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5. Materiali e metodi
5.1 Campionamento di suoli
Utilizzando una paletta di plastica sono stati prelevati circa 2 kg di suolo. Il campione, contenuto in sacchetto di plastica per uso alimentare, è stato poi quartato in laboratorio, dopo avere eliminato dal campione frammenti di vario tipo (resti di radici, artropodi, pietre, ecc). Al termine dell’operazione di quartatura sono stati raccolti pochi grammi di campione, rappresentativi del totale.
Per i suoli è stato anche eseguito il metodo della LOI. Tale metodo consiste nel mettere una determinata quantità di suolo in un crogiolo e metterlo in forno a 550 °C per 4 ore. A questa temperatura tutta la sostanza organica brucia e viene così eliminata. Poi lo stesso campione viene portato per 2 ore a 950 °C e vengono così bruciati i carbonati. Secondo tale metodo la perdita in peso per decomposizione termica sotto i 550°C è correlata al contenuto di materia organica nel solido, mentre la perdita in peso a 950°C è correlabile al contenuto di minerali carboniosi (Heiri et al., 2001) e si può così determinare la quantità di sostanza organica e carboniosa presente in un campione di suolo.
5.2 Campionamento di vegetali
Nei vegetali sono stati campionati i fusti e le radici. Le radici sono state prelevate “a strappo” ovvero senza l’ausilio di mezzi meccanici di sorta. Semplicemente tirando i fusti e “sfilando” la radice dal suolo. Nello stesso modo si sono così prelevati i fusti. Fusti e radici sono stati poi suddivisi in due sacchetti sterili spezzandoli con le mani protette da guanti in modo da evitare il contatto dei campioni con elementi contaminanti quali i metalli (per esempio il ferro di una forbice).
Per ogni punto di campionamento è stata prelevata una grande quantità di vegetali (almeno una quindicina di cannucce per ogni punto), che è stata fatta in pezzi molto piccoli e poi mescolata per eseguire una quartatura simile a quella utilizzata per i suoli.
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Sia i fusti che le radici sono stati poi lavati a fondo con acqua corrente avendo ben cura di eliminare tutti i sedimenti visibili. Poi abbiamo eseguito tre bagni di lavaggio con acqua distillata e altri tre con acqua distillata superpura. Una volta lavato il campione lo abbiamo seccato in stufa per 12 ore a 105 °C. Una volta seccato lo abbiamo tritato finemente con due pinzette di plastica e utilizzando dei guanti sterili sempre per evitare eventuali contaminazioni, soprattutto ad opera di metalli.
Il campione seccato e tritato è poi stato rimescolato ulteriormente per omogeneizzare il più possibile i valori prima di eseguire l’analisi.
5.3 Campionamento di piume di uccello
Le piume degli uccelli sono state prelevate da uccelli vivi che poi sono stati rilasciati. Gli uccelli sono stati catturati tramite le reti da inanellamento scientifico. L’inanellamento scientifico è una tecnica di ricerca basata sulla marcatura individuale degli uccelli. Qualsiasi osservazione di un uccello inanellato, sia attraverso la sua ricattura ed il successivo rilascio, sia in occasione della segnalazione finale una volta deceduto, è utile per ricostruire la sua storia di vita. Questa tecnica rappresenta uno dei metodi più efficaci per studiare la biologia, l’ecologia, il comportamento, i movimenti, la produttività delle popolazioni e la demografia degli uccelli.
L’inanellamento nasce principalmente per studiare le migrazioni degli uccelli; ricostruire i viaggi di uccelli inanellati consente di definire le loro rotte di migrazione e le aree di sosta, fornendo così informazioni di base anche per pianificare sistemi integrati di aree protette. Altre informazioni che scaturiscono dalle ricatture e dalle segnalazioni includono parametri di popolazione (es. stime di sopravvivenza, successo riproduttivo) i quali sono essenziali per determinare le cause dei mutamenti nelle dimensioni delle popolazioni. Circa 4 milioni di uccelli vengono inanellati annualmente nella sola Europa e molti di questi attraversano liberamente i confini politici, l’uso di anelli individuali e l’acquisizione di dati relativi ad uccelli ricatturati necessitano quindi di un’efficiente schema organizzativo. Una rete di stazioni di monitoraggio tra loro pienamente coordinate
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attraverso centri nazionali è indispensabile per la gestione delle attività di inanellamento scientifico in Europa. EURING, l’Unione Europea per l’Inanellamento, garantisce l’efficiente collaborazione tra Centri nazionali di inanellamento di tutta Europa e, essendo le migrazioni degli uccelli transcontinentali, anche con i centri extraeuropei.
L’inanellamento quindi è utile per studiare le migrazioni degli uccelli, la loro struttura demografica, la loro biologia ed ecologia, ma ci fornisce anche la possibilità di prelevare dei campioni da poter analizzare. Già da anni si eseguono studi su campioni biologici di uccelli catturati con le reti da inanellamento. Dal 2005, per esempio, è in corso in Europa una campagna di studio sul virus H5N1, la tanto temuta influenza aviaria, proprio tramite la cattura per inanellamento. Vengono continuamente catturati uccelli in diversi punti d’Europa e a loro viene prelevato un millilitro di sangue che viene poi analizzato per scoprire
Figura 5.1 Togliendo gli uccelli dalle reti
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l’eventuale presenza del virus H5N1. Così come per l’influenza aviaria tale tecnica è utilizzata per altre malattie trasmissibili o per studi di genetica molecolare.
Nello studio descritto dalla presente tesi le piume sono state utilizzate per studiare il bioaccumulo di metalli e fare un confronto tra gli individui viventi nelle zone di discarica e gli individui viventi in una zona più distante quale quella dell’Oasi delle LIPU “Riserva del Chiarone”.
Esistono diverse tecniche di cattura a scopo di inanellamento. Alcune prevedono la cattura di pulcini direttamente al nido, altre prevedono la costruzione di gabbie con diversi meccanismi di chiusura; la tecnica di gran lunga più utilizzata è quella con le reti foschia (mist-nets). Le reti foschia sono delle grandi reti di nylon a sacche di altezze e lunghezze variabili, così come variabile è la dimensione della maglia. Vengono fissate al terreno tramite dei pali e tenute tese a mezz’aria. Data la sottigliezza della maglia, se vengono ubicate in posti adeguati (un po’ nascoste dalla vegetazione) le reti foschia risultano praticamente invisibili agli uccelli. L’uccello finisce nelle reti e lì resta intrappolato. Una volta impigliato comincia ad agitarsi avviluppandosi sempre di più. Per questo è importante che le reti vengano controllate molto spesso. Tra un giro di controllo ed un altro non deve mai trascorrere più di un’ora. Una volta liberato dalle reti l’uccello viene inanellato, gli vengono prese delle misure morfometriche e viene subito rilasciato.
Le reti utilizzate per questo studio sono reti specifiche per passeriformi. Sono reti lunghe 12 m, alte 2,4 m con quattro sacche di 60 cm l’una e con una maglia di 16 mm. La quantità di reti utilizzate varia da stazione a stazione a seconda dello spazio disponibile e della possibilità di piantare più o meno reti. Nella tabella seguente si illustra la quantità di reti montate per ogni area di studio.
Punto di campionamento Numero di transetti Reti per transetto Metri lineari di reti Superficie utile di cattura Oasi LIPU 5 10-5-5-5-5 360 m 864 m2 Pioppogatto 2 5-2 84 m 201,6 m2 Le Carbonaie 2 5-5 120 m 288 m2 Tabella 5.1 Transetti
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Gli uccelli che normalmente vengono catturati con queste reti vanno dalla dimensione di un regolo (il più piccolo uccello europeo, 7-9 cm di lunghezza totale) a quelle di un merlo (23-30 cm di lunghezza totale). Uccelli di dimensioni maggiori difficilmente restano impigliati in queste reti. Quando ciò accade spesso riescono a liberarsi o a rompere la rete. A dispetto di ciò, occasionalmente possono essere catturati anche uccelli più grandi fino alle dimensioni di un falco o di un airone.
Agli uccelli catturati è stato staccato un po’ di piumino sul petto e sul dorso e le due penne quinte secondarie. Secondo diversi studi (Hahn et al., 1993; Lounsbury-Billie et al., 2008; Meyer et al., 2009; Eagles-Smith et al., 2009; Kojadinovic et al., 2009) le piume sul petto e queste due penne non influiscono né sulla salute né sul volo dell’uccello al quale comunque rinasceranno in breve tempo.
Tutte le catture sono state catture passive. Ovvero non è stato posto nessun richiamo; né canti registrati né cibo. Le catture passive sono quelle ufficialmente riconosciute dall’Istituto Nazionale per la Protezione e per la Ricerca sull’Ambiente e sono le uniche che garantiscono un prelievo veramente casuale. Mettendo canti o cibo si corre il rischio di catturare uccelli provenienti da zone più lontane e attirati lì dal richiamo posto.
Dopo il prelievo le piume sono state accuratamente lavate con acqua corrente, poi lavate tre volte con acqua distillata e tre volte con acqua distillata superpura. Questa fase è molto importante: alcuni studi (Dauwe et al., 2002; Scheifler et al., 2006) dimostrano come la concentrazione di piombo in piume non lavate può essere tra 1,5 e 6 volte maggiore rispetto alle piume lavate.
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5.4 Metodo di analisi
L’analisi si può sostanzialmente dividere in due fasi. La fase di estrazione e la fase di analisi vera e propria. La fase di estrazione serve a portare tutti i metalli contenuti nel campione nella fase liquida utilizzata per l’estrazione. Tale processo viene eseguito con un attacco acido. La seconda fase poi è quella dell’analisi vera e propria da eseguire mediante Spettrometria ad Emissione Atomica al Plasma Accoppiato Induttivamente (ICP-OES).
Chiaramente la tecnica di estrazione varia in base agli elementi che si vogliono analizzare e la tecnica con cui si vogliono analizzare.
Gli elementi analizzati per questo studio sono: a) Rame b) Piombo c) Ferro d) Manganese e) Zinco f) Arsenico
In letteratura esistono diverse tecniche di estrazione. Per questo studio si è cercato di identificare la migliore tecnica possibile per le esigenze di estrazione.
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Esistono diverse tecniche di estrazione di metalli in soluzione liquida. Per essere efficienti le tecniche di estrazione devono digerire la matrice in modo che i composti che si vogliono analizzare arrivino in soluzione in complessi compatibili con lo strumento che si vuole utilizzare per l’analisi. In ogni caso la tecnica di digestione è fondamentale per l’accuratezza del risultato finale, soprattutto quando si lavora con concentrazioni estremamente basse come nel nostro caso.
Le tecniche universalmente accettate consistono in una digestione con acidi (uno o più) a caldo ed eventualmente in pressione. La digestione viene accelerata dall’utilizzo di un forno a microonde.
Le principali variabili che bisogna considerare per ottimizzare il metodo sono:
1) Il pretrattamento della matrice da analizzare. 2) L’acido o la miscela di acidi da utilizzare. 3) Il rapporto acido-campione.
4) L’utilizzo di contenitori aperti o chiusi, quindi la pressione di operazione. 5) Il tempo e l’intensità dell’energia fornita tramite microonde.
Pretrattamento.
Chiaramente il pretrattamento cambia a seconda della matrice da analizzare. Le variabili principali sono la presenza di tessuti organici o inorganici e l’abbondanza di acidi grassi che richiedono un pretrattamento particolare. Sia nel caso dei vegetali che nel caso delle piume di uccello la matrice del nostro campione è costituita da materia organica.
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Diversi studi (Sah & Miller, 1992; Krushevska et al., 1993; Matejovic & Durackova, 1994; Krachler et al., 1996; Jimenez de Blas et al., 1996; Gawalco et al., 1997; Sun et al., 1997; Prats Moya et al., 1997 tra gli altri) dimostrano l’importanza di una predigestione con acqua ossigenata (H2O2) che serve ad intaccare la parete cellulare delle cellule e accelera così la digestione vera e propria da fare con acido.
L’acqua ossigenata va lasciata agire con il campione per almeno un’ora.
Miscela acida
Dopo il pretrattamento con acqua ossigenata alcuni autori (Feindberg et al., 1993) digeriscono il campione con acido solforico (H2SO4). Altri (Sah & Miller, 1992;
Krachler et al., 1996; Garraud et al., 1996; Jimenez de Blas et al., 1996; Raven & Loppert, 1996 Nyomora et al., 1997) lo digeriscono con acido nitrico (HNO3). Altri
ancora (Lajunen & Piispanen, 1992; Mincey et al., 1992; Formento et al., 1994; Sun et al., 1997; Zhou et al., 1997) sempre dopo il pretrattamento con acqua ossigenata, utilizzano una miscela contenete acido nitrico (HNO3) ed acido cloridrico (HCl) con
l’aggiunta di acido fluoridrico (HF) per aumentarne il potere ossidante, cosa particolarmente utile quando si tratta di digerire dei sedimenti solidi.
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La maggior parte degli autori (Lajunen & Piispanen, 1992; Yamane & Koshino, 1992; Alonso et al., 1992; 1993; Quevauviller et al., 1993; Chakraborty et al., 1996; Barnes & Debrah, 1997) però concorda sull’utilizzo, per campioni organici, di una miscela 1:3 di acido nitrico (HNO3) ed acido cloridrico (HCl); sempre dopo aver eseguito un pretrattamento con acqua ossigenata. Questo è anche il metodo riconosciuto come ufficiale dall’US EPA (United States Environmental Protection Agency) (US EPA Method 3052; 1996).
Alcuni studi comparativi (Lajunen & Piispanen, 1992; Lamble & Hill, 1998) dimostrano come tale miscela sia la migliore sia su campioni vegetali che su piume di uccello. Questa è la miscela che è stata utilizzata in questo studio.
Dato che i metalli da analizzare sono presenti in concentrazioni molto basse è importantissima la purezza degli acidi utilizzati. Per questo sono stati utilizzati degli acidi superpuri (Carlo Erba Reagenti).
Rapporto acido/campione
Un parametro importante è anche il rapporto tra la quantità di acido e la quantità di campione. L’acido deve essere in quantità tale da dissolvere tutto il campione ma non deve essere troppo da diluire oltremisura i metalli che sono contenuti in tracce. La US EPA sostiene che il rapporto campione/acido debba essere compreso in un intervallo abbastanza ampio che va da 1/250 a 1/10.
Per quanto riguarda i vegetali, avendo a disposizione una grande quantità di campione si è rimasti nella fascia più alta di tale rapporto. Per quanto riguarda le piume di uccello uccelli è stata utilizzata la quantità di piume che si aveva a
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disposizione (chiaramente variabile da uccello a uccello) e quindi il rapporto era più prossimo al rapporto inferiore, quello di 1/250. Nella fattispecie sono stati utilizzati 2 ml di acqua ossigenata e 8 ml di una miscela 3:1 di acido cloridrico e nitrico. Questo per una quantità di campione tra 750 e 850 mg nei vegetali e tra i 30 e i 150 mg nelle piume degli uccelli.
Pressione di lavoro
L’estrazione acida può avvenire in contenitori aperti, quindi a pressione atmosferica, e in contenitori chiusi, ovvero sotto pressione. I contenitori in pressione hanno il vantaggio di non perdere gli elementi volatili, cosa che può invece avvenire nei contenitori a pressione atmosferica. I contenitori a pressione atmosferica, per contro, hanno il vantaggio di avere una diffusione più diretta del calore (Lamble & Hill, 1998).
Per verificare quale metodo sia il migliore nel nostro caso abbiamo eseguito una prova di screening sulle radici di cannuccia di palude. I risultati sono dati nella tabella sottostante.
Campione e metodo Metallo [ug/g] Campione e metodo Metallo [ug/g] Rapporto
Radici Oasi Aperto Cr 8,0E-02 Radici Oasi Chiuso Cr 8,7E-02 0,924 Radici Oasi Aperto Mn 4,0E+01 Radici Oasi Chiuso Mn 4,0E+01 1,009 Radici Oasi Aperto Fe 1,3E+01 Radici Oasi Chiuso Fe 1,2E+01 1,106 Radici Oasi Aperto Ni 1,9E-01 Radici Oasi Chiuso Ni 1,7E-01 1,078 Radici Oasi Aperto Cu 1,9E+00 Radici Oasi Chiuso Cu 2,2E+00 0,857 Radici Oasi Aperto Zn 3,5E+01 Radici Oasi Chiuso Zn 3,4E+01 1,023 Figura 5.7 I contenitori a pressione atmosferica col tubo per il recupero
74 Tabella 5.2 Confronto tra reazione “in pressione” e a pressione atmosferica
Come si può notare dalla tabella i rapporti tra contenitore chiuso e contenitore aperto sono molto vicini a uno. In particolare si ha un rapporto che va da 0,847 a 1,150; con una media di 0,994 e una deviazione standard di 0,08. Tali valori ci indicano che nel caso in analisi contenitori aperti o chiusi danno gli stessi risultati, probabilmente per via del fatto che vengono analizzati tutti metalli non volatili con
Campione e metodo Metallo [ug/g] Campione e metodo Metallo [ug/g] Rapporto
Radici Oasi Aperto Cd 4,7E-02 Radici Oasi Chiuso Cd 4,7E-02 1,000 Radici Oasi Aperto Pb 2,7E-01 Radici Oasi Chiuso Pb 2,3E-01 1,150 Radici Oasi Aperto Sn 0,0E+00 Radici Oasi Chiuso Sn 0,0E+00 Radici Oasi Aperto As 1,3E-01 Radici Oasi Chiuso As 1,5E-01 0,869
Radici Carbonaie Aperto Cr 9,4E-01 Radici Carbonaie Chiuso Cr 1,1E+00 0,847 Radici Carbonaie Aperto Mn 1,4E+02 Radici Carbonaie Chiuso Mn 1,4E+02 1,025 Radici Carbonaie Aperto Fe 6,3E+02 Radici Carbonaie Chiuso Fe 6,5E+02 0,970 Radici Carbonaie Aperto Ni 9,6E-01 Radici Carbonaie Chiuso Ni 1,0E+00 0,952 Radici Carbonaie Aperto Cu 8,2E+00 Radici Carbonaie Chiuso Cu 8,5E+00 0,970 Radici Carbonaie Aperto Zn 7,9E+01 Radici Carbonaie Chiuso Zn 7,9E+01 1,003 Radici Carbonaie Aperto Cd 9,6E-02 Radici Carbonaie Chiuso Cd 1,0E-01 0,952 Radici Carbonaie Aperto Pb 2,8E+00 Radici Carbonaie Chiuso Pb 3,2E+00 0,856 Radici Carbonaie Aperto Sn 3,2E-01 Radici Carbonaie Chiuso Sn 3,0E-01 1,044 Radici Carbonaie Aperto As 6,1E-01 Radici Carbonaie Chiuso As 7,2E-01 0,851
Radici Pioppogatto Aperto Cr 1,8E+00 Radici Pioppogatto Chiuso Cr 1,6E+00 1,075 Radici Pioppogatto Aperto Mn 3,9E+02 Radici Pioppogatto Chiuso Mn 3,7E+02 1,046 Radici Pioppogatto Aperto Fe 4,9E+02 Radici Pioppogatto Chiuso Fe 4,9E+02 1,015 Radici Pioppogatto Aperto Ni 2,7E+00 Radici Pioppogatto Chiuso Ni 2,7E+00 1,018 Radici Pioppogatto Aperto Cu 6,4E+00 Radici Pioppogatto Chiuso Cu 6,4E+00 1,008 Radici Pioppogatto Aperto Zn 2,6E+01 Radici Pioppogatto Chiuso Zn 2,4E+01 1,079 Radici Pioppogatto Aperto Cd 1,1E-01 Radici Pioppogatto Chiuso Cd 1,0E-01 1,084 Radici Pioppogatto Aperto Pb 6,8E+00 Radici Pioppogatto Chiuso Pb 6,7E+00 1,016 Radici Pioppogatto Aperto Sn 4,1E-01 Radici Pioppogatto Chiuso Sn 4,1E-01 0,997 Radici Pioppogatto Aperto As 9,3E-01 Radici Pioppogatto Chiuso As 9,2E-01 1,008
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l’eccezione dell’arsenico che però non sembra dare valori differenti tra estrazione in pressione o no. Inoltre nelle analisi finali l’arsenico è stato analizzato solo a livello qualitativo.
Alla luce del fatto che non c’è una sostanziale differenza tra estrazione in pressione e estrazione a pressione atmosferica sono stati utilizzati contenitori aperti che hanno una capienza maggiore e sono meno pericolosi (i contenitori chiusi possono raggiungere pressioni molto elevate e talvolta esplodere).
I contenitori utilizzati sono di teflon, dotati di un tappo a vite da cui sporge una cannuccia per consentire lo spurgo dei vapori che si formano a seguito del riscaldamento della soluzione disgregante. Questi contenitori vengono comunemente chiamati bombe.
Tempo e potenza
Anche per quanto riguarda il tempo e la potenza delle microonde in letteratura ci sono valori molto diversi tra loro.
Per esempio Jimenez de Blas (1996) fa reagire il campione per 25 minuti, Garraud e collaboratori (1996) lo digeriscono per 37 minuti. Krachler e collaboratori (1996) fanno una digestione di 45 minuti, Barnes & Debrah (1997) ne fanno una di 74 minuti.
Lamble & Hill (1998) elencano undici diversi tempi e potenze per le estrazioni a pressione atmosferica. Inoltre il tempo e la potenza dipendono anche dall’eventuale predigestione, dalla quantità di campione, dalla quantità di campioni che si processano nello stesso microonde e dal microonde stesso. La stessa US EPA non prevede un tempo e una potenza standard ma piuttosto dei limiti di temperatura in base al materiale e al microonde utilizzato (US EPA Method 3052; 1996).
Per ottenere il metodo migliore nel caso in analisi sono state eseguite diverse prove. Mantenendo fissa la predigestione con acqua ossigenata e la miscela di acidi (3:1 di acido cloridrico e nitrico) sono state fatte sette prove con tempi e potenze differenti sulla cannuccia di palude.
76 1) 10’ 260 W; 10’ 487,5 W; 10’ 650 W; 5’ 260 W 2) 10’ 260 W; 20’ 487,5 W; 5’ 260 W 3) 10’ 260 W; 20’ 487,5 W; 10’ 260 W 4) 30’ 195 W in pressione 5) 20’ 65 W; 60’ 130 W 6) 10’ 65 W; 60’ 130 W; 15’ 227,5 W 7) 10’ 97,5 W; 60’ 130 W; 10’ 260 W
La decisione sul metodo più efficiente si è basata su un ragionamento molto semplice. I metalli non possono aumentare da soli all’interno della bomba di reazione. Quindi la tecnica che ha dato i risultati più alti è senza dubbio quella che ha un’estrazione più efficiente.
Sono state quindi eseguite diverse estrazioni sulla cannuccia di palude e su alcune piume di uccello con le sette tecniche elencate. Sono state fatte delle analisi di screening ed è stata scelta la tecnica che ha dato i risultati più alti e che, quindi, consente un’estrazione migliore.
La tecnica che è risultata la più efficiente è la tecnica numero 7 che consiste in 10 minuti a 97,5 Watt di potenza, 60 minuti a 130 Watt di potenza e infine 10 minuti a 260 Watt di potenza.
In sostanza il metodo di estrazione da utilizzato per questo lavoro si può riassumere così:
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1) Lavare il campione accuratamente, poi eseguire tre bagni di lavaggio con acqua deionizzata e tre bagni di lavaggio con acqua deionizzata superpura. 2) Seccare in stufa a 105 °C per 12 ore.
3) Tritare finemente i campioni vegetali. Le piume non necessitano di questo trattamento data la loro sottigliezza.
4) Pesare il campione con una bilancia di massima precisione già all’interno di una bomba di teflon accuratamente lavata.
5) Trattare il campione con 2 ml di acqua ossigenata (H2O2) al 30% in volume e
lasciarla agire per almeno un’ora.
6) Trattare il campione con 8 ml di una miscela 3:1 di acido cloridrico (HCl) e acido nitrico (HNO3). In questa fase bisogna lavorare sotto cappa e stare
molto attenti perché si sviluppano gas pericolosi come il diossido di azoto (NO2), tossico ed irritante.
7) Chiudere le bombe, metterle in microonde e sottoporle a un ciclo di 10 minuti a 97,5 Watt, 60 minuti a 130 Watt e infine 10 minuti a 260 Watt di potenza.
8) Finito il ciclo in microonde il liquido rimasto va filtrato e portato al volume di 25 ml per aggiunta di acqua deionizzata superpura.
9) Per ogni procedimento in microonde va fatto anche un bianco. Ovvero in una bomba vuota va eseguito tutto il trattamento come descritto ma senza campione. Il risultato ottenuto nel bianco indicherà le impurezze. Questo valore verrà poi sottratto al risultato delle reazioni vere e proprie in modo da ridurre il più possibile il “rumore di fondo”.
10) I campioni, ed il bianco, sono pronti per essere analizzati con la Spettrometria ad Emissione Atomica al Plasma Accoppiato Induttivamente (ICP-OES).
Importantissimo poi, soprattutto quando si lavora con elementi in tracce, è lavorare con strumenti sempre rigorosamente puliti. La parte sensibile del processo di
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estrazione è quella dell’estrazione vera e propria e quindi il lavaggio delle bombe di reazione.
Il lavaggio si può riassumere nei seguenti punti:
1) Subito dopo l’utilizzo le bombe vanno lavate con abbondante acqua calda e sapone.
2) Risciacquare abbondantemente con acqua distillata.
3) Riempire con acqua ossigenata al 30% in volume e lasciare agire per almeno 12 ore.
4) Passare in microonde con un ciclo di 60’ a 195 Watt di potenza con la stessa acqua ossigenata.
5) Risciacquare abbondantemente con acqua distillata.
6) Riempire con acido cloridrico 1:10 e lasciare agire per almeno 12 ore.
7) Passare in microonde con un ciclo di 60’ a 195 Watt di potenza con la stesso acido.
8) Risciacquare abbondantemente con acqua distillata. 9) Risciacquare con acqua distillata superpura.
10) Seccare in forno a 105 °C per un paio di ore.
5.6 L’analisi dei metalli pesanti
L’analisi dei metalli pesanti è stata condotta mediante Spettrometria di Emissione Atomica al Plasma Accoppiato Induttivamente (ICP-OES).
Lo Spettrometro di Emissione al Plasma è uno strumento che sfrutta un gas elettricamente neutro, ma fortemente ionizzato con un numero di elettroni e di ioni uguale così da essere un ottimo conduttore elettrico. Questo gas è chiamato plasma e viene prodotto usando un flusso di Argon per ottenere ioni Ar+ ed elettroni liberi. Tale tecnica analitica si basa sulla misura dell’emissione atomica di ioni dell’analita di interesse, attraverso l’impiego di una sorgente al plasma, originato da Argon ionizzato da una scarica elettrica e accelerato da un campo magnetico (generatore a
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radiofrequenza). Per mezzo di una camera di nebulizzazione il campione sottoforma di aerosol viene trasportato dal flusso di argon al centro del plasma, dove incontra temperature elevate, dell’ordine di 8.000-10.000 °K. L’energia fornita dal plasma è sufficientemente elevata da garantire la vaporizzazione, l’atomizzazione e la ionizzazione degli atomi del campione di interesse. Un opportuno sistema ottico permette di raccogliere la radiazione emessa dal plasma a determinate lunghezze d’onda e di dirigerla verso il sistema di acquisizione. In quest’ultimo viene misurata l’emissione mediante un rilevatore ottico, il fotomoltiplicatore, che la registra in base ad una specifica lunghezza d’onda impostata dall’operatore e che dipende dall’analita in esame.
Mediante l’utilizzo di standard a concentrazione nota è possibile risalire al contenuto di metalli pesanti nei campioni in esame. Naturalmente, l’intensità dell’emissione di uno specifico elemento è proporzionale alla sua concentrazione presente all’interno del plasma. La superiore accuratezza e precisione del plasma rispetto alle camere di combustione risiede nel fatto che esso di riduce alcuni tipi di interferenze comuni in Assorbimento Atomico ed ha migliori limiti di rilevabilità. I principali passaggi nell’analisi con il metodo dell’ICP sono:
1) Selezionare gli elementi da analizzare.
2) Preparare le soluzioni dei campioni come descritto precedentemente.
3) Preparare una serie di soluzioni di calibrazione dette standard che contengano concentrazioni note dei metalli che si vogliono analizzare; in un range opportuno di concentrazione a seconda degli elementi.
4) Importantissimo è rispettare la matrice che deve essere uguale tra campione e standard, quindi in questo caso è importante acidificare anche gli standard. 5) Le soluzioni standard e i campioni vengono vaporizzati sul plasma
registrando così le intensità delle linee di emissione appropriate.
6) Si costruiscono grafici di calibrazione per ogni elemento dalle intensità di emissione delle soluzioni standard.
7) Le concentrazioni degli elementi in ogni campione vengono determinate dai grafici di calibrazione.
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I passaggi dal 5 al 7 vengono eseguiti automaticamente dallo strumento.
I limiti di detezione, di rivelabilità e di riproducibilità dello strumento sono:
Parametro Limite di rivelabilità ug/l* Limite di detezione in ug/l Riproducibilità Rame 1 0,4 <1% Piombo 5 1 <1% Ferro 10 0,1 <1% Manganese 10 0,1 <1% Zinco 1 0,2 <1% Arsenico 1 0,03 <1%
* Varia a seconda della matrice del campione
Per limite di detezione si intende il limite misurabile dallo strumento in un campione puro e privo del rumore di fondo, e viene calcolato come la media di dieci misurazioni per il triplo della deviazione standard. Mentre per indice di rivelabilità si intende il limite misurabile in un campione con il normale rumore di fondo e viene calcolato come la media di dieci misurazioni per dieci volte la deviazione standard (vedi immagine a lato).
Per riproducibilità invece si intende la probabilità che due misurazioni successive, eseguite da due operatori diversi, diano dei risultati significativamente diversi.
Tabella 5.3 Limiti dello strumento
