbe essere falciata da
Esempi di momenti durante lo svolgimento del Morris water maze test.
, rileva automaticamente la posizione dell’animale ogni 100 msec nelle varie prove, permettendo di analizzare i seguenti parametri: la latenza di uscita (sec), il percorso di navigazione (cm) e la velocità di a il tempo che l'animale impiega a raggiungere la piattaforma una volta messo in acqua. Questo parametro ci fornisce un fondamentale indice di apprendimento: infatti, nei primi giorni, la latenza una mappa spaziale, mentre nei giorni di training successivi questa diminuirà pian piano. Legato all'apprendimento, c’è anche il tipo di percorso che i topi effettueranno nuotando nella vasca: inizialmente si osserverà un comportamento tigmotattico, ovvero lungo le pareti della vasca, successivamente, una volta appresa la posizione della piattaforma, il percorso tenderà ad essere più diretto verso questa. La velocità di moto è importante poiché una diversa latenza di uscita potrebbe essere falciata da
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una maggiore velocità di nuoto, quindi risulta importante, specialmente quando si compara le performance tra i gruppi, che questi mostrino una velocità simile. La procedura, insieme alla posizione della piattaforma, rimane invariata per tutto il training, fino al probe test. Durante questa prova la piattaforma viene rimossa dalla vasca e l'animale viene posto al suo interno dal punto più lontano rispetto dove era posizionata la piattaforma (SO) e lasciato libero di nuotare per 60 sec. Se
l'animale ha imparato la posizione della piattaforma, la cercherà
approssimativamente nel punto in cui è sempre stata, perciò, quello che registreremo in questo caso è l'ammontare del tempo speso dall'animale nei vari quadranti: di conseguenza ci aspetteremo che la permanenza nel quadrante target SO, dove prima era posizionata la piattaforma, sia maggiore rispetto agli altri quadranti, come se il soggetto stesse cercando l'oggetto mancante. Il probe è quindi una verifica dell’apprendimento, permette di escludere la possibilità che durante l’allenamento il topo possa aver incontrato casualmente la piattaforma, senza essersi costruito una mappa spaziale visiva.
Per valutare l’accuratezza dei criteri di ricerca della piattaforma, nel probe è stato analizzato un ulteriore parametro che quantifica l’esplorazione in tre cerchi concentrici (raggi: 16 cm, 23 cm, e 28 cm) centrati sulla localizzazione della piattaforma, tale parametro rappresenta una valutazione più fine della ricerca dell’oggetto mancante rispetto all’intero quadrante d’interesse.
I soggetti sono stati assegnati in modo casuale dei sottogruppi di trattamento e quindi sono stati sottoposti al probe di mantenimento delle traccia di memoria spaziale acquisita: sia i soggetti wild tipe che gli arricchiti hanno effettuato il probe test o a 1, o a 10, o a 20 giorni dalla fine dei sette giorni di training. L’analisi a diversi punti temporali consente lo studio delle varie aree cerebrali coinvolte nel consolidamento e nel richiamo di memorie di natura spaziale.
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Immunoistochimica
Per identificare le aree cerebrali coinvolte nel consolidamento e nel richiamo delle memorie spaziali, è stato valutato il loro livello di attivazione in corrispondenza del richiamo delle memorie ai diversi punti temporali.
Abbiamo utilizzato l’espressione del gene precoce c-fos, essendo infatti trascritto rapidamente in seguito a fenomeni di plasticità attività-dipendenti, rende possibile la visualizzazione dei primi processi di trascrizione indotti da cambiamenti dell’attività elettrica nelle diverse aree.
I soggetti sperimentali sono stati perfusi dopo 90 minuti dall’effettuazione del probe test ciascuno a seconda del gruppo di trattamento a cui e era stato assegnato. Prima dell’intervento chirurgico gli animali sono stati anestetizzati con Cloralio Idrato (0,2ml/10g) e immediatamente fissati tramite perfusione trans-cardiaca prima con PBS (phosphate buffered salinic) tampone fosfato salino, una soluzione salina contenente cloruro di sodio, sodio fosfato e potassio fosfato; in continuità con il PBS viene iniettata la Paraformaldeide (PFA) al 4% diluita in 0,1M di Tampone Fosfato (pH 7.4).
Alla fine della perfusione il cervello viene estratto delicatamente e messo in paraformaldeide, per effettuare un post-fissazione di 24h quindi risciacquate e messe in saccarosio fino al momento del taglio.
Seguendo il piano coronale sono state effettuate delle sezioni da 40µm di spessore, utilizzando un Microtomo a slitta, sono state quindi ottenute delle fettine per ogni sezione di interesse, in senso antero-posteriore (fig. 3-6):
corteccia infralimbica (da bregma 1,78mm), corteccia cingolata anteriore e corteccia motoria secondaria (da bregma 0,50mm), ippocampo dorsale e corteccia parietale temporale associativa (da bregma -2,06mm), ippocampo ventrale e corteccia uditiva primaria (da bregma -3,08mm), corteccia visiva e corteccia entorinale (da bregma -4,16mm).
Le strutture sono state anatomicamente definite con l’ausilio di un Atlante stereotassico del cervello di topo (Paxinos & Franklin, 2004).
Figura 3-6 Sezioni istologiche con riferimento alla distanza dal bregma. In rosso tratteggiato le aree di riferimento in cui abbiamo effettuato il conteggio delle cellule c
Atlas” 2004 )
Queste “fettine” di tessuto cerebrale
preparate per la colorazione immunoistochimica. Successivamente sono state incubate in una soluzione blocking per 1 ora e 30 minuti, contenente 10% di NGS (normal goat serum) e 0,5% di Triton al fine di bloccare eventuali siti aspecifici di legame per l’anticorpo e di permeabilizzare il tessuto grazie al detergente. Quindi sono state risciacquate in PBS ed incubate in agitazione per 36 ore a 4°C, con l’anticorpo primario c-fos 1:3000.
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Sezioni istologiche con riferimento alla distanza dal bregma. In rosso tratteggiato le aree di riferimento in cui abbiamo effettuato il conteggio delle cellule c-fos positive ( Paxinos e Franklin “Mouse Brain
Queste “fettine” di tessuto cerebrale free-floating sono state sospese in PBS e preparate per la colorazione immunoistochimica. Successivamente sono state incubate in una soluzione blocking per 1 ora e 30 minuti, contenente 10% di NGS ) e 0,5% di Triton al fine di bloccare eventuali siti aspecifici di legame per l’anticorpo e di permeabilizzare il tessuto grazie al detergente. Quindi sono state risciacquate in PBS ed incubate in agitazione per 36 ore a 4°C, con
fos 1:3000.
Sezioni istologiche con riferimento alla distanza dal bregma. In rosso tratteggiato le aree di Paxinos e Franklin “Mouse Brain
sono state sospese in PBS e preparate per la colorazione immunoistochimica. Successivamente sono state incubate in una soluzione blocking per 1 ora e 30 minuti, contenente 10% di NGS ) e 0,5% di Triton al fine di bloccare eventuali siti aspecifici di legame per l’anticorpo e di permeabilizzare il tessuto grazie al detergente. Quindi sono state risciacquate in PBS ed incubate in agitazione per 36 ore a 4°C, con
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L’immunoreattività è stata evidenziata con un procedura standard di avidina-biotina-perossidasi, incubando le sezioni per tre ore a temperatura ambiente, prima con l’anticorpo secondario biotinilato (anti-rabit), poi con il complesso ABC (Vectastain Elite ABC kit). Lo sviluppo è stato quindi effettuato per 2-3 minuti con una soluzione di diaminobenzidina (DAB) e perossido di idrogeno 3% in acqua distillata con aggiunta di Nickel per una colorazione grigio-nera. Le sezioni dopo la reazione con DAB sono state posizionate su vetrini portaoggetto; quindi sono state disidratate mediante lavaggi in etanolo 80%,96% 100% e xilene e infine sono state montate con DPX (Fluka) e rivestite con il vetrino coprioggetto.
La stima delle cellule c-fos positive è stata effettuata analizzando le sezioni istologiche mediante un microscopio a luce trasmessa al quale è collegata una videocamera digitale, in grado di inviare le immagini ad un software per l’analisi quantitativa strereologica e morfologica dei neuroni (Stereo Investigator MBF Bioscience).
Analisi Dati
I dati registrati sono stati elaborati statisticamente attraverso un’analisi della varianza (ANOVA). Non abbiamo tenuto conto della variabile di genere, in quanto precedenti lavori non hanno evidenziato alcun tipo differenza significativa tra i due sessi.
La misura della latenza, del percorso e della velocità nel test comportamentale del Morris Water Maze sono state analizzate con un’ ANOVA a 2 vie per misure ripetute, fattore tra i gruppi (trattamento 2 livelli: SC e AA) e i giorni di addestramento come misura ripetuta (7 livelli: 1-7), nelle statistiche finali non abbiamo tenuto conto dei sottogruppi di trattamento in quanto analisi preliminari non hanno evidenziato differenze nell’apprendimento.
Le misure della quantità di tempo spesa nei quadranti e nei raggi circoscritti alla piattaforma del probe sono state analizzate con un’ANOVA a due vie per misure ripetute, fattore tra i gruppi (trattamento, 2 livelli: SC e AA) e rispettivamente i
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quadranti ideali della vasca (4 livelli: SE,NE,NO,SO) e i raggi delle tra circonferenze circoscritte alla piattaforma (3 livelli: raggio 16cm, 23cm e 28cm) questa analisi è stata ripetuta per ogni sottogruppo di trattamento e cioè a 1, 10 e 20 giorni. Per valutare il livello di attivazione delle aree è stata considerata la densità delle cellule marcate (numero di cellule c-fos positive su area in mm²). La densità media per ogni area, in ciascuno dei soggetti, è stata normalizzata sulla densità media misurata nella medesima area dei soggetti di controllo HC. L’analisi del pattern d’attivazione nei diversi punti temporali per i due trattamenti è stata effettuata, per ogni area, con un’ANOVA a due vie, gruppi trattamento (2 livelli: SC, AA) e giorni di ritenzione (1, 10 e 20). L’analisi dell’attivazione nei diversi intervalli temporali rispetto al valore degli HC è stata valutata per ogni area e per ogni gruppo di trattamento con un’ANOVA a una via temporali (4 livelli, HC, 1, 10 e 20 giorni).
