I miRNA sono processati da Dicer, un’endonucleasi specifica per RNA a doppio filamento, che converte un RNA precursore inattivo di ~ 70 nucleotidi in una molecola funzionale di ~ 21 nucleotidi.

RIASSUNTO

I microRNA (miRNA) codificano per piccoli RNA a singolo filamento di 21 nucleotidi che, nei vertebrati, funzionano come inibitori dell’espressione genica appaiandosi con il 3’-UTR dell’mRNA bersaglio, andando a comporre il complesso RISC (RNA-induced silencing complexe). Sono stati identificati pi di 400 miRNA sia nell’uomo che nel topo, ognuno dei quali è in grado di regolare centinaia di geni target.

E’ stato proposto che l’espressione di più di un terzo di tutti i geni umani possa essere regolata dai miRNA. La maggior parte dei miRNA che possono essere rilevati sperimentalmente è espressa nel cervello e, tra quelli di essi espressi con un pattern tessuto-specifico, la metà sono sono maggiormente espressi nel cervello.

I miRNA sono processati da Dicer, un’endonucleasi specifica per RNA a doppio filamento, che converte un RNA precursore inattivo di ~ 70 nucleotidi in una molecola funzionale di ~ 21 nucleotidi.

Lo sviluppo di terapie per le degenerazioni retiniche ereditarie si affida su una migliore comprensione della biologia cellulare di questa eterogenea famiglia di malattie.

In particolare, è importante studiare le alterazioni presenti nella retina di varie linee di topo transgeniche, knock-out e mutanti spontanei, che riproducono vari tipi di degenerazioni retiniche.

Il primo scopo di questo progetto è caratterizzare il fenotipo retinico di topi knock-out per Dicer, il gene che codifica per l’enzima chiave della sintesi dei microRNA (miRNA). Il nostro obbiettivo principale è quello di verificare l’potesi che i microRNA possano costituire una nuova classe di geni-malattia.

I topi knock-out per Dicer muoiono a stadio embrionale 7.5 (11), quindi risulta impossibile studiare il ruolo di Dicer in stadi successivi di sviluppo o nei tessuti adulti.

Per superare questo problema , è stato recentemente generato un allele condizionale di Dicer fiancheggiato da due siti “flox”. Usando questo allele in combinazione con alleli cre tessuto-specifici, è possibile inattivare Dicer in molti tessuti (12; 13). Poiché è necessario per il processamento dei miRNA, la sua rimozione ha come conseguenza una significativa diminuzione dei miRNA maturi.

Il topo knock-out condizionale (CKO) retina-specifico che abbiamo studiato è il primo esempio di inattivazione di miRNA in un’area del Sistema Nervoso Centrale di

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mammifero: è stato dimostrato che questa manipolazione genetica porta ad una stratificazione aberrante della retina che può culminare in un’estesa degenerazione retinica.

Sezioni di retina da topi wild type e knock-out condizionale dell’età di P16, P30, P45 e 3, 4, 5 e 7 mesi sono state processate per l’immunoistochimica per anticorpi cellula specifici.

In aggiunta, le retine sono state processate per Northern blot e per ibridazione in situ su sonde specifiche per l’esone 23 di Dicer, deleto nel CKO, e per microRNA retina specifici.

Tramite questi due approcci, è stato possibile confermare l’effettivo abbassamento dei microRNA nei mutanti condizionali.

Come dimostrato in precedenza (14), l’allele transgenico Chx10Cre non presenta l’espressione della ricombinasi cre in tutte le cellule della retina; quindi, non in tutte le cellule delle retine dei topi CKO è assente la proteina Dicer funzionale. Abbiamo fatto esperimenti di ibridazione in situ su sezioni retiniche con sonde specifiche per l’esone fiancheggiato da siti “flox” nell’allele condizionale di Dicer (13). Abbiamo messo in evidenza che il gene Dicer è espresso nella maggior parte delle cellule retiniche degli animali wild-type, mentre nelle retine dei topi CKO l’espressione di Dicer è irregolare, con gruppi di cellule marcate vicino a cellule non marcate (Fig. 1).

L’analisi effettuata mediante Northern blot e ibridazione in situ ha confermato che nelle retine dei topi CKO per Dicer i miRNA maturi sono assenti (miR-183, miR- 124a, e miR-96).

Lo sviluppo dello retine dei topi CKO per Dicer è approssimativamente normale. A stadio postnatale 16 (P16) sono presenti tutti i tipi cellulari analizzati.

Tuttavia, tutte le retine esaminate presentano rosette, strutture circolari in cui i fotorecettori sono orientati verso il lume interno. Le rosette sono state precedentemente identificate nel retinoblastoma, nella retinopatia diabetica e nella retinite pigmentosa in associazione a degenerazione della retina e/o a proliferazione anomala. Tuttavia, la marcatura per la BrdU e per il fosfoistone H3 (un marcatore della proliferazione cellulare) non ha messo in evidenza la presenza di cellule in divisione nelle retine dei topi CKO per Dicer. Quindi, la formazione delle rosette non è causata da un aumento della proliferazione delle cellule retiniche.

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A stadio P16, le rosette sono sparse su tutta la superficie della retina e sono composte principalmente da fotorecettori e dalle loro terminazioni sinaptiche.

Il periodo di tempo che va da stadio P16 a stadio P45 è caratterizzato da una progressiva alterazione e dal rimodellamento della struttura laminare della retina: il numero di rosette aumenta e la loro struttura diventa più complessa, con la migrazione dei neuroni di secondo ordine nello strato nucleare esterno.

A 3 mesi, le dimensioni delle rosette diminuiscono e in alcuni casi queste scompaiono. I fotorecettori che compongono le rosette degenerano e lo strato nucleare esterno diventa progressivamente più sottile. Coloranti in grado di legarsi al DNA hanno consentito di rilevare la presenza di nuclei picnotici nella retina interna ed esterna. Contemporaneamente, le cellule di Müller diventano ipertrofiche: le dimensioni dei processi radiali e la reattività alla GFAP aumentano, mettendo in evidenza una generalizzata attivazione della glia. Simultaneamente, il numero di cellule che esprimono la ricombinasi Cre diminuisce, probabilmente perché la maggior parte di queste cellule, in cui Dicer è assente, degenera. Le cellule bipolari dei bastoncelli che sopravvivono spesso sono raggruppate e presentano una morfologia alterata con arborizzazioni assonali ipertrofiche. La gran parte delle cellule bipolari dei bastoncelli rimanenti non esprimono la ricombinasi Cre e quindi molto probabilmente si originano dai precursori in cui Dicer non è inattivato. In questo studio abbiamo usato il topo condizionale per Dicer in combinazione con la linea transgenica Chx10Cre, producendo un knock-out per Dicer specifico per la retina (topo CKO) e in questo modello abbiamo valutato il ruolo della regolazione genica mediata dai miRNA nella retina in via di sviluppo e adulta.

Anche se la il fenotipo osservat nei mutanti Dicer non corrisponde precisamente a nessuna malattia degenerativa nota della retina, molti parallelismi possono essere osservati. Per esempio, i fotorecettori sono i neuroni ad essere colpiti per rimi e di più, mentre i neuroni della retina interna, come le cellule gangliari, sembrano essere preservate.

L’inattivazione di Dicer causa una diminuzione dei miRNA espressi nella retina.

Gli animali CKO per Dicer presentano un pattern specifico di progressiva degenerazione e disorganizzazione retinica. Le anomalie retiniche sono diffuse e l’effetto più impressionante è rappresentato dalla perdita dell’organizzazione laminare

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retinica. Questi risultati costituiscono il primo passo attraverso cui identificare il ruolo dei miRNA nel mantenimento della sopravvivenza e della funzionalità retinica. Inoltre, i dati riportati forniscono un’ipotesi sul meccanismo molecolare di degenerazione retinica e sul mantenimento della normale funzionalità ed architettura della retina e suggeriscono che i miRNA possano rappresentare geni candidati di malattie.

Tra queste, la Retinite Pigmentosa (RP) è una famiglia di malattie ereditarie che induce la morte dei fotorecettori, rappresenta una delle maggiori cause di cecità nel mondo.

Tra le strategie terapeutiche usate per trattare le degenerazioni retiniche in corso di studio, l’invenzione e l’impianto di protesi elettroniche ha raggiunto lo stadio di trial clinico. Le cellule gangliari retiniche (retinal ganglion cells, RGC) rappresentano il substrato biologico stimolato dalle protesi epiretiniche per ripristinare la visione nella retinite pigmentosa; quindi, l’efficacia di questi impianti elettronici dipende dalla vitalità delle cellule gangliari retiniche. Per queste ragioni, abbiamo concentrato la nostra attenzione sulla morfologia e sulla sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche nella linea di topo rd1, un modello affidabile per lo studio della retinite pigmentosa autosomica recessiva, a vari stadi dall’inizio della morte dei fotorecettori.

Nei topi mutanti rd1 di un anno di età lo strato delle cellule gangliari (GCL) a prima vista presenta chiari segni di riorganizzazione. I corpi cellulari sono distribuiti in modo irregolare, con aree vuote che probabilmente sono la conseguenza della degenerazione neuronale. Spesso le cellule organizzate a formare domini circolari che assomigliano allo stadio iniziale della formazione delle rosette. Inoltre, in un numero considerevole di cellule è presente la condensazione della cromatina.

La conta di un elevato numero di cellule nei topi rd1 di un anno di età ha messo in evidenza un’eccellente sopravvivenza di queste cellule nello strato delle cellule gangliari (94.6%). Tuttavia in queste retine è stato osservato un drammatico aumento del numero di nuclei condensati (+ 85%) rispetto agli animali di 4.5 mesi di età sottoposti all’analisi.

Nel nostro laboratorio è stata ottenuta una linea transgenica di topi nei quali osse presente sia un allele per la degenerazione retinica (rd1) che l’espressione della GFP in un basso numero di gangliari, in modo da poterne studiare la morfologia fine degli alberi dendritici.

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In questo modo, incrociando due linee murine preesistenti, è stato generato il topo rd1 /Thy-1-GFP-M.

Nel nuovo ceppo rd1/Thy-1 GFP sono presenti poche cellule gangliari retiniche marcate con la GFP, rispetto al founder wild-type., molto probabilmente come conseguenza del fatto che questi topi, a fifferenza del founder, sono eterozigoti per l’allele GFP. I nostri studi suggeriscono che le cellule gangliari retiniche vanno incontro alla diminuzione delle dimensioni del corpo cellulare e alla ritrazione dell’albero dendritico. Questo dato è molto simile al rimodellamento regressivo descritto precedentemente per le cellule bipolari dei topi mutanti rd1, che è la conseguenza della morte dei fotorecettori. Comunque, misurando le dimensioni dell’albero dendritico delle cellule gangliari di topi giovani, abbiamo messo in evidenza che le cellule gangliari appena differenziate dei mutanti rd1 presentano già alberi dendritici più piccoli. Noi pensiamo che, più che andare incontro a rimodellamento, le cellule gangliari di questi topi mutanti presentino difetti nella crescita postnatale e nel differenziamento terminale.

A livello cellulare, lo studio di singole cellule gangliari della retina nel modello di degenerazione retinica rd1 suggerisce che, anche se l’organizzazione laminare e la sopravvivenza sono mantenute, possono essere colpite le singole cellule.

Apparentemente lo sviluppo postnatale degli alberi dendritici delle cellule gangliari retiniche è influenzato dalla degenerazione dei fotorecettori, anche se la mutazione principale che causa la malattia è nei bastoncelli. La nuova linea di topo rd1/Thy-1 GFP è particolarmente adatta a rilevare il rimodellamento a livello di singole cellule. Questo rimodellamento potrebbe essere importante nel caso in cui si vogliano mettere a punto strumenti terapeutici basati sulla vitalità delle cellule gangliari. Ad esempio, il funzionamento delle protesi elettroniche è profondamente influenzato dalla soglia di stimolazione, dalla capacitanza della membrana e dalla geometria complessiva delle cellule gangliari.

Complessivamente, i risultati di questi due progetti fanno luce su diversi esempi di plasticità e rimodellamento delle cellule retiniche durante lo sviluppo postnatale e durante la vita adulta.

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